Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

Summary

En este protocolo de video rastreamos, a alta velocidad y en tres dimensiones, lisosomas marcados con fluorescencia dentro de células vivas, utilizando el método de seguimiento orbital en un microscopio modificado de dos fotones.

Abstract

El objetivo de este protocolo de vídeo es discutir cómo realizar y analizar un tridimensional fluorescente orbital experimento de rastreo de partículas usando un microscopio de dos fotones modificado ^1. A diferencia de los enfoques convencionales de exploración de trama (o campo amplio basado en una pila de marcos), el seguimiento orbital 3D permite localizar y seguir con una alta resolución espacial (10 exactitud nm) y la resolución temporal (respuesta de frecuencia 50 Hz) el desplazamiento de 3D una partícula fluorescente pasar longitud escalas de cientos de micras ^2. El método se basa en un algoritmo de realimentación que controla el hardware de una de dos fotones microscopio de barrido láser con el fin de realizar una órbita circular alrededor del objeto a ser rastreados: el mecanismo de retroalimentación mantendrá el objeto fluorescente en el centro mediante el control del desplazamiento de el haz de exploración ^3-5. Para demostrar las ventajas de esta técnica, hemos seguido un orgánulo de movimiento rápido, el lisosoma, dentro de alcelular iving ^6,7. Las células se cultivaron de acuerdo a protocolos estándar, y se tiñeron usando un colorante comercialmente lisosoma. Se discute brevemente la configuración de hardware y con más detalle el software de control, para llevar a cabo un experimento de seguimiento orbital 3D dentro de las células vivas. Se discuten en detalle los parámetros requeridos con el fin de controlar el microscopio de exploración y permitir el movimiento de la viga en una órbita cerrada alrededor de la partícula. Concluimos demostrando cómo este método puede ser usado efectivamente para seguir el movimiento rápido de un lisosoma marcado a lo largo de los microtúbulos en 3D dentro de una célula viva. Los lisosomas pueden moverse con velocidades en el intervalo de 0,4-0,5 m / seg, típicamente presentan un movimiento dirigido a lo largo de la red de microtúbulos ^8.

Introduction

Un gran número de enfoques han sido desarrollados hasta la fecha para realizar un seguimiento de partículas fluorescentes en tres dimensiones usando un microscopio. La mayoría de los enfoques se basan en el uso de cámaras rápidas, ideal para realizar un seguimiento en dos dimensiones, por lo general combinados con modificaciones personalizadas de la óptica de emisión del microscopio para lograr el seguimiento en la dirección axial. Microscopios de barrido láser confocal (ya sea o dos fotones) convencionalmente puede rastrear una partícula fluorescente mediante la realización de una secuencia temporal de z-pilas, aunque este proceso es típicamente mucho tiempo, y produce resolución de tiempo razonable (10 Hz) sólo si la partícula está realizando un seguimiento es mantenido en el centro de una pequeña región de formación de imágenes de trama por un mecanismo de retroalimentación activo ^2.

La idea de quedarse atrapado en la partícula es la base del método de seguimiento orbital. En lugar de una trama escanear una órbita circular que se realiza alrededor de la partícula fluorescente. La intensidad de la fluorescencia a lo largola órbita localiza con precisión la posición de la partícula ^4.

La posición localizada de la partícula puede entonces ser utilizada para accionar los escáneres de microscopio y re-centro de la órbita en la posición de la partícula. Los escáneres galvanómetro del microscopio son impulsados ​​por una tensión analógica. El componente de AC de este voltaje permite realizar una órbita con el haz de láser enfocado, es decir, un seno y una onda de coseno aplicado a los espejos de exploración X e Y permitirá la realización de una órbita circular. El desplazamiento de la señal de DC facilita el cambio de la posición del centro de la órbita. Una vez que un período de órbita y se determina la forma de onda para la señal de CA está configurado, el sistema de retroalimentación necesita actualizar sólo el componente DC de la señal.

Un software capaz de leer la señal fluorescente obtenida de los detectores se requiere para el control de los escáneres y los detectores, para calcular la posición de la partícula y actualizar el DC fueraestablecer. Para una evaluación exitosa imágenes de una cuidadosa selección de los parámetros de órbita (tamaño y calendario) que se requiere y estos parámetros tienen que ser ajustado en base a las características de las partículas fluorescentes que es necesario realizar un seguimiento.

