Artículo de método

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

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DOI:

10.3791/51744

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3 de febrero de 2015

 , 
1U.S. EPA

En este artículo

Resumen

Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.

Resumen

La concentración de virus a pequeña escala (volúmenes de muestra de 1 a 10 L, aquí simulada con muestras de agua enriquecidas de 100 ml) es una forma eficiente y rentable de identificar los parámetros óptimos para la concentración de virus. Los virus pueden concentrarse a partir de agua mediante filtración (electropositiva, electronegativa, lana de vidrio o exclusión de tamaño), seguida de una concentración secundaria con extracto de carne de vacuno para liberar los virus de las superficies del filtro y, por último, una concentración terciaria que da como resultado un concentrado de virus de 5-30 ml de volumen. Con el fin de identificar los procedimientos de concentración óptima, se evaluaron dos filtros electropositivos diferentes (un filtro de vidrio/celulosa [1MDS] y un filtro de nano-alúmina/vidrio [NanoCeram]), así como diferentes técnicas de concentración secundaria; La técnica de Celita donde se evaluaron tres tamaños de partícula de Celita diferentes (fina, mediana y grande) siguió comparando esta técnica con la del método de floculación orgánica establecido. También se evaluaron varios aditivos de elución por su capacidad para mejorar la liberación de partículas de adenovirus (AdV) de las superficies de los filtros. La élite de partículas finas recuperó niveles de AdV40 y 41 similares a los del método de floculación orgánica establecido cuando se agregaron picos virales durante la concentración secundaria. El filtro de vidrio/celulosa recuperó niveles más altos de AdV40 y 41, en comparación con los de un filtro de nano-alúmina/fibra de vidrio. Aunque no fue estadísticamente significativo, la adición de un eluyente de extracto de carne de vacuno modificado con polifosfato de sodio al 0,1% recuperó un 10% más de partículas de AdV en comparación con el extracto de carne de vacuno no modificado.

Introducción

Virus entéricos humanos son agentes causantes importantes de enfermedades de origen hídrico 1-3, pero generalmente están presentes en números bajos en aguas ambientales contaminadas, por lo que su detección difícil sin concentración. Los procedimientos utilizados para concentrar virus incluyen típicamente una etapa de filtración, seguido de elución de filtro, y la concentración secundaria del eluato filtro. Un procedimiento de filtración común se basa en la utilización de membranas cargadas tales como filtros electropositivos (recientemente revisado en 4,5). Estos filtros se basan en la captura de los virus en suspensión en el agua utilizando interacciones electrostáticas entre la superficie del filtro (con carga positiva) y partículas de virus específicos (con carga negativa). Dos filtros electropositivos que están disponibles comercialmente se basan en esta tecnología, los filtros de vidrio / celulosa y fibra nano-alúmina / vidrio. Los costes de filtro de vidrio / celulosa son hasta 10 veces mayor que la de la fibra nano-alúmina / vidrio, que limitan el uso del vidrio / cefiltros llulose para la vigilancia del virus de rutina. Estudios recientes han concluido diferencias son nominales entre estos dos filtros en la recuperación de los enterovirus desde 6,7 del agua ambiente, lo que justifica el uso de una alternativa de filtro más barato. Otras opciones de filtro, como los filtros electronegativos y de lana de vidrio se han estudiado, sin embargo, o bien requieren el tratamiento previo de las fuentes de agua (filtros electronegativos) o no están disponibles en el mercado (filtros de lana de vidrio). El desarrollo de procedimientos de concentración de virus se ha centrado principalmente en la optimización de las técnicas de concentración primaria (filtros) con el fin de mejorar la recuperación de virus de agua. Sin embargo, los procedimientos de concentración secundarios, que reducen el volumen de eluyente típicamente de 1 L a mililitro volúmenes, también pueden tener un impacto significativo en las recuperaciones de virus 8.

Concentración secundaria de virus entéricos típicamente se basa en un agente floculante, tales como algunos tipos de extracto de carne (floccu orgánicamento) o floculación de la leche desnatada 9-12 para eliminar las partículas de virus de las superficies del filtro. Recientemente, otro procedimiento de concentración secundaria utilizando extracto de carne junto con la adición de celita (partículas finas) ha mostrado ser prometedor para la recuperación de adenovirus, enterovirus y norovirus 8,13,14. Obras de concentración Celite bajo principios similares a la del método de floculación orgánica en que las partículas de virus se unen a y se liberan de partículas (floc o de celite) alterando el pH de la solución en suspensión. Las comparaciones entre estas dos técnicas de concentración secundarias han sido evaluadas en la recuperación de adenovirus (ADV) de pinchos tipos 40 y 41 8. Este estudio concluyó que las dos técnicas de concentración secundarias fueron estadísticamente similares en la recuperación de adenovirus. Sin embargo, el método de floculación orgánica requiere una 30 min. de incubación a pH 3,5, mientras que la técnica de celite requiere una incubación más corto (10 min) a pH 4,0. El flocculat orgánicaion también requiere el uso de equipo de laboratorio caro (centrifugadoras) para recoger las partículas de flóculos durante la concentración terciaria, la técnica de celite en contraste utiliza sólo el equipo de laboratorio básico (filtración a vacío) para separar partículas de Celite de la suspensión.

