Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

Resumen

Aquí describimos nuestra estrategia para obtener registros estables y bien aislados de una sola unidad a partir de interneuronas inhibitorias identificadas en la corteza del ratón anestesiado. Las neuronas que expresan ChR2 se identifican por su respuesta a la luz azul. El método utiliza un equipo de registro extracelular estándar y sirve como una alternativa económica a las imágenes de calcio o a los parches guiados visualmente.

Resumen

Un reto importante en la neurofisiología ha sido caracterizar las propiedades de respuesta y función de los numerosos tipos de células inhibitorio en la corteza cerebral. Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para obtener, bien aisladas grabaciones de una sola unidad estables de interneuronas inhibitorias identificados en la corteza del ratón anestesiado utilizando un método desarrollado por Lima y sus colegas ^1. Las grabaciones se realizaron en ratones que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en subpoblaciones neuronales específicas. Los miembros de la población se identifican por su respuesta a un breve destello de luz azul. Esta técnica - denominada "PINP", o identificación asistida Fotoestimulación de poblaciones neuronales - se pueden implementar con equipos estándar de grabación extracelular. Puede servir como una alternativa económica y accesible para imágenes de calcio o parches visualmente guiada, con el fin de apuntar a registros extracelulares a las células genéticamente identificados. HERE proporcionamos un conjunto de directrices para la optimización del método en la práctica cotidiana. Nosotros refinamos nuestra estrategia específicamente para atacar a las células parvalbúmina-positivo (VP +), pero hemos encontrado que funciona para otros tipos de interneuronas, así, como (CR +) interneuronas calretinin expresan somatostatina-expresión (SOM +) y.

Introducción

Caracterizar la miríada de tipos de células que componen el cerebro de los mamíferos ha sido un objetivo central, pero largamente esquivo de la neurofisiología. Por ejemplo, las propiedades y la función de diferentes tipos de células inhibidoras en la corteza cerebral son temas de gran interés, pero aún son relativamente desconocidos. Esto se debe en parte a que las técnicas convencionales de registro ciego in vivo tienen una capacidad limitada para distinguir entre diferentes tipos de células. La anchura de la espícula extracelular puede utilizarse para separar las neuronas inhibidoras putativas parvalbúmina positivas de las células piramidales excitadoras, ....

Protocolo

NOTA: El siguiente protocolo es de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud aprobado por la Universidad de Oregon Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. Cirugía aguda

1. Anestesiar al animal con un cóctel de ketamina-medetomidina, a través de inyección intraperitoneal (ip) (Tabla 1).
   NOTA: Los ratones utilizados en estos experimentos se generan por el cruce de una línea 10 ChR2-eYFP transgénico cre-dependiente interneurona conductor líneas (PVALB-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega viral de ChR2 o opsinas relacionados debería funcionar igual de bien, en el supuesto se obti....

Resultados

Estamos aquí compartimos nuestra estrategia para la obtención de grabaciones de una sola unidad de interneuronas inhibitorias genéticamente clasificados en la corteza del ratón anestesiado, utilizando un método de optogenética desarrollado por Lima et al. Tabla 1 detalla el cóctel anestésico sugerido, ketamina-medetomidina-Acepromazina ^(1. " KMA "). La Figura 1 representa un microelectrodo de tungsteno, preparado para la grabación. La Figura 2 contie.......

Discusión

Aunque PINP es conceptualmente sencillo, puede ser difícil en la práctica. Un importante factor determinante del éxito es la elección de electrodo. El radio de escucha eléctrica es el parámetro crítico. Debe ser lo suficientemente grande para detectar picos de luz evocado cuando la punta está todavía a cierta distancia de una célula ChR2 +, de modo que se puede ajustar la velocidad de avance en consecuencia. Al mismo tiempo, debe ser lo suficientemente restringido para permitir un buen aislamiento de una sola unidad. Es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea ChR2-EYFP	Colonias Jackson	12569
Línea Pvalb-iCre (PV)	Colonias Jackson	8069
Línea Sst-iCre (SOM)	Colonias Jackson	13044
Cr-iCre (CR) Línea	Colonias Jackson	10774
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9793	Tipo III-A, Alto EEO
Micro Punto (dural gancho)	FST	10066-15
Tijeras quirúrgicas	FST	14084-09
Bisturí	FST	10003-12 (mango), 10011-00 (cuchillas)
Pomada oftálmica Puralube	Foster & Smith	9N-76855
Manta homeotérmica	Aparato de Harvard	507220F
Microelectrodos de tungsteno	A-M Systems	577200	12 MΩ Resistencia de CA, 127 μ m de diámetro, 12 grados; punta cónica, recubierta de epoxi
Tubo de vidrio capilar	Warner Instruments	G150TF-3
Tubo termorretráctil	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Úselo con Super Glue estándar.
Microelectrodo Amplificador de CA 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipulador Motorizado	Sutter	MP-285
Osciloscopios Digitales de 4 Canales	Tektronix	TDS2000C
Altavoces Autoamplificados	Harman	Modelo JBL
Manipulador Manual Dúo	Scientifica	LBM-7
800 µ m Cable de conexión de fibra óptica	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Medidor de potencia	ThorLabs	PM100D (Medidor de potencia), S121C (Sensor de potencia estándar)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	La potencia y la eficiencia de los LED aumentan continuamente, por lo que recomendamos buscar los últimos productos (www.cree.com).
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