Abstract
新規バイオマーカーの発見は、より高感度かつ特異的な疾患検出を提供する上で重要な役割を果たしている。それらは、非常に低濃度で存在する不安定であり、しばしば、アルブミンまたは免疫グロブリンのような高量のタンパク質によってマスクされるため、残念ながら、生物学的流体中に存在する多くの低存在量のバイオマーカーは、容易に、質量分析またはイムノアッセイを用いて検出することができない。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（NIPAM）ベースのナノ粒子を含有する餌は、これらの生理学的障壁を克服することができる。一工程において、それらは、捕捉し濃縮して、体液からのバイオマーカーを保持することができる。低分子量の分析物は、ナノ粒子のコアに入り、高親和性タンパク質ベイトとして作用する異なる有機化学色素によって捕捉される。ナノ粒子は、数桁目的のタンパク質を集中することができます。この濃縮係数は、タンパク質が範囲内にあるように、タンパク質レベルを増加させるのに十分である現在の質量分析計、ウェスタンブロッティング、および免疫アッセイの検出限界。ナノ粒子は、生物学的流体の過多とインキュベートすることができ、それらは、アルブミンおよび他の高分子量蛋白質を除外して大幅に低分子量タンパク質およびペプチドの濃度を豊かにすることができる。本発明者らのデータは、以前に検出できないバイオマーカーを検出するために質量分析および免疫アッセイを可能にする、特定の分析物の濃度の10,000倍の増幅が達成できることを示している。
Introduction
ヒトゲノムシークエンシングの完了にもかかわらず、かなりの進歩が早期の疾患の予測バイオマーカーの同定に行われていない、またはそれは、治療転帰または予後1と相関する。進歩の欠如の一つの理由は、多くの潜在的に重要なバイオマーカーが従来の質量分析法および他のバイオマーカー発見プラットフォームの検出限界未満の濃度で存在することがある。質量分析（MS）および多重反応モニタリング（MRM）は、分析物の大部分は50 pg / mlで、および10ng / mlの間の範囲の臨床検査秋にイムノアッセイによって測定しながら、ng / mlで50より典型的には検出感度を持つ。これは、特に疾患の早期段階における多くのバイオマーカーは、従来のMS及びMRM 2により検出できないことを意味する。さらに、このような複雑な生物学的流体中のアルブミンおよび免疫グロブリンのような高量のタンパク質の存在は、しばしば10億倍販売によってマスクエス低存在量、低分子量タンパク質およびペプチド3、図4に示すように 、このためいくつかのサンプル準備ステップは、質量分析配列決定および同定の前に必要とされる。そのような準備工程は、市販の空乏列5-8の高存在量タンパク質の枯渇を採用しています。それらはしばしば、非共有結合的に削除されるキャリアタンパク質と関連しているので、残念ながら、このステップは、候補バイオマーカーの歩留まりの低下につながる。サンプルが収集されると別の課題は、候補バイオマーカーex vivoでの安定性により表される。タンパク質は、内因性または外因性のプロテアーゼ9による分解を受けやすい。分解10-13からタンパク質を保護しながら、ヒドロゲルのナノ粒子は、アッセイの範囲内のレベルまでの推定バイオマーカーの濃度を増幅することにより、これらの重要な課題を超越することができる。
それは、目に注意することが重要ですLMWで血液中のタンパク質は、小さな完全なタンパク質だけでなく、大規模なタンパク質の断片の混合物である。 60kDaのより大きな組織由来のタンパク質は、受動的に、血管基底膜を通って血流に入るには大きすぎるが、それらはペプチドまたはタンパク質断片14として血液中に表すことができる。私たちの目標は、疾病の早期発見、治療のために患者の層別化、および治療に対する応答をモニターするための候補となり得る新規の循環バイオマーカーを測定することである。当社のナノ粒子は、同時により小さなタンパク質およびペプチドを捕捉し、出発容量に応じて、100倍にそれらを集中しながら、選択的に、高存在量の免疫グロブリンとアルブミンを除外するために作成されます。
当社グループは、成功し、タンパク質およびペプチドのための高親和性高分子の餌として作用することができる小さな有機色素のセットを同定した。タンパク質 - 色素結合、疎水性及び静電的相互作用の組合せに起因すると考えられているS。タンパク質表面11上の疎水性ポケットを経由してタンパク質と色素のインターリーブ上の芳香環。
