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Artículo de método

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

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DOI:

10.3791/51764

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23 de agosto de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

En este artículo

Resumen

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Resumen

Una de las principales limitaciones con células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales es la generación de poblaciones de células heterogéneas. Estos cultivos contienen las células de interés, pero también se contaminan con los CES indiferenciadas, derivados no neurales y otros subtipos neuronales. Esto limita su uso en in vitro y en aplicaciones in vivo, tales como el modelado in vitro para el descubrimiento de fármacos o la terapia de reemplazo celular. Para ayudar a superar esto, las líneas celulares reporteras, que ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés, se pueden diseñar. Sin embargo, para lograr esto en células madre embrionarias humanas a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente. Este protocolo describe la orientación de la homeobox pituitaria 3 (Pitx3) locus de células madre embrionarias humanas mediante nucleasas de dedos de zinc de diseño personalizado, que introducen rupturas de doble hebra de ADN específicas del lugar, junto con unPitx3 - EGFP específico de vector donante de ADN. Después de la generación de la línea celular reportera Pitx3, entonces se puede diferenciar usando protocolos publicados para su uso en estudios in vitro tales como el modelado de la enfermedad o el reemplazo de células en la terapia de Parkinson.

Introducción

Células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales resultan en poblaciones de células heterogéneas, particularmente con respecto a la derivación de fenotipos neuronales específicas. Por lo tanto, aunque los cultivos contienen el fenotipo celular deseada, otra neuronal, tipos celulares disociados de la ONU no neuronal y están a menudo presentes 1. Estas características limitan la aplicación de ESC deriva fuentes de células para su uso en la terapia de reemplazo celular y en el modelado de la enfermedad vitro.

Líneas celulares reporteras genéticos ofrecen un medio para visualizar, rastrear y aislar las células de interés, a condición de que la expresión de la proteína indicadora (RP) reproduce la expresión endógena. El uso de promotores inmediatamente aguas arriba de una región codificante del gen se puede utilizar para derivar reporteros genéticos crudo pero tales construcciones carecen de los elementos reguladores precisos que controlan la expresión génica endógena. En contraste, la recombinación homóloga ofrece laoportunidad de asegurar la expresión de alta fidelidad de la RP. En el pasado, apuntando vectores diseñados para la recombinación homóloga en los loci específico de interés se han utilizado para RPs en ratón CES (mESCs) apuntar usando electroporación como medio de suministro de ADN 1,2. Sin embargo, la generación de líneas celulares reportero a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente para CME humanas (hESCs), y por tanto sólo se ha documentado en un puñado de casos (revisado en 3). Mediante el uso de una proteína quimérica de ingeniería que contiene una fusión de una nucleasa Fok I con motivos de dedos de zinc específicos del sitio, conocidas colectivamente como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), la DNA se rompe la doble cadena se pueden introducir en loci genómico predeterminado. Cuando se añade un vector de ADN con homología a ambos lados de la ruptura del ADN de doble cadena, el sitio genómico se puede reparar mediante recombinación homóloga, permitiendo la incorporación de la secuencia donante de ADN. Esta técnica ha demostrado ser útil fo edición genómico tanto en las células primarias humanas 4,5 y 6,7 hESCs. Un trabajo más reciente de transcripción ha utilizado activador de nucleasas efectoras (Talens), factores de transcripción utilizados por fitopatógenos 8, para ayudar en el diseño de nucleasas específicas de sitio 9.

En el siguiente protocolo se demuestra la generación de una línea celular de células madre reportero por electroporación de un EGFP que contiene homóloga vector de orientación 6 junto con ZFNs para el homeobox pituitaria humana 3 (Pitx3) locus. Tras la selección de antibióticos durante 2-3 semanas, hESCs con ADN integrado correctamente pueden ser recogidos manualmente, se expandieron y se seleccionaron inicialmente mediante PCR, y posteriormente validados por transferencia de Southern.

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Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril. Todos los medios y soluciones se equilibraron a 37 ° C a menos que se especifique lo contrario.

1. Ampliación del PSC Humanos (hESCs y hiPSCs, WA-09 utilizado en el presente Protocolo) para la transfección

Nota: No es necesario ampliar hESCs en Matrigel o Geltrex. hESCs Ampliado de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) pueden ser utilizados para la electroporación o nucleofection después de una etapa de eliminación del MEF (ver sección 2.8).

