Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

Resumen

Presentamos un procedimiento para aislar ARN con alta integridad del páncreas de ratón rico en ribonucleasa.

Resumen

El aislamiento de ARN de alta calidad de tejido rico en ribonucleasa, como el páncreas de ratón, presenta un desafío. Como una función principal del páncreas es ayudar en la digestión, el páncreas de ratón puede contener hasta 75 mg de ribonucleasa. Informamos sobre modificaciones de los protocolos estándar de reactivos de lisis de tiocianato de fenol/guanidina para aislar el ARN del páncreas de ratón. El tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y interrumpirá eficazmente la actividad de la ribonucleasa en la mayoría de las condiciones. Sin embargo, son necesarias modificaciones críticas en los protocolos estándar para aislar con éxito el ARN de los tejidos ricos en ribonucleasa. Los pasos clave incluyen una alta proporción de reactivo de lisis a tejido, la eliminación del tejido no digerido antes de la separación de fases y la inclusión de un inhibidor de la ribonucleasa en la solución de ARN. Usando estas y otras modificaciones, aislamos rutinariamente el ARN con un número de integridad de ARN (RIN) superior a 7. El ARN aislado es de calidad adecuada para el análisis rutinario de la expresión génica. La adaptación de este protocolo para aislar el ARN de los tejidos ricos en ribonucleasa además del páncreas debería ser fácilmente alcanzable.

Introducción

Se requiere Aislamiento de ARN con una alta integridad para los experimentos de biología molecular de rutina, como el norte de borrones ^9, QRT-PCR ¹ o perfiles de expresión genética ^5. La mayoría de los métodos contemporáneos de aislamiento de ARN se basan en modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina ^{2, 3.} Tiocianato de guanidina es un fuerte desnaturalizante de proteínas y se interrumpir efectivamente la actividad de la ribonucleasa bajo la mayoría de condiciones. El método popular de Chomczynski y Sacchi ³ combinó fenol a la solución de tiocianato de guanidina de lisis, lo que reduce el tiempo de aislamiento a aproximadamente 4 horas. Muchos reactivos de extracción de ARN comercialmente disponibles se basan en el método de Chomczynski y Sacchi ^3.

Ribonucleasa tejidos ricos como humano o de ratón páncreas presenta un desafío adicional para el aislamiento de ARN. Ratón páncreas puede contener hasta 75 mg de ribonucleasa ⁶ algunos de los cuales se dará a conocer During interrupción del tejido pancreático que resulta en la autolisis de los tejidos. Las modificaciones de los protocolos de tiocianato de guanidina se han utilizado con éxito para aislar ARN a partir de páncreas con alta integridad ^{2, 4, 7, 10.} Infusión de ARN de estabilización reactivo en páncreas de ratón aislamiento facilitado de ARN con alta integridad ^{4, 7, 10,} sin embargo infusión de soluciones en el páncreas requiere una gran habilidad, pueden requerir instrumentos especializados tales como un microscopio de disección y alterar la arquitectura del tejido durante el procedimiento puede resultar en la lisis celular. Perfusión tisular con el reactivo de estabilización de ARN podría interferir con otras aplicaciones como el aislamiento de proteínas y la tinción histológica. Además, esta técnica no es adecuada para el aislamiento de ARN a partir de páncreas humano. Otros protocolos requieren la preparación de soluciones específicas del investigador ^2.

Se presenta un protocolo para aislar ARN con una alta integridad de páncreas de ratón. Thprotocolo de correo utiliza elementos de los métodos publicados anteriormente y se basa en gran parte de los protocolos de reactivo de lisis estándar de fenol / guanidina basado en tiocianato. No requiere la preparación de soluciones especializados ni requiere la infusión de los reactivos en el páncreas. Los pasos críticos para el aislamiento de ARN éxito incluyen un fenol alta / a base de guanidina lisis reactivo proporción de tejidos, extracción de tejido no digerido antes de la separación de fases y la inclusión de un inhibidor de ribonucleasa a la solución de ARN resultante. El uso de estas y otras modificaciones, que típicamente aislar el ARN con Rin mayor que 7 para ser utilizado para el análisis de la expresión génica de rutina.

Protocolo

1. Preparación

Las siguientes prácticas se adhieren a las políticas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Institución (IACUC).

1. Se recomienda aislar a no más de 6 páncreas de ratón en un día determinado. Tener todos los instrumentos quirúrgicos limpios y esterilizados en autoclave, un juego por animal.
2. Marque todos los tubos de microcentrífuga. Cuatro tubos de 2 ml por animal.
3. Coloque 8 ml de reactivo de lisis en 50 ml tubos de centrífuga en hielo. Nota: Mientras que el kit de purificación viene con un reactivo de fenol de tiocianato de guanidina que es adecuado para el aislamiento páncreas, reactivo de lisis se utiliza debido a los grandes volúmenes que son necesarios por el aislamiento.
4. Vierta aproximadamente 10 ml de las siguientes soluciones en 15 ml tubos de centrífuga para la limpieza de las cuchillas del homogeneizador. Etanol, 70% (2 tubos), agua de calidad HPLC (1 tubo) y agua de grado HPLC que contiene aproximadamente 200 l de RNasa visitante o inactivador ribonucleasa equivalente.