餌は、それらの化学的性質に応じて、分析物の選択されたクラスに対して特定の親和性を示す。餌は、タンパク質またはペプチドを、アルブミンなどのキャリアタンパク質と競合する。粒子中に捕捉される低分子量タンパク質/ペプチド。例えば、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの高分子量タンパク質に起因ヒドロゲル11（図1）の制限のため、細孔にふるい分け能力の粒子に侵入することを防止している。
ヒドロゲルのナノ粒子は、過硫酸アンモニウム11によって開始沈殿重合により合成される。 N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）は、アクリル酸（AAC）およびアリルアミン（AA）及び架橋剤N、N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS）のコモノマー、希釈条件1を 6時間70℃で反応させ1,13。共有結合を介してナノ粒子にアミノ基含有染料（ すなわち 、sulfonatedanthraquinonetriazine染料）を組み込むことによって達成ポリ親和性（N-イソプロピルアクリルアミド-コ-アクリル酸）（ポリ（NIPAM-コ-AAC）nanoparticlesis結合高タンパク質染料11、13の親水性/疎水性特性に依存して水性または有機溶媒中で実施アミド化反応。anthraquinonetriazine色素の塩素原子を有するナノ粒子中のアミン基の求核置換は、色素含有ポリ（NIPAMを作成するために利用されるコ-アリルアミン）（AA）は、11ナノ12。二段階の重合プロセスは、ビニルスルホン酸（VSA）11,13の外殻を含むヒドロゲルのナノ粒子を作成するために利用される。
ヒドロゲル粒子は、全血、血漿、血清、脳脊髄液、汗、および尿を含むさまざまな生物学的液体に適用することができる。ワンステップで、溶液中で、nはanoparticlesは（数分以内）急速隔離および低分子量の濃度は10、11、13、15-18分析物行う。タンパク質は、続いて19-21、質量分析法10、11、13、15、18、22、23、イムノアッセイ/ ELISA 10、11、15、18、または逆相タンパク質マイクロアレイ16を、ウェスタンブロッティング用いてナノ粒子から溶出し、検出され24アッセイ。化学餌で官能ナノ粒子と、コアまたはコアシェル·アーキテクチャを提示するには、餌/シェルの物理化学的特性に基づいてタンパク質を捕捉し、濃縮する。ナノ粒子に組み込まれた別の染料は、したがって、色素親和性に基づいて効率、溶液のpH、高濃度タンパク質13、競合の存在/不在を変化させて、タンパク質の異なるサブセットを捕捉するであろう。さらに、溶液の体積に対するナノ粒子の量は、ナノ粒子からのタンパク質収量に影響する。これらの態様のハイドロゲルナノ粒子収穫は、タンパク質を大量に含有して血漿サンプルから、典型的には大量のタンパク質を含まない尿サンプルからタンパク質を回収するための3つの異なるナノ粒子ベイトを用いて実証されている。このプロトコルでは、収穫およびポリ（NIPAM-コ-AAC）、ポリ（NIPAM /染料）、及びコア - シェル型ナノ粒子を用いて血漿サンプルからの腫瘍壊死因子α（TNFα）の濃縮を実証する（ポリ（NIPAM - コ - VSA）） 。ポリ（NIPAM /色素）のナノ粒子は、 結核菌感染個体を模倣するために、ヒト尿サンプルに添加したマイコバクテリウム種の抗原を濃縮することが示されている。
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Protocol
ヒト血漿および尿がジョージ·メイソン大学施設内倫理委員会は、プロトコールを承認した後に、書面によるインフォームドコンセントを、健康なボランティアドナーから採取した。寄付者は、同様に個別に分析された25および42の試料歳の間白人、男性と女性の間に分布し、プールされませんでした。
血清または血漿検体の1ナノ加工
血漿中に潜在的な低豊富なバイオマーカーは、ハイドロゲルナノ粒子で、溶液中で、捕獲されている。粒子は、血漿に添加し培養し、遠心分離によって分離し、洗浄し、捕捉されたタンパク質が溶出されている。溶出したタンパク質は、下流の質量分析配列決定および同定のための窒素気流下で乾燥させる。
- マイクロチューブに50mMのトリスHCl pHが7（500μlの血清+500μlのトリスHCl）で2：血清1500μlの希釈する。
- 500μLのポリ（NIPAM / AAC）コアnanopを追加記事。 RTで15分間インキュベートする。