Los fundamentos físicos y matemáticos de la técnica se han descrito en el pasado ^{de 4,5} tanto para aplicaciones 2D y 3D. En este protocolo se describen brevemente los principales componentes de hardware de la configuración, y con más detalle la elección de los parámetros y de la preparación de la muestra necesario para un experimento típico permitiéndonos tras el desplazamiento de un lisosoma en una alta resolución temporal dentro de una célula viva.

Protocol

1. Preparación de muestras

1. Mantener células CHOK1 en matraces de cultivo de tejido utilizando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 UI / ml de penicilina 50 g / ml de estreptomicina. Se incuban las células en una incubadora humidificado 5% de CO ₂ a 37 ° C.
2. Cosecha y luego placa células CHOK1 sobre un diámetro micro-bien 14 mm con un espesor de 0,16 mm superficie. Se siembran las células de la densidad óptima para la imagen, en torno al 60-70% de confluencia.
3. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO _2. Lavar las células tres veces en HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubar las células en una solución que contiene 50 nM de DND26 Lysotracker verde y 150 nM de verde rastreador de la tubulina. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C. Paso opcional: Antes de la incubación, realizar una tinción adicional con un colorante de tinción de la matriz mitocondrial (25 nM).
4. Lavar las células tres veces en HBSS para eliminar cualquier colorante no unido. Añadir medio de cultivo DMEM fresco antes de la imagción de las células.

2. Microscopio Configuraciones

El microscopio para el rastreo de partículas se describe en el protocolo de vídeo está montado en el bastidor de un microscopio invertido comercialmente disponible (Figura 4). Sin embargo módulos comerciales para el rastreo de partículas orbital 3D ya están disponibles.

1. Use un II coherente Camaleón-Ultra Ti: Sa femtosegundo fuente de luz de excitación láser, con una longitud de onda sintonizable rango de salida entre 690 nm-1040 nm.
2. Asegúrese de que el rayo láser está alineado en el puerto trasero del microscopio utilizando espejos IR-revestido. El rayo láser se atenúa usando una placa de media onda giratoria seguido por un polarizador lineal calcita. Atenuar el haz de manera que la potencia media en la muestra es entre 0.5 y 2 mW.
   NOTA: El rayo láser se refleja por un par de espejos accionados por motor galvanómetro que permiten el control de la posición y trayectoria del haz enfocado en el plano de la muestra. En unaconfiguración típica del haz de láser colimado que sale de los espejos de galvanómetro se expande (10X) que pasa a través de un expansor de haz, antes de entrar en la parte trasera del objetivo del microscopio después de la reflexión en espejo dicroico pase corto.
3. Recoger la luz de fluorescencia de la muestra mediante la colocación de un objetivo de alta abertura numérica agua (60X, NA 1.2) en la trayectoria de la luz. Elegir un cubo de filtro de fluorescencia de acuerdo con las longitudes de onda de emisión deseados en uno o dos de configuración de canal. Emplear filtros de paso de banda de emisión para seleccionar aún más la gama espectral de la fluorescencia emitida.
4. Colocar la muestra en una platina motorizada, y ajustar la multa movimiento del objetivo del microscopio utilizando un piezo-controlador objetivo.
5. Dirija la luz del cubo de filtro en tubos fotomultiplicadores donde se discrimina la señal y la envía a un I / O tarjeta de adquisición de datos digital.
   NOTA: El ordenador genera formas de onda son la salida analógica de la tarjeta de E / S y son Provided a los escáneres de control de la electrónica. La entrada de conteo de fotones de los fotomultiplicadores y la señal de salida a los escáneres se mide y se controla a través de la tarjeta de E / S por el Laboratorio de software de fluorescencia Dynamics SimFCS.

