Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

Resumen

Los ensayos de neurotoxicidad in vitro mejorados ayudarían a la identificación de nuevos compuestos neuroprotectores. Se presenta la utilidad de un analizador celular basado en impedancia en tiempo real para determinar la citotoxicidad y la citoprotección en líneas celulares neuronales y para delinear la participación de las vías de segundo mensajero, obteniendo así información sobre el mecanismo de la neuroprotección.

Resumen

Muchos trastornos relacionados con el cerebro tienen la muerte celular neuronal implicado en su fisiopatología. Mejora en modelos in vitro para estudiar los efectos neuroprotectores o neurotóxicos de las drogas y las vías descendentes involucradas ayudaría a aumentar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares de neuroprotección / neurotoxicidad y potencialmente podría facilitar el desarrollo de fármacos. Sin embargo, muchos ensayos de toxicidad in vitro existentes tienen limitaciones importantes - más evaluar la neurotoxicidad y neuroprotección en un solo punto de tiempo, no permitiendo observar la evolución temporal y la cinética del efecto. Además, la oportunidad de recoger información sobre las vías de señalización corriente abajo implicados en la neuroprotección en tiempo real sería de gran importancia. En el protocolo actual se describe el uso de un tiempo real basados ​​en la impedancia analizador de células para determinar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT _2A) agonistas del receptor en una línea celular neuronal menores de etiqueta libre y en tiempo real Conditiones utilizando mediciones de impedancia. Además, se demuestra que los inhibidores de las vías de segundo mensajero se pueden utilizar para delinear las moléculas de aguas abajo implicadas en el efecto neuroprotector. También se describe la utilidad de esta técnica para determinar si un efecto sobre la proliferación celular contribuye a un efecto neuroprotector observado. El sistema utiliza placas microelectrónicos especiales denominados E-planchas que contienen alternando microelectrodos de oro en la superficie inferior de los pozos, que sirven como sensores celulares. La lectura de impedancia se modifica por el número de células adherentes, la viabilidad celular, la morfología y la adhesión. Un parámetro adimensional llamado Índice de Células se deriva de las mediciones de impedancia eléctrica y se utiliza para representar el estado celular. En general, el tiempo real basados ​​en la impedancia analizador de células permite en tiempo real, la evaluación de la etiqueta libre de la neuroprotección y la neurotoxicidad, y la evaluación de la implicación de las rutas segundo mensajero, contribuyendo a másevaluación detallada y de alto rendimiento de potenciales compuestos neuroprotectores in vitro, para la selección de candidatos terapéuticos.

Introducción

La muerte celular neuronal desempeña un papel fundamental en la fisiopatología de muchos trastornos relacionados con el cerebro ^1. La disponibilidad de información confiable y de alto rendimiento en los ensayos de toxicidad in vitro es fundamental para tener un mejor conocimiento de los mecanismos de neurotoxicidad y para ayudar a seleccionar moléculas neuroprotectoras como candidatos terapéuticos en el desarrollo de fármacos ^2. Sin embargo, hay muchas limitaciones a la mayoría ampliamente utilizado en assays.They neurotoxicidad vitro evaluar la neurotoxicidad / neuroprotección en un solo punto de tiempo no permitir la resolución cinética; a menudo utilizan etiquetas o sonda que puede interferir con las vías de señalización y limitar los estudios adicionales en la misma población de células, y son a menudo mano de obra, y en muchos casos no proporcionan una visión mecanicista. En el presente estudio se demuestra la utilidad de un tiempo real basados ​​en la impedancia analizador de células para determinar la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal en tiempo real y bajo libre de etiquetascondiciones y para proporcionar información sobre los mecanismos descendentes a través del análisis de las vías de segundos mensajeros involucrados en el efecto.