- 固定角ローターを備えた遠心分離機で10分間、16,100×gで、25℃でサンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
- ペレットに500μlのチオシアン酸ナトリウム（25 mm）を追加します。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。
- 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
- ナノ粒子ペレットにMilliQ水を500μlを加える。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。
- 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。上清を除去し、廃棄する。
- 新鮮な溶出バッファーを準備します。清潔なチューブ内の300μlの水酸化アンモニウムを700μlのアセトニトリルを加える。注意：水酸化アンモニウムが腐食性である。適切な換気をすること。注：溶出緩衝液は、予備校でなければなりません使用直前にared。溶出バッファーを保管しないでください。
- ナノ粒子ペレットに溶出バッファーを300μlを加える。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。 RTで15分間インキュベートする。
- 固定角ローターと遠心機中で10分間、16,100×gで25℃、サンプルをスピン。きれいな、ラベルされたマイクロチューブに溶出液を取り出し、保存してください。
- 1.10 - を繰り返して、1.9を繰り返します。 1マイクロ遠心チューブに2溶出液を組み合わせる。
- 8（ 図2F）に設定し、空気流で、42.1℃の窒素蒸発器マニホールド内の窒素気流下で溶出液を乾燥させる。
- O / N個の保存のために室温で乾燥させ、溶出液を保管したり、長期保存のために-20℃、での質量分析、ウェスタンブロッティング、またはELISAアッセイ（オプション）の前に。
尿サンプルの2ナノ加工
正常な尿未満では30mg / dlのタンパク質を含有し1 +血液よりも少ない。しかし、多くの疾患/状態は、尿タンパク、血液の正常なレベルを変化させることができる。尿サンプルに追加するナノ粒子の最適な量を決定するのを助けるために、尿検査は、ナノ粒子の収穫に先立って行われる。尿バイオマーカーは、尿量にナノ粒子の比率を最適化する必要があり、極めて低濃度で存在することができる。この手順は、下流のウェスタンブロット分析のための尿サンプルのナノ粒子収穫を記述する。
- 清潔で乾燥したプラスチック製のカップに尿サンプルを収集します。 22ミリリットル最小体積が必要です。分析する直前まで、-80℃で保存する尿検体。
- RTで、または4℃CO / Nで凍結した尿を解凍する。ボルテックスミキサーで簡単にミックス。 50ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブに尿を少なくとも22ミリリットルを注ぐ。
- 15分間3,700×gで、スイングアウトローターを遠心分離器で尿をスピン。清潔な50mlコニカルボトムpolyprに、ペレットを乱すことなく、尿をデカントopyleneチューブ。ペレットを捨てる。
- 多検体 "尿ディップスティック」試薬ストリップを使用して尿検査を行います。注意：直射日光を避け、湿度17から密閉容器内で18を試薬ストリップを格納します。
- 清潔で乾燥したペーパータオル上、試薬ストリップ、フェイスアップにして置きます。
- ステップ2.3で調製した尿1ミリリットルを吸引する使い捨てピペットを使用してください。
- 2分間タイマーを設定し、それを起動しないでください。試薬ストリップの各テストパッドの上に尿を2滴 - すばやく1を分注する。すぐにタイマーを開始。注：尿容器内に直接試薬ストリップを水没しないでください。試薬ストリップ中の染料/化学的指標は、潜在的に尿容器に試薬ストリップから浸出することができます。