3. Imaging

1. Coloque las células en el escenario y enfocar con iluminación de luz transmitida.
2. Cambiar a formación de imágenes de exploración de trama para identificar las células que han incorporado el colorante y para visualizar los microtúbulos subyacentes. Identificar la zona inicial donde el movimiento de la vesícula está presente.
3. Una vez que una vesícula aislado se identificó, establecer los siguientes parámetros para el seguimiento orbital:
   1. Seleccione el radio de la órbita para definir el tamaño de la exploración circular de acuerdo con el tamaño de la partícula siendo rastreado. Para un emisor de punto, establecer el radio de la órbita igual a la cintura de la función de dispersión del punto (PSF) de la viga de excitación para maximizar la sensibilidad y la respuesta.
   2. Ajuste el axialdistanciarse para definir la distancia entre las dos órbitas que se realizan para localizar la posición de la partícula a lo largo de la dirección axial. Establezca la distancia axial a 1,5-3 veces la cintura PSF.
   3. Definir el tiempo de permanencia en función del brillo de la partícula para establecer el tiempo dedicado a cada punto de la órbita, que también determinará el tipo de foto-blanqueo. Utilice un tiempo de espera entre 10 a 100 microsegundos.
   4. Establecer el número de puntos en cada órbita a 64 o 128 para producir períodos orbitales en el orden de 4-32 ms y proporcionar una alta resolución temporal para determinar la posición de la partícula.
4. Cambie la señal DC compensar envía a los espejos con el fin de centrar el haz sobre la partícula a través de la interfaz gráfica de usuario a través de una selección cursor en la imagen raster-escaneada.
5. Comience seguimiento al cambiar el modo de microscopio de raster de imágenes para la exploración orbital.
6. Active la recogida de opiniones y datos.

4. TrajectAnálisis ory

1. Utilice el software para visualizar la fluorescencia recogida en cada punto a lo largo de la órbita y en cada punto en la forma de una "alfombra intensidad" tiempo. La intensidad de recogida a lo largo de la alfombra proporciona información sobre la interacción de la partícula con otros objetos brillantes. Utilice el software para visualizar tanto la información de trayectoria (es decir, el desplazamiento de CC en el tiempo de la x, y y los escáneres de la -piezo z), así como la intensidad de fluorescencia obtenida de la tubo fotomultiplicador con el tiempo en forma de series de tiempo.
2. Utilice la representación de series de tiempo y la información 'alfombra intensidad "para seleccionar sólo una región de interés en la trayectoria.
3. Utilice el software para mostrar una proyección 2D de la parte seleccionada de la trayectoria de la partícula. Seleccione los controles apropiados para el código de color de acuerdo a la trayectoria de la intensidad de fluorescencia de las partículas.
4. Seleccione la opción para mostrar la partículo trayectoria en 3D, y código de color de acuerdo a la intensidad de fluorescencia. Girar la trayectoria en 3D utilizando los controles para visualizar las características del movimiento lisosoma a lo largo de los microtúbulos.

Results

De acuerdo con este protocolo de seguimiento de una sola partícula 3D rápido puede llevar a cabo dentro de las células vivas con un microscopio de dos fotones modificado para seguir el desplazamiento de los lisosomas marcados con fluorescencia. El experimento llevado a cabo consiste en el seguimiento de un lisosoma aislado en movimiento dentro de la célula después del proceso de maduración endosoma ^9. Los lisosomas se tiñeron utilizando un tinte verde fluorescente y se excita a 930 nm de excitación que explot...

Discussion

A pesar de los enormes progresos de las técnicas de microscopía de fluorescencia y instrumentaciones de los últimos años, logrando trayectorias de las partículas fluorescentes en tres dimensiones con una alta resolución temporal se ha mantenido un reto en el campo. Si de alta resolución temporal se ha logrado partículas de rastreo en dos dimensiones, la extensión a la dirección axial típicamente trae una drástica reducción en la respuesta de frecuencia del sistema ^10.

En este vide...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Tubuline tracker Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Chamelón Coherente- ultra II TI	Glan Coherente
Taylor Polarizador de Calcita Melles	Griot	03PTA001
Espejo galvanómetro-motor	Cambridge	Technologies M 6350
Espejo dicroico	Chroma Technologies	700 DCSPXR
Platina motorizada	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
Tubo fotomultiplicador	Hamamatsu	H7422P-40
Tarjeta de adquisición de datos	IO tech	PCI 1128-4000
Software de imagen	LFD	Global para imágenes-SimFCS