Ciertas combinaciones de filtros y técnicas de elución secundarias también pueden afectar a las recuperaciones de virus. Un estudio concluyó que ciertas combinaciones de (filtros electropositivos) primarias y secundarias técnicas de concentración (Celite o floculación orgánica) tuvieron un impacto significativo de la recuperación del adenovirus 13. Estos hallazgos sugieren que se requiere la optimización a fin de recuperar de manera óptima virus diana a partir de una matriz de agua dado al utilizar estas técnicas. La optimización es una pérdida de tiempo y arduo proceso de muchos investigadores evitan activamente desde numerosas variables serán evaluados (tipo de filtro / marca, solución de elución de pH, celita / floculación orgánica).

Para este study, se desarrolló un procedimiento para identificar las condiciones óptimas para la concentración de virus a partir de agua usando cepas de adenovirus humano de púas 40 y 41. Presumiblemente, ya que cada tipo virus muestra una morfología de la cápside único y carga específica de la cápside, pueden necesitar ser optimizado para cada virus protocolos de concentración apuntar a fin de alcanzar la recuperación viral óptima. Este estudio proporciona un enfoque para AdV 40 y 41 de concentración por: 1) la evaluación de la recuperación de virus en el agua del grifo, usando discos de filtro electropositivos seguido por 2) evaluación de un método de floculación orgánica establecido frente a la técnica de celite como una concentración secundaria, y 3) evaluación de tampones de elución para la concentración terciaria.

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Protocolo

1. Preparación de Cristalería y alojamientos de los filtros

  1. A menos que se indique lo contrario, esterilizar todos los artículos de vidrio, soportes y soluciones de filtrado a 121 ° C durante 15 minutos. Para asegurar la esterilidad, cubrir todas las aberturas o las superficies expuestas, ya sea con papel de aluminio o papel cinta asegurado antes de la esterilización.
  2. Montar aparato de filtración uniendo carcasa del filtro (47 mm de diámetro) a 1 L matraz Erlenmeyer de brazo lateral. Recoger filtros necesarios: filtros de disco electropositivos / electronegativo 47 mm de diámetro.
  3. Preparar 1 L de extracto de carne 1,5% (floculación, produce partículas de flóculo cuando el pH de la solución se redujo a 3,5, o no floculante, lo que no hace agregada a pH 3,5), con 0,05 M de glicina, disolviendo 15 g de extracto de carne de vacuno en 1 L de agua desionizada y la adición de 3,75 g de glicina.
    NOTA: extractos de carne no floculantes requerirán la adición de celita antes de la concentración terciaria.
  4. Añadir elución polyph sodio aditivoosphate al extracto de carne de vacuno en una concentración de 0,1%.
  5. Añadir una solución de ácido clorhídrico 1 M, gota a gota, a la mezcla de extracto de carne, solución de pH a pH deseado. Extracto de carne Autoclave durante 15-30 minutos a 121 ° C.
  6. Mide 0,1 g de fino, medio, o celita partícula grande (para usar con sólo el extracto de carne no floculantes).
  7. Preparar vacío / aspiración uniendo tubos compatible con erlenmeyer brazo lateral ya la toma de vacío.

2. Preparación de Soluciones y virus Stock

  1. Preparar 1 L de HCl 1 M.
  2. Preparar 1 l de 1 M NaOH.
  3. Prepare la solución de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM K 2 PO 4 y 4,3 mM NaH 2 PO 4).
    1. Ajustar el pH de 1x PBS a 9,0 utilizando 1 M NaOH.
  4. Preparar y diluir de virus a 10 4 -10 5 número más probable (NMP) ml -1 mezclando 1 ml de virus de reserva con 9 ml de PBS (pH7), como se describió previamente 8,13. Conservar a -80 ° C en alícuotas de 1 ml.
    1. Esterilizar virus de stock de filtrado jeringa (0,22 m de tamaño de poro) para eliminar los contaminantes potenciales.
  5. Sin cloro del agua corriente
    1. Medida 1 L de agua del grifo estéril usando un cilindro graduado estéril y verter en un vaso de precipitados de 2 l que contenía una barra de agitación magnética.
    2. Añadir 0,7 g de tiosulfato de sodio y mezclar hasta que se disuelven los gránulos. Ajustar el pH del agua del grifo para 7-7,5 si es necesario el uso de HCl 1 M o solución de NaOH 1M.
    3. Pico virus Deshielo (1 ml) y se añade todo el volumen de pico a 1 l de agua del grifo estéril sin cloro. Mezclar durante 10 min.
    4. Preparar un blanco método (el agua del grifo sin cloro y sin adenovirus) con cada experimento y el proceso de la misma manera que la muestra de púas.