- 試薬ストリップ容器に記載されている時には、対応する色分けされたインディカに個別の試薬ストリップの色を比較することにより、試薬ストリップ上のさまざまな分析物について定性的な結果を記録試薬容器上の役。典型的な正常な尿の結果は以下のとおりです（正常または負）血液、タンパク質、白血球、亜硝酸塩、グルコース、ケトン、ビリルビン、およびウロビリノーゲンのために;尿pH（5.5から7.0）;比重（1.001から1.020）。注：尿試料での高タンパク質レベルは、ナノ粒子上の結合部位について目的のタンパク質と競合しうる。ナノ粒子を有するタンパク質収穫を最大にするために、ナノ粒子の体積/尿の体積比は、高存在量タンパク質のいずれかから限界競争に調整することができる、または非常に低濃度で存在するタンパク質を採取することに最適化することができる。尿タンパクの値が1 +以上の場合、ステップ2.5未満で、ナノ粒子の2倍のボリュームを追加する。目的の分析物が非常に低い豊富なタンパク質である場合、それを2ml（図3）までのナノ粒子の体積を増加させる必要があるかもしれない。
- 転送クリーン50ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブにステップ2.3から明確に尿を20ミリリットル。しないでください尿管の底部であってもよく、任意の破片/ペレットを乱さ。 20ミリリットルの尿サンプルにナノ粒子を200μlを追加。ボルテックスミキサーで簡単にミックス。尿タンパク値が1+以上の場合、20ミリリットルの尿へのナノ粒子の400μlのを追加してください。
- ロッキング/ミキシングすることなく、室温で30分間の尿/ナノ粒子混合物をインキュベートする。
- 10分間3,700×gで、スイングアウトローターを装備した遠心分離機中尿/ナノ粒子懸濁液をスピン。注：ペレットが見え、次の遠心分離がない場合は、追加の2のためのサンプルをスピン - 7分。
- 上清を除去し、廃棄する。ナノ粒子ペレットに500μlのミリQ水を加える。
- 精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにナノ粒子溶液を転送します。
- 10分間16,100×gで固定ローターを装備した遠心分離機でナノ粒子をスピン。注：ペレットが見えFOLされていない場合7分 - 遠心分離をlowing、さらに2のためのサンプルをスピン。
- 上清を除去し、廃棄する。
- 繰り返してナノ粒子を洗浄するために200μlの18ミリQ水（2回）2.8と2.11を繰り返します。
- 新鮮な溶出バッファーを準備します。清潔なチューブ内の30μlの水酸化アンモニウムに970μlのアセトニトリルを加える。注意：水酸化アンモニウムが腐食性である。適切な換気をすること。注：溶出緩衝液は、使用直前に調製しなければならない。溶出バッファーを保管しないでください。
- ナノ粒子ペレットに20μlの溶出バッファーを追加します。精力的に複数回ピペッティングによりナノ粒子を懸濁します。 RTで15分間インキュベートする。
- 10分間16,100×gでのナノ粒子のサンプルをスピン。清潔な1.5 mlのマイクロチューブに上清を除去し、保存します。ナノ粒子ペレットを混乱しないでください。バイオハザードゴミ箱にペレットを捨てる。
- 化学ヒュームフード内のラックにサンプルを配置します。キャップを開き、INC室温で30分間ubate。 （ - 2時間1）または、乾燥するまで40℃で窒素流下でサンプルを配置します。
- サンプルに15μlのトリス - グリシンSDSサンプル緩衝液（2倍）を加える。 100での熱 オープンまたはチューブ内に残って音量まで、キャップを5分間のドライヒートブロック中で°Cを超えない20μlのではない。注：沸騰水浴を使用しないでください。水浴から湿度がバッファの蒸発を防止する。
- チューブのキャップを置きます。ヒートブロックからチューブを取り外します。サンプルは-80℃で保存するか、または下流のウェスタンブロット分析のために直ちに使用することができる。
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Representative Results
ハイドロゲルナノ粒子サイズと均一性
ポリ（NIPAM-AAC）粒子間のバッチ内で極めて高い収率や再現性で製造されてきた。粒子が捕捉、貯蔵、およびタンパク質の溶出（少なくとも48時間）に必要な時間の間、室温で非常に良好なコロイド安定性を有し、ナノ粒子沈殿（ 図1）11 を観察されていない。コロイド安定性は、ナノ粒子による急速なタンパク質/ペプチドの取り込みのために非常に重要であり得る。
プラズマから収穫の可能性の低存在量のバイオマーカー
色素餌の取り込みは、溶液中の分子の取り込みを駆動し、捕捉された分子が分解13、15、18、25から保存されていることを保証する。このため、プロテアーゼ阻害剤は、サンプル前処理時に必要とされない。ナノ粒子のこの属性は、それらの行いフィールド内のサンプル収集のために、室温で生体液の出荷のための保存技術としてのuitable。
