Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.
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Artículo de método
Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
Una de las principales limitaciones con células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales es la generación de poblaciones de células heterogéneas. Estos cultivos contienen las células de interés, pero también se contaminan con los CES indiferenciadas, derivados no neurales y otros subtipos neuronales. Esto limita su uso en in vitro y en aplicaciones in vivo, tales como el modelado in vitro para el descubrimiento de fármacos o la terapia de reemplazo celular. Para ayudar a superar esto, las líneas celulares reporteras, que ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés, se pueden diseñar. Sin embargo, para lograr esto en células madre embrionarias humanas a través de recombinación homóloga convencional es extremadamente ineficiente. Este protocolo describe la orientación de la homeobox pituitaria 3 (Pitx3) locus de células madre embrionarias humanas mediante nucleasas de dedos de zinc de diseño personalizado, que introducen rupturas de doble hebra de ADN específicas del lugar, junto con unPitx3 - EGFP específico de vector donante de ADN. Después de la generación de la línea celular reportera Pitx3, entonces se puede diferenciar usando protocolos publicados para su uso en estudios in vitro tales como el modelado de la enfermedad o el reemplazo de células en la terapia de Parkinson.
Introducción
Células madre embrionarias (ESC) protocolos de diferenciación actuales resultan en poblaciones de células heterogéneas, particularmente con respecto a la derivación de fenotipos neuronales específicas. Por lo tanto, aunque los cultivos contienen el fenotipo celular deseada, otra neuronal, tipos celulares disociados de la ONU no neuronal y están a menudo presentes 1. Estas características limitan la aplicación de ESC deriva fuentes de células para su uso en la terapia de reemplazo celular y en el modelado de la enfermedad vitro.
Líneas celulares reporteras genéticos ofrecen un medio para visualizar, rastrear y ....
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Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril. Todos los medios y soluciones se equilibraron a 37 ° C a menos que se especifique lo contrario.
1. Ampliación del PSC Humanos (hESCs y hiPSCs, WA-09 utilizado en el presente Protocolo) para la transfección
Nota: No es necesario ampliar hESCs en Matrigel o Geltrex. hESCs Ampliado de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) pueden ser utilizados para la electroporación o nucleofection después de una etapa de eliminación del MEF (ver sección 2.8).
- Preparar 1 x 100 mm plato y 1 x frasco de 75cm2 DR4 MEFs a 2,0 x 10
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Resultados
Después de co-electroporación de la Pitx3 par zinc-finger de diseño personalizado junto con el Pitx3 - EGFP ADN específico de vector donante, y la selección de puromicina posterior, los clones de células madre positivas se detectaron inicialmente a través de la selección por PCR genómico (Figura 1). Hibridación de transferencia Southern de estos clones positivos de PCR con 5 'y 3' sondas específicas confirmó la orientación correcta para el exón 1 del locus Pitx3
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Discusión
La generación de líneas celulares reporteras ofrece un medio poderoso para realizar un seguimiento, visualizar y aislar células de interés a partir de una población heterogénea derivadas de hESCs. Sin embargo, la orientación de genes por recombinación homóloga convencional ha demostrado ser extremadamente ineficiente para humanos CES 3. En este protocolo se describe una técnica relativamente sencilla para la introducción de un RP en el exón uno de los locus Pitx3, en hESCs usando un vector de orienta.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo descrito en este protocolo fue posible gracias a la financiación del Gobierno de Victoria como parte de una alianza de colaboración con el Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fibroblastos embrionarios de ratón (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatina | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispasa | StemCell Technologies | 7923 | |
| Raspador de células | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Filtro de células - 40 μ m | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0,22 μ filtro m | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R& D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporador | BioRad | 165-2661 | |
| cubeta de electroporación de 0,4 cm | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward construct de orientación Addgene | 31942 | ||
| ZFN Kit; PITX3 | humano Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromicina | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Suero Fetal Bovino, Calificado, Inactivado por Calor, Origen de EE. UU. (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pluma/Estreptococo | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Aminoácidos No Esenciales (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroilsarcosina solución salina sódica (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Clorhidrato | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinasa K solución (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expandir Sistema de PCR de Plantilla Larga | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L brazo gen. F (cebador): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3' | GeneWorks, Australia | ||
| Brazo hPITX3 L GFP R (imprimación): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3' | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
Referencias
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W.
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Reimpresiones y permisos