3. Preparación de Millipore Filtro Aparato

  1. Retirar la cobertura estéril sobre la carcasa del filtro. Asegurarajuste adecuado entre la carcasa del filtro tazón superior y pantalla de filtro inferior para evitar fugas de la muestra durante la filtración.
  2. Retirar la cobertura estéril de 1 frasco L Erlenmeyer. Asegúrese de que el corcho de la unidad de filtro se ajusta perfectamente en la abertura superior de erlenmeyer, creando un buen sello.
  3. Retire el tazón superior de la unidad de filtro de malla del filtro inferior y colocar 47 mm disco de filtro electropositivo de lleno sobre la pantalla con pinzas estériles. Adjuntar filtro tazón vivienda a la pantalla inferior y ajustar en su lugar girando en sentido antihorario.

4. Pulse de filtración de agua (Concentración Primaria)

  1. Medir 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo usando estéril probeta.
  2. Vierta 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo en la carcasa del filtro que contiene o bien un filtro de 47 mm de vidrio plisado / celulosa o un filtro de disco de fibra nano-alúmina / vidrio.
  3. Deje que el agua pase lentamente a través del filtro. Aplicar vacío suave para eliminar los residuos restantes oagua del grifo f de la superficie del filtro.
  4. Si se utiliza el tratamiento con tripsina, añadir 5 ml de tripsina al 0,25% para filtrar superficie e incubar durante 5 minutos.
  5. Lavar la tripsina de la superficie del filtro utilizando 50 ml de agua desionizada estéril.

5. La elución Virus del filtro

  1. Retire la carcasa del filtro de 2 L frasco Erlenmeyer, y el lugar en frasco de 250 ml brazo lateral.
  2. Medir 100 ml de extracto de carne utilizando cilindro graduado. Vierta lentamente 100 ml de extracto de carne en caja del filtro.
  3. Permitir extracto de carne para verter a través del filtro, capturando extracto de carne en una pequeña (250 ml) matraz Erlenmeyer. Aplicar vacío para tirar a través de extracto de carne residual del filtro.

6. Celite Concentración Secundaria

  1. Frascos de transferencia que contiene los virus eluidas a una placa de agitación. Añadir estéril barra de agitación magnética y colocar en placa de agitación, mezcla para crear ligero vórtice.
  2. Añadir 0,1 g de celitepolvo a 100 ml de extracto de carne y permitir de celite para dispersar. Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne.
  3. Añadir gota a gota HCl 1 M de extracto de carne para alcanzar un pH de 4,0. Permita mezclar lentamente durante 10 min.
  4. Coloque 47 mm pre-filtro en la carcasa del filtro (como se describió anteriormente) usando un matraz Erlenmeyer de 2 l.
  5. Verter 100 ml de extracto de carne de vacuno / de la mezcla de celite sobre pre-filtro. Permita que el extracto de carne vierta a través. Aplicar ligero vacío para salir adelante extracto de carne residual del filtro.
  6. Coloque el metal clip de tubo en el extremo del tubo de salida del filtro. Adjuntar estéril 15 ml tubo de recogida de polipropileno para clip de tubo de metal. Coloque la carcasa del filtro de nuevo en erlenmeyer.
  7. Añadir 5 ml de tampón 1x PBS, pH 9,0 sobre celite recogida en pre-filtro.
  8. Permita PBS gotee a través de pre-filtro. Aplicar ligero vacío para salir adelante PBS residual en 15 ml tubo de recogida.

7. Orgánica floculación Concentración Secundaria

  1. La transferencia de los vasos que contienen el virus se eluyó a una placa de agitación. Añadir una barra de agitación magnética estéril a 100 ml de extracto de carne y mezclar para crear ligero vórtice.
  2. Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne.
  3. Añadir 1 M de HCl gota a gota a extracto de carne y ajustar el pH a 3,5. Mezclar durante 30 min.
  4. Verter el eluato en 250 ml tubos cónicos de centrífuga y centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC.
  5. Verter el sobrenadante con cuidado de no de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en 5 ml de 1x PBS, pH 9.
  6. Centrifugar la suspensión a 4.000 xg durante 10 min a 4 ºC. Verter el sobrenadante y desechar el sedimento.
  7. Ajustar el pH a 7-7,5, esterilizar por filtración a través de filtro de jeringa de 0,22 micras y congelación a -80 ° C.