2. Cirugía, Dissection Páncreas y homogeneización

1. Coloque 1.2 ml de isoflurano en un frasco que contiene gasa de algodón o toallas de papel. Los ratones se colocan en una plataforma que les impide alcanzar la fuente de la isoflurano. Añadir isoflurano fresca en la jarra antes de anestesiar cada ratón.
2. Con cuidado, coloque el ratón en el frasco que contiene el isoflurano. Tapar el frasco y controlar los efectos de la anestesia, girando suavemente el frasco de un lado a otro. El animal se anestesia una vez que está en incapaz de soportar en su 'propia.
3. Para la confirmación de la anestesia, retire al animal del frasco y aplicar una pizca dedo del pie firme. Si el ratón no reacciona a la pizca dedo del pie, siga en el paso 2.5.
4. Si el ratón reacciona a la pizca dedo del pie, a continuación, repita los pasos 2.2 hasta 2.3.
5. Colocar el animal anestesiado en la mesa de trabajo en la posición prona. Dislocar el cuello uterino de ratón por fuerza colocando la mano izquierda sobre el cuello uterino de ratón. Nosotrosción de la mano derecha agarre la cola del ratón y tire hacia arriba de forma rápida a un ángulo aproximado de 45 ° para dislocar el cuello del útero.
6. Fije la carcasa a una superficie (una pieza nivel de espuma de poliestireno cubierta con toallas de papel) por la perforación de cada uno de cuatro patas de los animales en la superficie plana usando calibre 25 agujas hipodérmicas.
7. El uso de instrumentos quirúrgicos estériles, cortar la sección media del ratón abierta y rápidamente extirpar el páncreas del ratón. Utilice las pinzas para sujetar el páncreas y cortarlo del bazo y el intestino delgado utilizando tijeras de primavera. Tenga cuidado de no estirar el páncreas durante la eliminación del uso del ratón. La alteración del tejido podría liberar ribonucleasa. Nota: El tiempo que se necesita para extirpar el páncreas del ratón es crítica. Un experto en la materia debe ser capaz de diseccionar el páncreas en aproximadamente 1 min o menos.
8. Coloque todo el páncreas en un tubo de 50 ml que contiene 8 ml de hielo reactivo de lisis frío. Tapar el tubo y agitar brevemente para sumergir el tiN ú mero en el reactivo y proceder a la siguiente etapa sin demora. La proporción de reactivo de lisis a los tejidos es crítico. Ver la sección de resultados para una comparación de la integridad del ARN aislado usando diferentes volúmenes de reactivo de lisis.
9. Homogeneizar durante 5 seg. Es importante presionar las cuchillas homogeneizador para la parte inferior del tubo de centrífuga para permitir que el tejido sea arrastrado hacia las cuchillas para la homogeneización eficiente.

3. Eliminación de tejido no digerido

Nota: Después de la homogeneización, pequeños trozos de tejido se mantendrán en el reactivo de lisis. Es más importante para lisar rápidamente el tejido dejando algo de tejido sin digerir en lugar de sobre la homogeneización y la degradación riesgo de ARN.

1. Transferencia de 2 ml de reactivo de lisis que contiene el páncreas lisadas a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Recoge dos tubos de microcentrífuga de homogeneizado por el aislamiento. Deseche el material homogeneizado restante o almacenar a -80 ° C para futuros estudios.
2. Centavorifuge a 4 º C, 12000 × g durante 5 min para sedimentar el tejido no digerido. Este es un paso crítico como el arrastre de tejido no digerido en soluciones posteriores de ARN probablemente contamine la muestra con ribonucleasa (paso 5,13).
3. Transferencia de 1 ml del sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Proceda con el aislamiento inmediato y guarde el tubo de réplica a -80 ° C para su uso futuro. Coloque todos los tubos que contienen homogeneizado en hielo húmedo mientras se procede al siguiente paso.
4. Deseche el reactivo de lisis restante en un recipiente para desechos químicos apropiados.

4. Limpieza de las cuchillas Homogeneizador

1. Antes de proceder a la siguiente aislamiento, limpiar las cuchillas homogeneizador colocándolos en 10 ml de etanol al 70%. Active el homogeneizador por alrededor de 20 segundos para quitar cualquier pedazo de tejido que pueden estar atrapados en las cuchillas.
2. Utilice una punta de pipeta de 200 l para eliminar las piezas que permanecen en las cuchillas homogeneizador.
3. Repita el paso 4.1 en el agua, en general inactivador Rnase y etanol al 70%. Secar el eje homogeneizador con una toallita limpia Kim.
4. Repita el paso 2.1 para el aislamiento del páncreas de los animales restantes, manteniendo ARN aislado de cada animal por separado en lugar de puesta en común de la ARN.