ベイト分子がナノ粒子中に存在する官能基に結合する共重合または共有結合によってヒドロゲル粒子中に組み込むことができる。ビニルスルホン酸（VSA）共重合体を含む外殻を有するナノ粒子は第二の重合反応10-13によって作成された間に例として、ポリ（NIPAM -コ- AAC）ナノ粒子は、長さゼロの架橋アミド化反応を介してアミノ酸を含む染料で構築した。ナノ粒子の異なるタイプのナノ粒子内の異なる化学染料を組み込むことによって産生され、したがって、タンパク質の特定のクラスの収穫を高めることができる。私達の技術の重要な概念は、色素 - タンパク質相互作用は、3次元インタラックは、疎水性相互作用の組合せに主に依存するので、異なるベイトが、異なるタンパク質に対する優先的な親和性を示すことができることであるン、および静電気力。私たちは、いくつかの分析物のための結合力の複雑性の化学的に異なる色素による高親和性で捕捉することができることを観察した。 Tamburro らを参照してください。この原則13の大規模な説明と例については、。例えば、捕捉ベイト（ナノ粒子）の4つの異なるタイプの粒子を200μlのナノ粒子の種類ごとに200μlの血漿を用いてプラズマからTNFαを収集するために使用された。 TNFαは、ナノ粒子の溶出液（ 図1C）において検出可能であったのに対し、ナノ粒子で処理した後のすべての場合において、TNFαは、銀染色したSDS-PAGEにより上清中に検出されなかった。 （レーン1 =組換えTNFα（MW 17000 Da）で、レーン2＆3、4＆5、6＆7と8＆9は、それぞれのナノ粒子餌の4種類の結果を示し、C =コントロール、S =上清、P =ナノ粒子溶出液）。
Diffeの用量反応N anoparticlesの種類を借りる
較正曲線を行い、歩留まり及び精度を評価するために、実験は、既知の濃度のスパイクインタンパク質を用いて実施される必要がある。体液および分析物のさまざまな公表された結果は、ナノ粒子前処理がアッセイの直線性を維持し、検出10、16、26の効果的な制限を強化しながら検量線を確立する方法を示します。また、間に、実験室での精度の研究を発表している高感度27で多反応モニタリング質量分析を行うためにナノ粒子を使用する。
ナノ粒子のタイプによって異なるIL-17収穫効率を比較するために、組換えIL-17（17.5 kDa）のナノ粒子を続いて添加されたポリ（NIPAM-コ-AAC）又はポリ（NIPAM - コ - VSA）のいずれかの血漿サンプルに添加した。組換えIL-17 100ngの4つの連続希釈液を2組の100で調製した。81;リットルプラズマ（100 ngの/100μlを、50 ngの/100μlを、25 ngの/100μlの12.5 ngの/100μl）を。 1（v / v）の粒子：血漿比のポリ（NIPAM-コ-AAC）又はポリ（NIPAM - コ - VSA）粒子1内の各血漿サンプルに添加した。分光光度全タンパク質アッセイは、上清サンプル上で実施した。抗ウサギポリクローナルIL-17を用いたウエスタンブロット法は、ナノ粒子の収穫及びナノ粒子溶出液（P）（ 図4）後の血漿上清（S）を20μgで行った。両方のナノ粒子の種類は、適切に採取し、各希釈でのIL-17を濃縮した。ウェスタンブロット上の追加のバンドは、二次抗体と交差反応するヒト血清アルブミンおよび免疫グロブリンを表す。 （AAC粒子：レーン1＆2 = 1 ngの/μlのIL-17、レーン3＆4 = 0.50 ngの/μL、レーン5＆6 = 0.25 ngの/μL、レーン7＆8 = 0.125 ngの/μL、レーン9 = IL-17; VSA粒子：1＆2 = 1 NG / IL-17、レーン3＆4 = 0.50 ngの/μLμlのレーン、レーン5＆6 = 0.25 ngの/μL、レーン7＆8 = 0.125 ngの/μl）を。
尿中の潜在的に診断タンパク質の検出
書面によるインフォームドコンセント健常ボランティアドナーから得られたヒト尿サンプルは、 結核菌に感染した個体を模倣する組換えマイコバクテリウム種の抗原早期分泌ターゲット結核菌タンパク質（ESAT-6）でスパイクされた。 ESAT-6（15 kDa）の、およびIL-2（15.5 kDa）の各1μgを、健康なボランティアドナーから採取したヒト尿1mlのアリコートに添加した。尿検査、尿中のタンパク質の存在/不在に基づいていた尿へのナノ粒子の最適な比率を決定するために、尿試薬ストリップと試料について行った。ポリ（NIPAM /色素）のナノ粒子は、処理および未処理尿試料からタンパク質を回収するために使用された。ナノ粒子溶出液の一次元ゲル電気泳動は、fを行った銀染色ollowed。 U4およびU6レーンにおけるサンプルは、明らかに15 kDaの（ 図5）で顕著なバンドを示す、ESAT-6およびIL-2処理した尿サンプルからのナノ粒子の溶出液を表す。 ESAT-6（UniProtのアクPOA567、84.0カバレッジ、9ペプチド）およびIL-2（UniProtのアクセッションP60568、38.56カバレッジ、3ペプチド）を同定し、溶出液の質量分析。ナノ粒子収穫なしの尿は「生」と記されたレーンに示されている。