8. Viral Nucleic Acid Extracción

  1. Extraer ácidos nucleicos virales utilizando un kit comercial apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

9. AdV 40/41 qPCR

  1. Utilice cebadores y sondas, así como la mezcla de reacción y perfiles de ciclo térmico según lo publicado 8,13.
    NOTA: límite estimado de detección del ensayo es de aproximadamente 5 unidades qPCR por reacción.
  2. Añadir componentes de las mezclas de amplificación de PCR en concentraciones como sigue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, mM dNTPs 10, 10 mM cebadores y sonda 1 M y 0,5 l de polimerasa de manera que los volúmenes finales de 45 l se puede añadir al número apropiado de pozos dentro de una placa de 96 pocillos de reacción PCR.
  3. Cargar 45 l de mezcla de amplificación PCR a cada pocillo apropiado de una de 96 pocillos, la placa de PCR reacción rápida.
  4. Añadir 5 l de ADN extraído de la muestra a los pocillos apropiados de la placa de PCR.
  5. Cubra la placa con junta de la tapa resistente al calor, girar la placa para mover cualquier gota a fondo de pozos de la placa de PCR.
  6. Establecer ciclos de amplificación por PCR como follOWS: 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min.

10. Análisis de datos

  1. Analizar mediciones por triplicado de las diluciones en serie de 5 veces de las muestras que abarcan 1: 5 a 1: 625 dilución gama con el fin de determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales, como se describió previamente 8,13.
  2. Analizar diluciones en serie de 5 veces de los picos experimentales de adenovirus que abarcan 1: 5 a 1: 15.625 rango de dilución para determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales.
  3. El uso de la calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar la calculadora para tener en cuenta el tipo de dilución (1: 5 ó 1:10), el número de diluciones realizado, y el número de replicar muestras en serie de dilución.
  4. Realizar log 10 transformación de los datos, seguido por la normalización a una unidad de volumen (por ejemplo, 1 ml, 100 ml, etc. ). Calcular recuperaciones para experimento dado dividiendo la cantidad de partículas virales presentes en la muestra se concentra con el número de partículas virales presentes en los picos experimentales.
  5. Evaluar el efecto de las diferentes variables experimentales (por ejemplo, diferentes tipos de celite, se rangos de pH, diferentes tipos de filtros y diferentes técnicas de concentración secundarios) sobre recuperaciones AdV mediante la realización de pruebas estadísticas paramétricas o no paramétricas (por ejemplo, prueba t pareada, uno o dos -Way ANOVA) dependiendo de la distribución de los datos y el diseño experimental.

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Resultados

Selección de Celite

Tres tipos diferentes de celita fueron probados antes de la selección de la mejor variante de realización. Celites con bien a las partículas de tamaño mediano producen los más altos recuperaciones de adenovirus. El uso de celites más grandes resultó en menores recuperaciones tanto para AdV40 y 41 (rango de 32% -100%) (Figura 1). Promedio de recuperaciones de adenovirus 40 eran 144% ± 52% (muy bien), 115% ± 28% (medio) y 82% ± 53% celites (grande) de...

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Discusión

Filtros electropositivos son útiles en la concentración de virus del agua; sin embargo, estos filtros pueden diferir en su estructura y composición, que a su vez podría alterar su eficacia. Para agravar este problema, las estructuras de la cápside y cargos varían entre las cepas de virus que requieren ser adaptados técnicas de concentración para asegurar una recuperación óptima 15. A través de simples modificaciones de las técnicas de concentración existentes (por ejemplo, los filtros electropositivo...

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Divulgaciones

Sin intereses financieros en competencia.

Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones o políticas de la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye un respaldo o recomendación de uso.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Nicholas J. Ashbolt y al Dr. G. Shay Fout por su revisión del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adenovirus 40 culataATCCVR-931
Adenovirus 41 culataATCCVR-930
Tiosulfato de sodioFluka Chemical Co.72051
Celites #577Fluka Chemical Co.22142
NanoCeram 47 mmArgónidoN/A
1MDS 47 mm3M6408502
AP-20 Prefiltro 47 mmMillipore Corp.
Glicina Sigma50046-1KG
Polifosfato de SodioAcros Organics390930010
TripsinaGibco25200
PBSSigmaP5368
Ácido ClorhídricoFisherA481-212
BBL Extracto de CarneBD Biosciences212303
Difco Extracto de Carne de VacunoBD Biosciences211520
ABI 7900 Sistema de PCR en tiempo realABIN/A
Carcasa de filtro de acero inoxidableMillipore Corp.
Kit de extracción de ADN sanguíneoXX2004720 Qiagen 51104
de MPN de la EPAhttp://www.epa.gov/nerlcwww/online.html
AP2004700Calculadora

Referencias

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