5. Aislamiento de ARN

La siguiente sección es idéntica a el protocolo del kit de purificación. La ventaja de el kit de purificación es que va a aislar el ARN total, incluyendo pequeños RNAs.

1. Si se utiliza la solución homogeneizado congelado, descongelar en hielo húmedo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Añadir 200 l de cloroformo, tapar el tubo y agitar enérgicamente a mano durante 15 segundos. Deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante 2-3 min.
3. Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 xg, 4 º C
4. Transferir la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Añadir 1,5 volúmenes de isopropanol y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
5. Traslado hasta el 700 l de la muestra en una columna de centrifugación que se coloca en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a 8000 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
6. Deseche el flujo directo.
7. Repetir los pasos 5.5 a 5.6, utilizando el resto de la muestra.
8. Añadir 700 l Buffer TAR a la columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo directo.
9. Pipetear 500 l de tampón RPE en la columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g para lavar la columna. Deseche el flujo directo.
10. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación. Centrifugar durante 2 min a 8000 xg para secar la columna.
11. Transferir la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear 80 l de agua libre de ribonucleasa directamente sobre la membrana de la columna de centrifugación. Centrifugar durante 1 min a 8000 xg para eluir el ARN.
12. Añadir 1 l inhibidor de RNasa a la solución de ARN. Almacenar a -80 ° C o proceder a 5.13.
13. Para validar la integridad del ARN, primero calcular la conce ARNntration y 260/280 escala utilizando un espectrofotómetro.
14. Diluir una porción de la solución de ARN a aproximadamente 500 ng / l con agua de grado de biología molecular.
15. Determinar el ARN integridad (es decir, RIN) utilizando el análisis de electroforesis capilar. Aproximadamente 5 l de solución de ARN es suficiente para el análisis.
16. Alícuota de la solución de ARN (véase la Figura 2) y se almacena a -80 ° C.

Resultados

El rendimiento total de ARN a partir de 1 ml de homogeneizado de lisis es 20-40 mg. OD 260/280 ratios son típicamente alrededor de 2.0 y el RIN son consistentemente superior a 7,0. Si el RIN es ≤ 6, será necesario repetir el aislamiento. De vez en cuando, se consigue un RIN que es mayor que 8,0.

Los dos métodos más utilizados de la eutanasia de los ratones antes de la extracción del páncreas son asfixia de CO ₂ o la inhalación de isoflurano. Ambas técnicas son seguidos por disloca...

Discusión

Aislar ARN de tejidos que se ribonucleasa rico representa un gran reto para los experimentos de biología molecular. Varios reactivos y kits están disponibles en el mercado que se basan principalmente en el método de tiocianato de guanidina fenol de la extracción de RNA. Tiocianato de guanidina desnaturaliza la proteína y por lo tanto reduce la actividad de la ribonucleasa. Sin embargo, la magnitud de la ribonucleasa en el páncreas requiere modificaciones adicionales a los protocolos estándar de aislamiento de ARN. Un pr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Potencia Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogeneizador
5424R	Eppendorf		Microcentifuge refrigerado
Reactivo Trizol	Reactivo Invitrogen	15596018	Lysis
Student Tijeras de resorte Vannas	Fisher	91500-09	Se usa para cortar el páncreas de los tejidos adheridos
Tijeras quirúrgicas, 6 pulgadas	Fisher	08-951-20	Úselas para cortar el espolón del ratón
Pinzas de punta roma	Fisher 1381239		Úselas para sostener el páncreas mientras disecciona
Isoflurano USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µ l)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivador
HPLC grado de agua	Fisher	W5-4	Para el lavado de cuchillas homogeneizadoras
Agua de grado de biología molecular	Hyclone	SH30538.03	Elución de ARN
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Kit
de purificaciónTubos de microcentrífuga de 2 ml, certificados Rnase Libre de dnasa	EE. UU. Scientific Plastics	1620-2700
Tubos de centrífuga de 15 ml Falcon		352099
70% etanol	Fisher
100% etanol	Fisher
200 µ l puntas de pipeta	Rainin	GPL200F	Para la limpieza de cuchillas homogeneizadoras
Cloroformo	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Espectrofotómetro
Bioanalizador	Agilent		Analizador de electroforesis capilar para medir la integridad
ARN RNAlater	Ambion		Reactivo de estabilización de ARN
RNfácil  columnas de centrifugación	Columnas Qiagen		Spin  como parte del kit miRNeasy Mini
Ratones	Chales River	Strain C57BL/6	Su edad oscilaba entre los 4 y los 12 meses.
Ratones	Jackson Lab	cepa 129	Su edad oscilaba entre los 4 y los 12 meses.

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