Presentamos un procedimiento para aislar ARN con alta integridad del páncreas de ratón rico en ribonucleasa.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica
En este artículo
Resumen
Resumen
El aislamiento de ARN de alta calidad de tejido rico en ribonucleasa, como el páncreas de ratón, presenta un desafío. Como una función principal del páncreas es ayudar en la digestión, el páncreas de ratón puede contener hasta 75 mg de ribonucleasa. Informamos sobre modificaciones de los protocolos estándar de reactivos de lisis de tiocianato de fenol/guanidina para aislar el ARN del páncreas de ratón. El tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y interrumpirá eficazmente la actividad de la ribonucleasa en la mayoría de las condiciones. Sin embargo, son necesarias modificaciones críticas en los protocolos estándar para aislar con éxito el ARN de los tejidos ricos en ribonucleasa. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de lisis a tejido, la eliminación del tejido no digerido antes de la separación de fases y la inclusión de un inhibidor de la ribonucleasa en la solución de ARN. Usando estas y otras modificaciones, aislamos rutinariamente el ARN con un número de integridad de ARN (RIN) superior a 7. El ARN aislado es de calidad adecuada para el análisis rutinario de la expresión génica. La adaptación de este protocolo para aislar el ARN de los tejidos ricos en ribonucleasa además del páncreas debería ser fácilmente alcanzable.
Introducción
Se requiere Aislamiento de ARN con una alta integridad para los experimentos de biología molecular de rutina, como el norte de borrones 9, QRT-PCR 1 o perfiles de expresión genética 5. La mayoría de los métodos contemporáneos de aislamiento de ARN se basan en modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina 2, 3. Tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y se interrumpir efectivamente la actividad de la ribonucleasa bajo la mayoría de condiciones. El método popular de Chomczynski y Sacchi 3 combinó fenol a la solución de tiocianato de guanidina de lisis, lo que reduce el tiempo....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación
Las siguientes prácticas se adhieren a las políticas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Institución (IACUC).
- Se recomienda aislar a no más de 6 páncreas de ratón en un día determinado. Tener todos los instrumentos quirúrgicos limpios y esterilizados en autoclave, un juego por animal.
- Marque todos los tubos de microcentrífuga. Cuatro tubos de 2 ml por animal.
- Coloque 8 ml de reactivo de lisis en 50 ml tubos de centrífuga en hielo. Nota: Mientras que el kit de purificación viene con un reactivo de fenol de tiocianato de guanidina que es adecuado para el aislamient....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El rendimiento total de ARN a partir de 1 ml de homogeneizado de lisis es 20-40 mg. OD 260/280 ratios son típicamente alrededor de 2.0 y el RIN son consistentemente superior a 7,0. Si el RIN es ≤ 6, será necesario repetir el aislamiento. De vez en cuando, se consigue un RIN que es mayor que 8,0.
Los dos métodos más utilizados de la eutanasia de los ratones antes de la extracción del páncreas son asfixia de CO 2 o la inhalación de isoflurano. Ambas técnicas son seguidos por disloca.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aislar ARN de tejidos que se ribonucleasa rico representa un gran reto para los experimentos de biología molecular. Varios reactivos y kits están disponibles en el mercado que se basan principalmente en el método de tiocianato de guanidina fenol de la extracción de RNA. Tiocianato de guanidina desnaturaliza la proteína y por lo tanto reduce la actividad de la ribonucleasa. Sin embargo, la magnitud de la ribonucleasa en el páncreas requiere modificaciones adicionales a los protocolos estándar de aislamiento de ARN. Un pr.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo y Satyanarayana Rachagani por sus útiles comentarios, sugerencias y compartir sus protocolos. Este trabajo fue apoyado por U01CA111294 subvención y un premio de desarrollo de la idea del Programa de Investigación Intramural la Universidad Estatal de Ohio.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Potencia Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogeneizador |
| 5424R | Eppendorf | Microcentifuge refrigerado | |
| Reactivo Trizol | Reactivo Invitrogen | 15596018 | Lysis |
| Student Tijeras de resorte Vannas | Fisher | 91500-09 | Se usa para cortar el páncreas de los tejidos adheridos |
| Tijeras quirúrgicas, 6 pulgadas | Fisher | 08-951-20 | Úselas para cortar el espolón del ratón |
| Pinzas de punta roma | Fisher 1381239 | Úselas para sostener el páncreas mientras disecciona | |
| Isoflurano USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µ l) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivador |
| HPLC grado de agua | Fisher | W5-4 | Para el lavado de cuchillas homogeneizadoras |
| Agua de grado de biología molecular | Hyclone | SH30538.03 | Elución de ARN |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Kit |
| de purificaciónTubos de microcentrífuga de 2 ml, certificados Rnase Libre de dnasa | EE. UU. Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| Tubos de centrífuga de 15 ml Falcon | 352099 | ||
| 70% etanol | Fisher | ||
| 100% etanol | Fisher | ||
| 200 µ l puntas de pipeta | Rainin | GPL200F | Para la limpieza de cuchillas homogeneizadoras |
| Cloroformo | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Espectrofotómetro |
| Bioanalizador | Agilent | Analizador de electroforesis capilar para medir la integridad | |
| ARN RNAlater | Ambion | Reactivo de estabilización de ARN | |
| RNfácil columnas de centrifugación | Columnas Qiagen | Spin como parte del kit miRNeasy Mini | |
| Ratones | Chales River | Strain C57BL/6 | Su edad oscilaba entre los 4 y los 12 meses. |
| Ratones | Jackson Lab | cepa 129 | Su edad oscilaba entre los 4 y los 12 meses. |
Referencias
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