  1. Preparar 1 x 100 mm plato y 1 x frasco de 75cm2 DR4 MEFs a 2,0 x 10 4 células por cm 2 en los medios de comunicación del MEF (ver Tabla 1) en los platos pre-recubierto con 0,1% w / v de gelatina.
    Nota: CF1, BLK6 o MF1 MEFs se puede utilizar, sin embargo, se recomienda que se utilicen líneas MEF resistentes a los antibióticos, por ejemplo, DR410.
  2. Al día siguiente, hESCs paso en una placa de 100 mm pre-plateado con MEFs preparados en la sección 1.1. Para ello aspitasa hESC medios de culturas platos, lavar hESCs con solución salina equilibrada de Ca2 + / Mg2 + exento de Hanks (HBSS), añadir Dispasa (ver Tabla 2 en volúmenes apropiados), y meterlo en un incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2. Después de 3-5 minutos de incubación, aspirado Dispasa y suavemente lavar 1-2 veces con HBSS para eliminar MEFs. Añadir medios células madre (véase la Tabla 3) y usando un raspador de células, o 5 ml pipeta, raspar suavemente las colonias de la superficie de la placa de cultivo.
  3. Recoger los fragmentos de colonias en la suspensión de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga de 15 ml. Placa de cultivo Enjuague con medios de comunicación y traslado al tubo de 15 ml de células madre. Tenga cuidado de no romper los grumos en células individuales o pequeños fragmentos.
  4. Centrifugar durante 5 minutos a 160 xg para sedimentar los fragmentos de colonias.
  5. Aspirar el sobrenadante. Toque en el fondo del tubo de 15 ml con el dedo para aflojar colonia fragmento de pellets. Fragmentos suavemente volver a suspender las colonias en medios de células madre según la relación de división (normallya dividir relación entre 1: 4 y 1: 8 es apropiado). Tenga mucho cuidado de no hacer grumos en las células individuales o pequeños fragmentos ya que esto afectaría replating eficiencia.
  6. Antes de resiembra fragmentos de células madre en MEFs lavan 1 vez con HBSS. Poco a poco agregue la cantidad apropiada (véase la Tabla 2) de la suspensión de células que contiene fragmentos de células madre en los medios de comunicación de células madre a los platos pre-plateados, MEFs.
  7. Coloque placas de cultivo en la repisa en la incubadora y se mueven lentamente hacia adelante y hacia atrás y de lado a otro para distribuir uniformemente fragmentos de colonias.
  8. Vuelva a colocar los medios de comunicación de células madre a diario.
  9. Para preparar los medios de MEFs (MEF-CM) acondicionado lavar el 75 cm 2 frasco de pre-plateado con MEFs 1 x con HBSS. Añadir medios hESC. Después de 24 horas, recoja medio condicionado y reemplazar con los medios de comunicación hESC fresco. Repita todos los días durante un máximo de 12 días. Almacenar MEF-CM a 4 ° C hasta que se necesite.

2 Preparación de los CES Humanos de transfección

  1. Observar el crecimiento de hESCsbajo un microscopio todos los días. Cuando las colonias se convierten en un 40-50% de confluencia, la placa 3 x 100 mm platos con 2,0 x 10 5 MEFs por cm 2.
  2. Cuando las colonias se convierten en 60 - 70% de confluencia que están listos para ser transfectadas. 'novio' colonias mediante la eliminación de colonias diferenciadas o núcleos de colonias.
    Nota: Como creemos más alta eficiencia de transfección y dirigidos ocurren cuando las células están en fase logarítmica de crecimiento, se sugiere que la electroporación se llevó a cabo antes de hESCs alcanzan ≥ 70% de confluencia.
  3. Lávese las colonias de células madre con HBSS y añadir Accutase.
    Nota: No es necesario hESCs el pretratamiento con el inhibidor ROCA Y-27632 de inhibición suficiente se producirá cuando se incubaron con Y-27632 durante el paso 2.7
  4. Incubar durante 10 - 20 min a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta que las colonias se vuelven células individuales como se observa bajo un microscopio. Las células se tritura con una pipeta de 1 ml.
  5. Añadir medios hESC y filtro en un tubo cónico de 15 ml utilizando un Straine 40 micras celularR para eliminar grupos de células.
  6. Se centrifuga a 160 × g durante 5 min. Resuspender pellet de células en medios de células madre recién reconstituido y repetir para eliminar cualquier solución Accutase residual.
  7. Resuspender las células en los medios de comunicación de células madre que contienen 10 M Y-27632 y transferir la suspensión total de células a una placa de 100 mm pre-recubierto con gelatina.
  8. Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante un mínimo de 30 min.
  9. Durante este tiempo MEFs se adhiere al plato de gelatina recubierta. Recoger hESCs no adherentes utilizando una pipeta de 1 ml en un tubo de centrífuga de 15 ml fresco y determinar la densidad de células usando un hemocitómetro.