図1ナノ収穫と複雑な生物学的流体からの少量のタンパク質を濃縮する。収穫タンパク質のための（A）のワークフロー。総処理時間は約1.5時間である。溶液中のタンパク質を、（1000倍濃度が示されている）、血液、血清、血漿、尿、汗、唾液、または他の体液から濃縮される。（B）ナノ粒子の均一な大きさを示すバッチの比較にバッチ。雲母上原子間力顕微鏡は、大きさの均一性（0.7μmの直径）と、ナノ粒子の2バッチで凝集が存在しないことを示している。プラズマから隔離腫瘍壊死因子α（TNFα）のその後の銀染色した（C）1-Dゲル電気泳動、、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
下流の質量分析のための血漿/血清から図2ナノ粒子収穫手順は、（A）ナノ粒子は、溶液中に懸濁されたまま（ポリ（NIPAM /染料）が示されている）。（B）ナノ粒子は、希釈された血漿試料に添加される。（C）ナノ粒子のプラズマサスペンションiを上澄みからナノ粒子を分離する遠心分離機で遠心sの（D）後の遠心分離は、ナノ粒子がチューブの底に別個のペレットを形成する。（E）ナノ粒子を洗浄した後、収穫し、タンパク質を含む溶出液を除去し、保存され溶出液を42.1℃、1のための空気の流れ8、蒸発器に、窒素気流下で乾燥させる下流解析のために、（F） -質量分析の前に、2時間この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3尿試料の品質管理のための多検体試薬ストリップを使用する。 （A）試薬ストリップ上の各パッドが異なると反応する化学物質、酵素、および/ または指示色素を含浸させる耳鼻咽喉科尿検体（ 例えば 、グルコース、ビリルビン、ケトン、比重、血液のpH、タンパク質、ウロビリノーゲン、亜硝酸塩、および/ または白血球エステラーゼ）。尿を遠心分離によって清澄化する。尿の低下は試薬ストリップ上の各パッドに追加されます。（B）各パッドの色は視覚的にコンテナのカラーブロックに比較され、指定した時間に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。 コア（AAC）またはコア-シェル（VSA）のナノ粒子を用いたプラズマからのIL-17を収穫する。 1-Dゲル電気泳動及びウエスタン抗IL-17は、さまざまなconceを収穫するアクリル酸（AAC）およびVSAコアシェルナノ粒子の能力を実証してブロッティングプラズマからのIL-17のntrations。 （S =上澄みナノ粒子収穫後、P =ナノ粒子溶出液のAAc粒子：IL-17μlのレーン1＆2 = 1 ngの/、レーン3＆4 = 0.50 ngの/μL、レーン5＆6 = 0.25ng /μlを、レーン7＆8 = 0.125 ngの/μL、レーン9 = IL-17; VSA粒子：レーンのIL-17μlの1＆2 = 1 ngの/、レーン3＆4 = 0.50 ngの/μL、レーン5＆6 = 0.25 ngの/ μlを、レーン7＆8 = 0.125 ngの/μl）をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5。回復結核菌抗原およびサイトカインIL-2のハイドロゲルナノ粒子を用いた尿からの。 1-D G以下の銀染色尿サンプルのエル電気泳動。レーンU4およびU6内のサンプルは、明らかに15 kDaの時に顕著なバンドを示す、組換えESAT-6およびIL-2を含有する尿試料からの溶出液を表す。 ESAT-6（UniProtのアクPOA567、84.0カバレッジ、9ペプチド）およびIL-2（UniProtのアクセッションP60568、38.56カバレッジ、3ペプチド）を同定し、溶出液の質量分析。 （RAW =ナノ粒子を収穫せずに尿;組換えESAT-6およびIL-2以下のナノ粒子の収穫を欠いU1、U2、U3、U5、U7、U8 =尿）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| タンパク質名 | GIタンパク質番号 | 血清中の濃度/血漿[/ mlの] | リファレンス |