Estudios previos han confirmado la validez del analizador de células en tiempo real para determinar la citotoxicidad así como los efectos sobre la proliferación celular en líneas celulares en comparación con las técnicas estándar ^3,4,5,6. Por ejemplo, se observó una buena correlación entre las lecturas de la viabilidad celular WST-1 ensayo estándar y los valores de índice de células en varios puntos de tiempo bajo condiciones de proliferación basal y después de dos paradigmas diferentes tóxicos en células HeLa ^3. En las células A549 y MDA-MB-231 proliferación y citotoxicidad provocado con el estabilizador de microtúbulos paclitaxel mostraron valores muy similares cuando evaluada por mediciones del índice de la célula y de la forma estándar utilizado sulforrodamina B (SRB) de ensayo ^4. En la línea celular neuronal de las neuronas del hipocampo inmortalizadas HT-22 Cell mediciones de índice fueron validados por su capacidad to detectar la proliferación celular, la citotoxicidad glutamato y citoprotección contra el ampliamente utilizado de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) ^5. En el mismo estudio, los resultados del ensayo de MTT y las mediciones de índice de la célula también una buena correlación en la medición de la proliferación de las células progenitoras neuronales, citotoxicidad después de la privación de factores de crecimiento y de rescate de la citotoxicidad por el pan-caspasa inhibidor QVD ^5. Inducida en células NIH 3T3 por vandetanib (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular y el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico) Citotoxicidad mostró resultados similares medidos con los valores de índice de la célula o ensayo de captación de rojo neutro ^6.

Recientemente, hemos utilizado el sistema analizador de células en tiempo real para evaluar los efectos neuroprotectores de la serotonina 2A (5-HT _2A) agonista del receptor de clorhidrato de (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine (DOI) en una línea celular neuronal ( células SK-N-SH) y se seleccionaron para la participación de second vías de mensajería a través de monitorizar el efecto de la inhibición química de la neuroprotección observada ^7. Curiosamente, el receptor 5-HT _2A tiene agonistas tanto alucinógenas y no alucinógeno (como DOI y lisurida, respectivamente), que pueden activar las dos vías de segundos mensajeros comunes y distintas ^8.

Las ventajas de la técnica presentada son que permite recoger información en tiempo real sobre la supervivencia celular en el transcurso de días, para delinear las vías de segundos mensajeros implicados, para evaluar la posible contribución de los efectos de proliferación a la neuroprotección, y para seleccionar un tiempo óptimo para estudios de punto final adicionales en la misma población de células. Un diagrama esquemático del flujo de trabajo en el protocolo actual se presenta en la Figura 1.

Protocolo

1. Preparación

1. Coloque la estación del analizador de células en tiempo real en un incubador de cultivo de tejido fijado en 37 ° C y con 5% de CO _2. Llevar a cabo todas las manipulaciones de cultivo de células y tratamientos farmacológicos en una campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles.
2. NOTA: Neuronal líneas celulares que requieren diferentes ajustes de temperatura en comparación con las condiciones estándar para la cultura, deben ajustarse en consecuencia. Para las líneas de células débilmente adherentes, utilizar agentes de revestimiento para facilitar la interacción de las células con los microelectrodos de oro en el fondo de los pocillos de la placa de E-96.
3. Preparar soluciones 1,000x de stock de los compuestos farmacológicos para el tratamiento del cultivo celular (agentes neuroprotectores o inhibidores de la segunda vías mensajeras en el disolvente apropiado - dimetilsulfóxido o agua estéril) y almacenarlos a -20 ° C. Utilice el disolvente como vehículo en los siguientes tratamientos.
4. Células de cultivo de neuroblastoma humano SK-N-SH en DMEM / F12 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (medio de proliferación) en matraces de cultivo celular con 175 cm ² de superficie a una densidad de aproximadamente 75%. Mantenga el número de pases celulares dentro de un rango (de aproximadamente 10 pasajes) para determinar la coherencia entre los experimentos en términos de tasa de proliferación celular y la respuesta a la citotoxicidad. Se prefieren los números de pases bajos.
5. Se lava la capa de células SK-N-SH adherente con PBS, y trypsinize con solución de tripsina-EDTA al 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Centrifugar las células a 170 × g durante 5 min para eliminar la tripsina. Resuspender las células en 10 ml de medio de proliferación. Contar las células con contador de células Cetro y ajustar el número de células a 300.000 células / ml diluyendo las células con medio de proliferación.