3. electroporación de hESCs

  1. Los medios filtrantes-CM MEF que utilizan un filtro de 0,22 micras y añadir 10 ml de factor de crecimiento / fibroblasto humano recombinante ng 2 (rhFGF2).
  2. Transferir 7,5 x 106 hESCs de la sección 2.9 a un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 160 xg durante 5 min.
  3. Durante este tiempo configurar el electroporador: Seleccione el programa para ele exponencialctroporation y establezca los siguientes parámetros, Voltaje: 250 V, capacitancia: 500 mF, y Resistance: ∞-.
  4. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender pellet de células en 0,8 ml de helado de 0,22 micras HBSS filtrada. Transfiera la solución a un 0,4 cm cubeta de electroporación estéril.
  5. Añadir construcción de la orientación TV-hPITX3-forward (30 g de ADN) y mezclar suavemente con una pipeta de 200 l. Incubar en hielo durante 5 min. Durante este tiempo, retirar una alícuota de Pitx3 ZFN ARNm y descongelar en hielo. Cuando descongelado transferencia de 7,5 l de ADN ZFN ARNm para mezcla / célula en cubeta de electroporación. Mezclar suavemente con una pipeta de 200 l.
    Nota: El lugar está dirigido es el principal factor que contribuye a la eficiencia de la focalización. Codificación Loci genes silenciosos, los genes no se expresan en los CES, como Pitx3 son difíciles de destino mediante recombinación homóloga convencional 6. Por lo tanto, este protocolo utiliza ZFNs diseñado a medida para el locus Pitx3 humana para inducir un ADN de doble cadena break.
  6. Electroporar siguiendo las instrucciones que aparecen en pantalla en el electroporador.
  7. Usando una pipeta transferir 200 l el contenido de la cubeta de electroporación de un tubo de 15 ml que contiene 10 ml de medio de células madre. Lave la cubeta dos veces con 200 l de los medios de comunicación de células madre cada vez y de transferencia a un tubo de 15 ml. Habrá "-mucosa como" escombros formado por ADN y proteínas de las células lisadas que repercutirán negativamente en la supervivencia celular. Se centrifuga a 160 g durante 5 minutos para eliminar estos desechos.
  8. Aspirar el sobrenadante y golpee suavemente sedimento celular para aflojar. Vuelva a suspender en 30 ml suplementadas MEF-CM que contienen 10 M Y-27632 y replate a 3 x 100 mm platos preplated con MEFs.
  9. Cambie los medios de comunicación todos los días. El día 2, Y-27632 puede ser retirado y las células cultivadas en los medios de prensa de células madre.
  10. Después de 2-3 días los hESCs deben ser 50-70% de confluencia. En este punto, comenzará la selección de antibióticos (por ejemplo, 0,5 mg / ml de puromicina).
  11. Mantener selexión añadiendo fresca medios hESC / puromicina diaria. Después de ~ 7 días pequeñas colonias deben ser visibles. Si no se utilizan MEFs resistentes a los antibióticos, MEFs se puede complementar con la adición de una células adicionales 1,0 x 10 4 por cm 2.