| ABL-相互作用因子1アイソフォームaの | 61743942 | 未知の | |
| AMP活性化プロテインキナーゼガンマ2サブユニットアイソフォームaは | 33186925 | 未知の | |
| CAS-BR-M（ネズミ）エコトロピックレトロウイルス変換シーケンス | 52426745 | 未知の | |
| ケモカイン（CCモチーフ）リガンド18（肺および活性化、規制） | 4506831 | 30 | 34 |
| ケモカイン （CCモチーフ）リガンド5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| コンドロアドヘリ | 153251229 | 未知の | |
| 第16染色体オープンリーディングフレーム80 | 8392875 | 未知の | |
| Consortin | 213021160 | 未知の | |
| デフェンシン、アルファ4、corticostatin | 4503303 | 未知の | |
| 20149675 | 未知の | ||
| 糖タンパク質Ibの（血小板）、ベータポリペプチド | 4504073 | 未知の | |
| グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）、q個のポリペプチド | 40254462 | 未知の | |
| ヘパラナーゼ | 148746204 | 未知の | |
| インスリン様成長因子2（ソマトメジンA） | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| ラクリチン | 15187164 | 未知の | |
| 白血球細胞由来ケモタキシン2 | 59806345 | 20万 | 33 |
| リポカリン2（癌遺伝子24P3） | 38455402 | 0.05 | 28 |
| モノグリセリドリパーゼ、アイソフォームCRA_b | 6005786 | 未知の | |
| N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質、ALPHA | 47933379 | 未知の | |
| 1カットホメオボックス2 | 119220564 | 未知の | |
| 精子尾部の外側の緻密な繊維4 | 171184433 | 未知の | |
| 関連する口蓋、肺および鼻の上皮 | 18765705 | 未知の | |
| ペプチドグリカン認識タンパク質2 | 156616294 | 未知の | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| プロテインCASC3 | 15721939 | 未知の | |
| RAB27B、メンバーRASは家族を癌遺伝子 | 5729997 | 未知の | |
| ラスアソシエーション（RalGDS / AF-6）ドメインファミリー6アイソフォームA | 29789443 | 未知の | |
| ras関連GTP結合タンパク質RAB10 | 33695095 未知の | ||
| リングフィンガータンパク質166 | 30520320 | 未知の | |
| 血清欠乏応答（ホスファチジルセリン結合タンパク質） | 4759082 | 未知の | |
| 溶質キャリアファミリー33（アセチルCoAトランスポーター）、メンバー1 | 4757708 | 未知の | |
| ST6ベータgalactosamideα-2,6-sialyltranferase 1アイソフォームaの | 27765091 | 15 | 32 |
| チモシン様3 | 34013530 | 未知の | |
| スプリット3のトランスデュー様エンハンサー（E（SP135）ホモログ、ショウジョウバエ） | 157384982 | 未知の | |
| トランスグルタミナーゼ1 | 4507475 | 未知の | |
| WDリピートドメイン1 | 9257257 | 未知の | |
| WDリピートドメイン91 | 222080092 | ピクセル; ">不明||
| 2を含むXINのアクチン結合リピート | 119372317 | 未知の |
血清/血漿からのナノ粒子によって収穫表1の例少量のタンパク質。 28-34（PeptideAtlasは、質量分析法をペプチドーム）permissionfrom 13（Tamburro、D. ら多機能コアシェル型ナノ粒子を参照して適応：以前は目に見えないバイオマーカーの発見JアムCHEM SOC、133、19178から19188、（2011。 ）。）著作権2011米国化学会。
