Varios biomarcadores patológicos no pueden ser fácilmente detectados por las técnicas actuales debido a su baja concentración en fluidos biológicos, la presencia de enzimas degradantes y grandes cantidades de proteínas de alto peso molecular. Las nanopartículas de hidrogel funcionalizadas químicamente pueden recolectar, preservar y concentrar proteínas de baja abundancia, lo que permite la detección de biomarcadores previamente indetectables.
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Artículo de método
Hidrogel Nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia
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En este artículo
Resumen
Resumen
El descubrimiento de biomarcadores Novela juega un papel crucial en la prestación de detección de la enfermedad más sensible y específica. Desafortunadamente muchos biomarcadores de baja abundancia que hay en fluidos biológicos no pueden ser fácilmente detectados con espectrometría de masas o inmunoensayos, ya que están presentes en muy baja concentración, son lábiles, y son a menudo enmascarados por proteínas de alta abundancia tales como albúmina o inmunoglobulina. Bait contiene poli (N-isopropilacrilamida) (Nipam) nanopartículas a base son capaces de superar estas barreras fisiológicas. En un paso que son capaces de captar, concentrar y preservar biomarcadores de fluidos corporales. -Analitos de bajo peso molecular entran en el núcleo de la nanopartícula y son capturados por diferentes tintes químicos orgánicos, que actúan como cebos de proteína de alta afinidad. Las nanopartículas son capaces de concentrar las proteínas de interés en varios órdenes de magnitud. Este factor de concentración es suficiente para aumentar el nivel de proteína de tal manera que las proteínas están dentro de lalímite de detección de los espectrómetros de masas actuales, el Western Blot, e inmunoensayos. Las nanopartículas se pueden incubar con una plétora de fluidos biológicos y que son capaces de enriquecer en gran medida la concentración de proteínas y péptidos de bajo peso molecular mientras que excluye la albúmina y otras proteínas de alto peso molecular. Nuestros datos muestran que una amplificación de 10.000 veces en la concentración de un analito particular se puede lograr, lo que permite espectrometría de masas y los inmunoensayos para detectar biomarcadores previamente indetectables.
Introducción
A pesar de la finalización de la secuenciación del genoma humano, no se ha logrado avances significativos en la identificación de biomarcadores predictivos de la enfermedad en etapa temprana, o que se correlacionan con el resultado terapéutico o pronóstico 1. Una razón para esta falta de progreso es que existen muchas biomarcadores potencialmente significativos a una concentración por debajo del límite de detección de espectrometría de masas convencional y otras plataformas de descubrimiento de biomarcadores. Espectrometría de masas (MS) y Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) tienen una sensibilidad de detección típicamente mayor que 50 ng / ml, mientras q....
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Protocolo
El plasma humano y se recogió la orina de donantes voluntarios sanos, con el consentimiento informado por escrito, después de George Mason University Institutional Review Board aprobó protocolos. Los donantes se distribuyeron por igual entre hombres caucásicos y mujeres entre las edades de 25 y 42 muestras fueron analizadas de forma individual y no se agruparon.
1. Nanoparticle Procesamiento de suero o plasma Muestras
Biomarcadores abundantes bajas potenciales en plasma son capturados, en solución, con nanopartículas de hidrogel. Las partículas se añaden al plasma, se incubaron, separadas por centrifugación, se ....
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Resultados
Hidrogel Nanoparticle Tamaño y Uniformidad
Poli (Nipam-AAC) partículas se han producido con muy alto rendimiento y reproducibilidad entre y dentro de los lotes. Las partículas tienen muy buena estabilidad coloidal a temperatura ambiente durante el tiempo necesario para la captura, almacenamiento, y la elución de las proteínas (por lo menos 48 h), y la precipitación de nanopartículas no se ha observado (Figura 1) 11. La estabilidad coloidal puede s.......
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Discusión
Importancia clínica
Se cree que una muestra de suero o plasma para contener baja abundancia de proteínas y péptidos que pueden proporcionar una rica fuente de información sobre el estado del organismo en su conjunto en circulación. A pesar de la promesa de la proteómica en suero, hay tres barreras fisiológicas fundamentales y serios que frenan el descubrimiento de biomarcadores y la traducción al beneficio clínico 10, 11, 16, 25.
Puede.......
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Divulgaciones
Benjamin Espina es un empleado de Ceres Nanosciences, Inc. que produce los reactivos utilizados en este artículo. Lance Liotta, Alessandra Luchini y Virginia Espina son titulares de patentes (patente estadounidense 7.935.518 y/o 8.497.137) sobre la tecnología de nanopartículas utilizada en este artículo. Como empleados de la universidad, tienen derecho a recibir regalías de estas patentes según la política de la universidad. Lance Liotta y Alessandra Luchini son accionistas de Ceres Nanosciences y forman parte del Consejo Asesor Científico.
Agradecimientos
Michael Henry, Dublin City University, amablemente ayudó con la recopilación de datos y el análisis se muestra en la Figura 5. Este trabajo fue apoyado en parte por (1) George Mason University, (2) el italiano IstitutoSuperiore di Sanita 'en el marco de la Italia / EE.UU. convenio de colaboración entre el Departamento de Salud y Servicios Humanos, la Universidad George Mason, y el Ministerio de Salud Pública italiana, (3) de los NIH, subvenciones del programa IMAT 1R21CA137706-01 y 1R33CA173359-01 a LAL, y (4) Nanociencias Ceres, Inc .
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nanopartículas de hidrogel | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP partículas |
| 18 MΩ-cm de agua | grado reactivo tipo 1 | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrilo | BDH | BDH1103-4LP | Disponible en VWR |
| Hidróxido de amonio NH4OH | BDH | BDH3014 | Disponible en VWR, ensayado al 28-30 % de NH3 |
| tiocianato de sodio 25 mM | Acros Organics | 419675000 | Para muestras de suero/plasma |
| Tiras de reactivos de orina multianalito | Siemens | 2161 | Para muestras |
| de orina Tampón de muestra Tris-Glycine SDS (2X) | Life Technologies | LC2676 | Úselo en RT para evitar que el SDS precipite |
| Incubadora de baño seco (100 oC) con bloque calefactor | Barnstead | 11-715-125DQ | No sustituya un baño de agua hirviendo |
| Colector del evaporador de nitrógeno | Organomation Associates | Microvap118 | Para muestras de suero/plasma |
| Centrífuga, rotor basculante | Sorvall | Legend Capacidad | tubo de 50 ml, rcf 3.700 x g |
| Centrífuga, rotor de ángulo fijo | Eppendorf | 5424 | Capacidad de microcentrífuga de 1,7 ml, rcf 16.000 x g |
| centrífuga cónica de 50 ml tubos | Fisher Scientific | 14-432-22 | Con tapón de rosca para muestras de orina |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Mezclador | 22363204 | |
| Fisher Scientific | 50-949-755 | ||
| Temporizador | Fisher Scientific | S04782 | Segundos/minutos |
Referencias
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.<....
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Reimpresiones y permisos