2. Plating y proliferación de las células SK-N-SH

1. Añadir medio de proliferación 100 l a cada pocillo de la placa de E-96 y se deja durante 30 minutos en la campana de cultivo de tejidos a RT se equilibre. Inserte el E-PlaTE 96 en el tiempo real estación analizador de células en el incubador de _CO2 a 37 ° C.
2. Iniciar el software analizador de células en tiempo real. En la página Layout seleccionar los pozos incluidos en el experimento y entran en los cuadros de edición de la información sobre el tipo de células, el número de células, los nombres y las concentraciones de los compuestos químicos utilizados para el tratamiento de células.
   NOTA: Para los fines de este protocolo se recomiendan al menos 4 réplicas para cada tratamiento.
3. En la página de software Horario determinar "Pasos" incluida en el experimento, seleccionando el número de barridos de medición Índice de Células y el intervalo entre barridos para cada paso. Desde el paso 1 está predeterminado para la medida de fondo, seleccione "Agregar un paso" y establecer el paso 2 para medir el Índice de Células cada 15 minutos durante 96 horas.
   NOTA: Para los tratamientos, en los que se espera que los efectos con cinética rápida, establecen barridos a intervalos más cortos.
4. Haga clic en Iniciar para iniciar el paso predeterminado de forma automática 1y medir la impedancia de fondo de los medios de comunicación. Este valor se resta automáticamente por el software en cada punto de datos una vez que se añadieron las células a los pocillos.
5. Utilice el previamente preparado en el paso 1.5) suspensión celular de 300.000 células / ml en medio de proliferación. 30.000 células / pocillo para la toxicidad celular / estudios de neuroprotección y 15.000 células / pocillo para estudios de proliferación celular. Saque el E-Plate y añadir 100 l de suspensión celular por pocillo durante toxicidad celular / estudios de neuroprotección y añadir 50 l de suspensión celular y medio de proliferación de 50 l por pocillo de estudios de proliferación celular. El número de células sembradas por pocillo debe ser optimizado para cada línea celular empíricamente.
6. Remover con suavidad la E-Plate 96, incluso para chapado de las células. Deje el E-Plate 96 durante 30 min en la campana de cultivo de tejido a temperatura ambiente para permitir que las células se asientan de manera uniforme a la parte inferior de los pocillos.
7. Inserte el E-Plate 96 en la estación de analizador de células en tiempo real y comenzar el paso 2 de la Lista pla edad. Monitorear los valores del Índice Cell largo del experimento al ver las curvas de células en la página Terreno y los datos del índice de la célula primas en la página Índice de Células del software.

3. Suero privación

1. 24 horas después de la siembra de las células, una pausa en el experimento, y quitar la E-96 Placa de la estación de analizador de células en tiempo real. Diluir inhibidores de segundo mensajero de las existencias 1,000x con medio libre de suero / DMEM F12 - a 200 veces la concentración final. Tratar las células con 1 mu l inhibidores de las vías de segundos mensajeros que se realizarán las pruebas de su participación en la neurotoxicidad / neuroprotección 30 minutos antes de iniciar la citotoxicidad, de inhibir las respectivas vías. Devuelva el E-Placa 96 a la estación y reanudar mediciones experimentales Índice Cell.
2. Después de 30 minutos en pausa el experimento de nuevo. Retire con cuidado medio de proliferación plenamente de la E-Placa 96 pocillos con una pipeta (o una pipeta multicanal), teniendo cuidado de no perturbar la capa de células adherentesdirigiendo el borde de la punta de la pipeta a la esquina del pozo. Añadir 200 l / pocillo de DMEM libre de suero / F12 (medio de privación de suero). Asegúrese de intercambio rápido de medio de cultivo celular para reducir al mínimo la agitación mecánica de las células.
3. Diluir compuestos a ensayar por sus efectos neuroprotectores de 1.000X de stock con medio DMEM / F12 libre de suero a 200 veces la concentración final. Añadir 1 mu l compuestos a ensayar por sus efectos neuroprotectores y 1 mu l inhibidores de las vías de segundos mensajeros en los pocillos individuales de acuerdo con el plan experimental.
4. En las células para estudios de proliferación no cambie medio. Diluir compuestos a ensayar desde 1,000X de stock a 200 veces la concentración final en el medio de proliferación, el tratamiento con 1 l por pocillo y continuar a la cultura en medio de proliferación.
5. Reanudar el experimento para continuar con Cell mediciones de índice cada 15 minutos durante 96 horas según lo establecido previamente.