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Discussion
臨床的関連
血清または血漿試料は、全体としての生物体の状態に関する情報の豊富な供給源を提供することができる低存在量の循環タンパク質およびペプチドを含むと考えられる。血清プロテオミクスの約束にもかかわらず、臨床的有益性10、11、16、25にバイオマーカーの発見および翻訳を阻止3つの基本的かつ重大な生理学的障壁があります。
1重要な診断バイオマーカーは、血液中の非常に低存在量（濃度）で存在し得る。このような前転移性癌病変などの早期病変組織、数mm 3未満を構成することができる。このような小さな組織体積から循環中に流されたバイオマーカーは非常に全体の血液量で希釈されたになります。関連の検体は、質量分析法と従来の免疫アッセイの検出限界未満で存在してもよい。
2。低存在量のバイオマーカー/タンパク質は、血漿プロテオーム14の最大90％を表し、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの高豊富なタンパク質の存在によってマスクされる。
3タンパク質およびペプチドは、静脈穿刺とサンプルの輸送/保管後内因性および外因性プロテイナーゼによる分解を受けやすい。タンパク質の分解は、偽陽性または偽陰性の結果35につながることができます。
ヒドロゲルナノ粒子は13、体液中のタンパク質およびペプチド収穫と保存のために11を anthraquinonetriazine染料および/ またはビニルスルホン酸の殻を含む多孔質、浮力、ポリマーとして開発されました。私たちのグループは合成し、有機染料（ すなわちの過多で官能ヒドロゲルナノ粒子をテストしました。 、スルホン化および非sulfonatedanthraquinonetriazine染料）と、いくつかのタンパク質分析物11、13のための優先的な親和性を示した。また、使用するバイオマーカー探索のためのプロトコルを確立リンパ液、唾液、脳脊髄液、汗、尿、血漿、血液、または血清標本11、13、23、24、26を有するヒドロゲル粒子。
貴重な臨床/研究標本から収穫前のタンパク質へのナノ粒子の収穫のパラメータを最適化することは、理想的な結果を得るために必要である。サンプル中のタンパク質の量は、サンプルボリュームにナノ粒子の最適な比率を決定するために定量化されるべきである。未知の濃度の分析物について、組換えタンパク質を用いた用量反応曲線は、検出限界に関する情報を提供する。十分なサンプルがある場合は、ナノ粒子の各種の検体及び検体のための理想的なナノ粒子を決定することができる。
ナノ粒子の収穫前に尿検査で尿サンプル品質管理チェックを提供します。ナノ色素餌の親和性は、目的のタンパク質と周囲の媒体のpHが等電点に依存する。尿pHは間5.5および7.0には、ポリ（NIPAM /色素）のナノ粒子を用いたタンパク質の収穫に最適である。溶血または無傷の赤血球の存在（試薬ストリップ上の1 +血液）は、ナノ粒子の収穫を妨害しない。
このプロトコルでは、血漿および尿からタンパク質を採取するハイドロゲルナノ粒子の応用に焦点を当てた。将来のアプリケーションは、眼の硝子体、または滑液などの他の体液を含むことができる。 生体内用途におけるポテンシャルは、ナノ粒子は、生体分子を収集するために罹患組織に注入された将来のために想定することができる。今後の課題はまた、皮膚の漏出プロテオーム解析のためのナノ粒子ベースの皮膚パッチのようなバイオマーカーの捕捉と保存のための新しいデバイスの開発を中心に説明する。
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Acknowledgments
親切に図5に示すデータの収集と分析を支援し、マイケル·ヘンリー、ダブリン市立大学、。この作品は、（1）ジョージ·メイソン大学によって部分的にサポートされていた、イタリア/アメリカの枠組みの中で（2）イタリア語IstitutoSuperioreディ·サニ'米国保健社会福祉省、ジョージ·メイソン大学、公衆衛生のイタリア省、LAL〜（3）のNIH、IMATプログラム助成1R21CA137706-01と1R33CA173359-01、および（4）セレスナノサイエンス株式会社の間で協力協定。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
