Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Resumen

El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.

Resumen

Los órganos linfoides secundarios, incluidos los ganglios linfáticos, están compuestos por células estromales que proporcionan un entorno estructural para la homeostasis, activación y diferenciación de los linfocitos. Se han identificado varios subconjuntos de células estromales por la expresión de la molécula de adhesión CD31 y la glicoproteína podoplanina (gp38), células reticulares de la zona T o células reticulares fibroblásticas, células endoteliales linfáticas, células endoteliales sanguíneas y pericitos similares a FRC dentro de la población de células dobles negativas. Para todas las poblaciones se describen diferentes funciones, entre ellas, la separación y el revestimiento de diferentes compartimentos, la atracción e interacción con diferentes tipos de células, la filtración de los fluídicos drenantes y la contracción de los vasos linfáticos. En los últimos años, diferentes grupos han descrito un papel adicional de las células estromales en la orquestación y regulación de las respuestas de las células T citotóxicas potencialmente peligrosas para el huésped.

Los ganglios linfáticos son estructuras complejas con muchos tipos de células diferentes y, por lo tanto, requieren un procedimiento adecuado para el aislamiento de las poblaciones celulares deseadas. Actualmente, los protocolos para el aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos se basan en la digestión enzimática con tiempos de incubación variables; Sin embargo, las células estromales y sus moléculas de superficie son sensibles a estas enzimas, lo que provoca la pérdida de la expresión de marcadores de superficie y la muerte celular. En este caso, se propone un breve protocolo de digestión enzimática combinado con una disrupción mecánica automatizada para obtener una suspensión viable de células individuales de células estromales de ganglios linfáticos que mantengan su expresión de moléculas de superficie.

Introducción

Los ganglios linfáticos son compartimentos especializados donde se inician y coordinan la respuesta inmune adaptativa contra extranjeros y los antígenos propios. El procedimiento presentado aquí describe una digestión enzimática corto combinado con pipeteo automatizado mecánica para obtener los ganglios linfáticos suspensión de células individuales y obtener acceso a las células del estroma de ganglios linfáticos viables que mantienen la expresión en la superficie de varias moléculas.

Células estromales de los ganglios linfáticos forman el andamiaje de los ganglios linfáticos y cumple tres funciones principales: en primer lugar que filtra....

Protocolo

En esta publicación de vídeo y el protocolo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con el protocolo de los animales aprobado por la Autoridad Cantonal Basel-Stadt, Suiza.

1. linfa Preparación de nodos y digestión

1. Agua Pre-calor en un vaso de precipitados a 37 ° C en un agitador magnético con placa de calentamiento.
2. Preparar Básica Media de la siguiente manera: medio DMEM (sin piruvato) suplementado con FCS al 2%, 1,2 mM CaCl ₂ y Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 mg de estreptomicina).
3. Esterilice todos los instrumentos de disección antes de su uso.
4. ....

Resultados

El presente protocolo es un protocolo de digestión modificado publicado por Link et al., 2007 ⁶ con un tiempo de digestión más corto (45 min máximo) debido a la disgregación mecánica con una pipeta multicanal automatizada. Además, el procedimiento es más uniforme, minimiza la degradación de marcadores de superficie en diferentes células del estroma de los ganglios linfáticos y permite la manipulación de más de una muestra a la vez.

La colagenasa IV y colagenasa D en Enlac.......

Discusión

El estudio de las células del estroma de los ganglios linfáticos se convirtió recientemente en un foco de investigación, debido al desarrollo de dos protocolos de digestión publicados ^6,13. Ambos protocolos son adecuados para obtener las células del estroma sola ganglios nodo, pero difieren en el uso de enzimas de digestión y el tiempo de digestión. Dado que las células estromales y sus marcadores de superficie son sensibles a la digestión enzimática y la tensión mecánica, se requiere un protocolo optimizado........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Concentración final 2%
CaCl2	Sigma	499609	Concentración final 1,2 mM
Colagenasa IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 unidades por mg de peso seco, uso a la concentración final de 1 mg/ml
Colagenasa D	Roche 11088882001		uso a 3,5 mg/ml
de ADNasa I	Roche	11284932001	uso a 40 µ g/ml
Imanes de agitación	FAUST		5 mm de largo-2 mm y barra;
Tubos de poliestireno de fondo redondo 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Agitador magnético con función	de calentamiento Estándar IKA-RCT	9720250
placas de Petri 100 mm, estéril	TPP	6223201
agujas de 25 G Terumo
anti ratón CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti ratón CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti ratón Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti ratón CD31 Ab	Biolegend		Clon MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multicanal	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µ l volumen máx.
anti ratón CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti ratón CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti ratón CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti ratón I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti ratón CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Reparable Kit de tinción de células muertas en infrarrojo cercano	Invitrogen	L10119