4. Picking clones transgénicos de células madre

  1. Aproximadamente el 14 - 21 días después de la selección (cuando las colonias han alcanzado ~ 1 mm de diámetro) se preparan placas de expansión y proyección. Comience por descongelar una alícuota de Matrigel o Geltrex a 4 ° C durante un mínimo de 5 horas. Diluir según las instrucciones del fabricante y añadir 75 l a cada pocillo de placas de 3 x 96 pocillos. Preparar placas 3 x 48 pocillos en placas MEF a 2,0 x 10 4 células por cm 2. Incubar ambas placas O / N a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. El día siguiente diseccionar colonias en 16-25 pedazos usando una aguja 21 en el extremo de una pipeta de 2 ml mediante la reducción de una cuadrícula.
  3. Aspirar Matrigel de placas de 96 pocillos y reemplazar con suplemmedios entados CM-MEF. Lave MEFs en placas de 48 pocillos 1 x con HBSS y añadir medios células madre.
  4. Usando una pipeta de 200 l transferir suavemente tercio de la colonia diseccionado en una placa de 48 pocillos para la expansión. Transferir el otro 2/3 de la colonia diseccionado en una placa de 96 pocillos correspondiente que contiene medios suplementados CM-MEF.
  5. Mantener ambas placas cambiando los medios de comunicación al día (complementado los medios de comunicación CM-MEF para placas Matrigel de 96 pocillos recubiertos y medios de células madre para placas de 48 pocillos que contenían MEFs; tanto suplementado con 0,5 mg / ml de puromicina).
  6. Expandir hasta placas de 96 pocillos son 100% confluentes y luego inicialmente pantalla a través de PCR.

5. Selección y expansión de clones positivos

  1. Para preparar ADN genómico (método basado en 11) eliminar todos los soportes de las placas mediante la inversión, luego seque sobre toallas de papel.
  2. Enjuague cada pocillo dos veces con PBS RT (100 l / pocillo de cada lavado), invertido y blot como para el paso 5.1. Coloque las placas a -80 ° C fo 1 - 2 horas para ayudar en la lisis celular (placas pueden almacenarse indefinidamente como este).
  3. Mientras que las células son a -80 ° C. hacer Sarcosilo tampón de lisis (véase la Tabla 4) (50 l / pocillo). Para lisar las células, placas calientes durante 5 min a TA, luego tampón de lisis pipeta en cada pocillo. Selle los bordes de cada placa con cinta, colocar en un recipiente hermético que contiene toallas de papel húmedas para crear la humedad, e incubar O / N a 60 ° C.
  4. Después de la incubación añadir 150 l de NaCl 5 M a 10 ml de -20 ° C etanol absoluto, se mezcla bien y añadir 100 ml a cada pocillo (Nota: etanol irá turbia cuando se añade NaCl). Golpeadores suavemente para mezclar (no pipeta) y salen por un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo la solución irá claro y el ADN se precipitará.
  5. Retire la solución como en el paso 5.1 a continuación, añadir 150 l de etanol al 70% a cada pocillo. Invierta la placa suavemente y secar como antes. Repita este paso una mayor 2x.
    Nota: Debido a que el ADN precipitado natural adheres a la de plástico de cultivo de tejidos que no se desplacen durante estas etapas de lavado.)
  6. Después del lavado final placas de centrifugar brevemente a la máxima velocidad para concentrar el ADN a la parte inferior de cada pocillo a continuación secar al aire a temperatura ambiente (o 37 ° C) durante al menos 30 min.
  7. Añadir 40 - 50 l T0.1E (pH 8,0) (véase la Tabla 5) o TE (pH 8,0) a cada pocillo y colocar las placas a 65 ° C durante 1 hora oa 4 ° CO / N antes de usarlo por PCR. Resuspender el ADN golpeando suavemente los lados de la placa. Utilice 1-2 l de re-suspendido de ADN / 10 l de reacción de PCR.
  8. Usando el Sistema de Alto PCR Expand Plantilla con brazo hPITX3 L gen. F y cebadores GFP brazo hPITX3 R L realizan la selección inicial de los clones a 58 ° C de recocido, extensión 45 seg, 35 ciclos.
  9. Muestras de electroforesis con 1kb Hyperladder en un gel de agarosa al 1% que contiene GelRed a 100 V durante 45 min y detectar los clones positivos a través de iluminación UV.
  10. Validar clones positivos de PCR mediante la digestión de ADN genómico de expaclones nded (ver más abajo) con HindIII y de hibridación sondas 5 'y 3' de los brazos de homología del vector a una transferencia Southern (como se ha descrito anteriormente en 1). Las sondas se generaron por PCR utilizando los pares de cebadores hPITX3 5 'de la sonda F y R, y hPITX3 3' de la sonda F y R, se digirió con EcoRI y se ligó en un vector de clonación general.
  11. Dependiendo del número de clones positivos, preparar 2 pocillos de una placa de 6 pocillos pre-chapado con MEFs (2,0 x 10 4 células por cm 2).
  12. Al día siguiente pretratar clones positivos en la placa de 48 pocillos con 10 M Y-27632 durante un mínimo de 1 hr.
  13. Lave clones positivos con HBSS y añadir 300 l de Accutase.
  14. Cuando las colonias se vuelven células individuales, añadir 1 ml de medio de células madre y recoger en un tubo de 15 ml.
  15. Cambie los medios de comunicación todos los días. El día 2, Y-27632 puede ser retirado y las células cultivadas en medios de células madre.
  16. Cuando las colonias son de 70 - 80% de confluencia, subcultura y congelar el resto de la colofragmentos ny.

