Este artículo describe la microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo como una técnica de transfección de células de ratón testiculares para estudiar procesos únicos de la espermatogénesis. El protocolo presentado implica etapas de preparación capilar de vidrio, microinyección a través del conducto eferente, y transfección por electroporación.
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Artículo de método
En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis
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Resumen
Resumen
Esta contribución de video y artículo da una descripción completa de microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo. Esta técnica particular para la transfección de células de ratón testiculares permite el estudio de los procesos únicos en la espermatogénesis.
El siguiente protocolo se centra en la transfección de células testiculares de ratón con construcciones de plásmidos. Específicamente, se utilizó el vector reportero pEGFP-C1, que expresa mayor proteína verde fluorescente (EGFP) y también el vector pDsRed2-N1 que expresa la proteína fluorescente de color rojo (DsRed2). Ambos genes indicadores codificados estaban bajo el control del promotor de citomegalovirus humano temprano inmediato (CMV).
Para llevar a cabo la transferencia génica en los testículos de ratón, los constructos de plásmido reportero se inyectan en los testículos de ratones vivos. Para ello, el testículo de un animal anestesiado está expuesto y el sitio de microinyección se prepara. Nuestro lugar preferido deinyección es el conducto eferente, con la rete testis en última instancia conectado como la ruta de transporte anatómica de los espermatozoides entre el testículo y el epidídimo. De esta manera, el llenado de los túbulos seminíferos después de la microinyección se gestiona de manera excelente y controlada debido a la utilización de soluciones de ADN teñidos. Después de observar un relleno suficiente de los testículos por su estructura túbulo coloreado, el órgano se electroporación. Esto permite la transferencia de la solución de ADN en las células testiculares. Después de 3 días de incubación, se retira el testículo y se investigó bajo el microscopio para fluorescencia verde o roja, que ilustra el éxito de la transfección.
En general, este protocolo puede ser empleado para la entrega de ADN o ARN construye en la vida testículo del ratón con el fin de (sobre) expresa o derribar los genes, lo que facilita el análisis de la función génica in vivo. Además, es adecuado para el estudio de construcciones informadoras o putativo Regula genelementos tory. Por lo tanto, las principales ventajas de la técnica de electroporación son un rendimiento rápido en combinación con bajo esfuerzo, así como el equipo técnico moderado y habilidades requeridas en comparación con las técnicas alternativas.
Introducción
La espermatogénesis en mamíferos se considera que es un proceso sofisticado de células madre auto-renovación sometidos sucesivamente la mitosis, la meiosis y diferenciación con el fin de desarrollar en espermatozoides maduros haploide. Estos cambios morfológicos son orquestados por diferentes tipos de células, ya pesar de profundos intentos, todavía es imposible de imitar estos procesos en cultivo celular 1,2. Por lo tanto, la investigación sobre la espermatogénesis hasta ahora se basa en organismos vivos como modelos in vivo. En general, los estudios de la función génica se basan generalmente en animales transgénicos. Sin embargo, la generación y....
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Protocolo
Todos los experimentos realizados en animales han sido aprobados por el comité de ética local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Alemania).
1. preparación de plásmido
- Para la preparación de plásmido, utilizar kits de purificación de plásmido (ver tabla Materiales) o métodos similares con tampón de eliminación de endotoxina de manera que las reacciones inmunes del animal pueden ser evitados. Siga las instrucciones del manual. Emplear ddH2O para diluir la solución de plásmido.
- Eliminar los residuos haciendo girar la solución de ADN a la velocidad máxim....
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Resultados
La configuración experimental para realizar la microinyección y electroporación de testículos de ratón in vivo, ya que se utiliza de acuerdo con el protocolo se ilustra en la Figura 1. Aunque es posible adquirir micropipetas fabricados industrialmente, preferimos generar nuestras propias pipetas tirando (Figura 1A ) y biselado (Figura 1B) capilares de vidrio para que satisfizo nuestras necesidades. El equipo para la microinyección y electroporación se ilustra e.......
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Discusión
La investigación en el campo de la biología reproductiva, particularmente en el área de la fertilidad masculina y la espermatogénesis, inevitablemente, se basa en los organismos vivos. Con el fin de examinar la función testicular, sin cultivo celular adecuado / sistema in vitro se ha establecido capaz de reflejar todas las cruciales cambios morfológicos de una espermatogonia diploide a un 1,2 espermatozoide maduro haploide. Por lo tanto, la generación de animales modificados genética.......
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Divulgaciones
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, y Joachim M. Weitzel empleadas en el Instituto de Biología de la Reproducción del Instituto Leibniz de Biología Animal Farm (FBN), Dummerstorf, Alemania, declarar que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a Birgit Westernstroeer del Centro de Medicina Reproductiva y Andrología de la Universidad de Münster para la enseñanza de la microinyección testicular. Además, estamos agradecidos a Ursula Antkewitz y Petra Reckling para la asistencia técnica. Agradecemos a la Fundación Alemana de Investigación (DFG) para apoyar este trabajo (WE2458 / 10-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífuga | Sigma | 1-15 PK | |
| Espectrofotómetro | Nanodrop | ND-1000 | |
| Extractor de micropipetas | Narishige | PC-10 | extractor de capilares vertical |
| Capilares de microinyección | Clark | GC100-10 | borosilicato de pared |
| estándar Biseladora de micropipetas | Bachofer | Typ 462 | disco giratorio biseladora |
| Electroporador | Nepagene | CUY 21EDIT | Electroporador de onda cuadrada |
| Pinzas Electrodos | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø electrodos de disco |
| Microscopio estereoscópico | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Fuente de luz fría | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Bomba de microinyección | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulador | casero | Mesa cruzada XYZ | |
| Instrumental quirúrgico | FST | tijeras, pinzas, portaagujas | |
| Pinza fina | FST | Dumont #5, #7 | Preparación de conductos eferentes Clip |
| Michel grapadora de aplicación | FST | Michel, 12029-12 | |
| Pinzas de sutura Michel | FST | Michel, 12040-01 | 7,5 x 1,75 mm |
| Sutura quirúrgica | Catgut, Markneukirchen, Alemania | Catgut 00 | |
| Jeringa con aguja de 30 G | B. Braun | Omnican 40 | para carga de micropipeta y para anestesia |
| Kit de aislamiento de plásmidos | Promega | Cat. # A2495 | plásmido Midiprep |
| Plásmido pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | Promotor de CMV + |
| Plásmido EGFP pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | Promotor de CMV + DsRed2 |
| Fast Green colorante | Sigma | F7258-25G | para dilución en ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Alemania | Mezcla de urotamina | en una proporción 1:1 con xilacina |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Alemania | Mezcla de xilacina | en una proporción 1:1 con ketamina |
| Sterilium | Bode Chemie | Pomada | de desinfección |
| S& K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | ungüento oftalmálmico para prevenir la sequedad ocular | |
| Yoduro To-Pro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofeno, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 | solución pediátrica analgésica (AINE) para el alivio del dolor postoperatorio | |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4· 2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 |
Referencias
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