4. datos Análisis

1. Para neurotoxicidad / datos neuroprotección normalizan Índice de Células hasta el último punto de tiempo antes del tratamiento farmacológico o cambio de medio para reducir la variación entre los experimentos seleccionando "normalizado Índice de Células" y "normalizar la hora" en la página Mapa.
2. Destacar los pozos en la página Parcela en las condiciones experimentales de interés y haga clic en "Añadir" para trazar las curvas de índice de células normalizadas. Observar la cinética del efecto neurotóxico / neuroprotector, o la inhibición de segundo mensajeros como curvas de índice de células normalizado como una función del tiempo.
3. Tenga en cuenta las curvas de índice de la célula para los tratamientos con fármacos ensayados en medio de proliferación como una función de tiempo para evaluar si un efecto sobre la proliferación está implicado en el efecto neuroprotector / neurotóxico.
4. Exportar la información experimental para todos los puntos de la célula de tiempo Índice de la página de software Índice de Células en un archivo de Excel para iniciar la evaluación estadística de los resultados
   NOTA: Como primer paso en el análisis estadístico de un conjunto de programas de MATLAB modificados que utilizan la prueba t de Welch, con el valor p representa semilogarithmically, utilizar eje invertida contra la escala de tiempo (incluidos como archivos de código suplementarios). Estos programas permiten la detección de los valores de p en el tiempo-luego de todo un experimento en tiempo real analizador de células, y por lo tanto ayudan a la selección de los puntos de tiempo para el análisis estadístico más detallado. Ver el material complementario para obtener información detallada sobre los programas.
5. Para el análisis estadístico de las diferencias en los valores de índice de células en diferentes condiciones de tratamiento en puntos específicos de tiempo, seleccione los valores de índice de la célula en respectivos puntos de tiempo desde el archivo exportado Excel. Analizar los valores del índice de la célula de los puntos de tiempo seleccionados con una sola vía o de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) seguido de una prueba post-hoc utilizando el software estadístico.

Resultados

Suero privación conduce a una disminución en los valores de índice de células, que pueden ser monitoreados continuamente con el analizador de células en tiempo real

Estímulos neurotóxicos a las células conducen a una disminución en los valores de índice de células, que puede ser monitoreado en tiempo real con la técnica presentada y la dinámica de los cuales depende de los estímulos neurotóxicos específico y el tipo de célula estudiado. Figura 2 demues...

Discusión

El protocolo actual presenta la utilidad de un analizador de células en tiempo real para evaluar de manera continua y en condiciones de etiqueta libre de los efectos neuroprotectores / neurotóxicos de compuestos en líneas de células neuronales y para profundizar en los segundos mensajeros vías implicadas en el efecto.

A pesar de que la utilidad del analizador de células en tiempo real para estudiar la citotoxicidad y efectos de las drogas sobre la proliferación celular es generalmente recono...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
xCELLigence  Paquete de sistema RTCA SP	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consta de analizador RTCA, estación RTCA SP y unidad de control RTCA
E 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	Para el cultivo de las células, insertado en la estación RTCA SP
SK-N-SH células	ATCC (en asociación con LGC Standards)	HTB-11	Puede ser reemplazado por otra línea celular neuronal adherente de interés
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Medio de cultivo celular
Suero fetal bovino	Life Technologies	16140-063	Suplementos para la proliferación, pero no para la privación sérica
Matraz para cultivo de tejidos T175	Sarstedt	83.1812.302	Para el cultivo de células, que posteriormente se colocarán en la placa E 96
0,05% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300-054	Para la tripsinización de células cultivadas en matraces de cultivo de tejidos
Contador de células Scepter 2.0	Merck Millipore	PHCC20060	Contador de células automatizado
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies	10010-015	Para el lavado de las células
(±)-Clorhidrato DOI	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonista para el tratamiento de cultivos celulares
Clorhidrato LY-294002	Sigma-Aldrich	L9908	Inhibidor de PI3-K para el tratamiento de cultivos celulares
Maleato de lisuro	Tocris Bioscience	4052	Compuesto con actividad agonística 5-HT2A para el tratamiento de cultivos celulares
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D4540	Para disolver LY-294002 y maleato de lisuria