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Resultados

Después de co-electroporación de la Pitx3 par zinc-finger de diseño personalizado junto con el Pitx3 - EGFP ADN específico de vector donante, y la selección de puromicina posterior, los clones de células madre positivas se detectaron inicialmente a través de la selección por PCR genómico (Figura 1). Hibridación de transferencia Southern de estos clones positivos de PCR con 5 'y 3' sondas específicas confirmó la orientación correcta para el exón 1 del locus Pitx3

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Discusión

La generación de líneas celulares reporteras ofrece un medio poderoso para realizar un seguimiento, visualizar y aislar células de interés a partir de una población heterogénea derivadas de hESCs. Sin embargo, la orientación de genes por recombinación homóloga convencional ha demostrado ser extremadamente ineficiente para humanos CES 3. En este protocolo se describe una técnica relativamente sencilla para la introducción de un RP en el exón uno de los locus Pitx3, en hESCs usando un vector de orienta...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo descrito en este protocolo fue posible gracias a la financiación del Gobierno de Victoria como parte de una alianza de colaboración con el Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fibroblastos embrionarios de ratón (DR4)GlobalStemGSC-6004G
GelatinaSigmaG1393-100ML
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol (HBSS)Life Technologies14175-095
DispasaStemCell Technologies7923
Raspador de célulasCorning3008
AccutaseLife TechnologiesA11105-01
Y27632Axon MedchemAxon 1683
Filtro de células - 40 μ mBD Biosciences352340
33 mm - 0,22 μ filtro mMilliporeSLGP033RS
rhFGF2R& D Systems233-FB-025/CF
ElectroporadorBioRad165-2661
cubeta de electroporación de 0,4 cmBioRad165-2088
Human TV-hPITX3-forward construct de orientación Addgene31942
ZFN Kit; PITX3humano Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
PuromicinaInvivoGenant-pr-1
MatrigelBD Biosciences354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Life Technologies10566-016
Suero Fetal Bovino, Calificado, Inactivado por Calor, Origen de EE. UU. (FBS)Life Technologies16140-071
Pluma/EstreptococoLife Technologies15070-063
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12)Life Technologies11320-033
KnockOut Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828-028
MEM Aminoácidos No Esenciales  (NEAA)Life Technologies11140-050
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ß-mercaptoetanolLife Technologies21985-023
N-Lauroilsarcosina solución salina sódica (Sarcosyl) (30%)Sigma-Aldrich61747
EDTASigma-AldrichE9884
Trizma ClorhidratoSigma-AldrichT3253
Proteinasa K solución (20 mg/ml)Bioline AustraliaBIO-37084
Expandir Sistema de PCR de Plantilla LargaRoche Australia11681834001
hPITX3 L brazo gen. F (cebador): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'GeneWorks, Australia
Brazo hPITX3 L GFP R (imprimación): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'GeneWorks, Australia
HyperLadder 1 kb Bioline AustraliaBIO-33025
GelRedJomar Bioscience, Australia41003

Referencias

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Reimpresiones y permisos

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