Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.
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Artículo de método
Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía
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Resumen
Resumen
Muchos receptores de señalización importantes se internalizan a través del bien estudiado proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME). Los ensayos biológicos celulares tradicionales, que miden los cambios globales en la endocitosis, han identificado más de 30 componentes conocidos que participan en CME, y los estudios bioquímicos han generado un mapa de interacción de muchos de estos componentes. Sin embargo, cada vez está más claro que la EMC es un proceso muy dinámico cuya regulación es compleja y delicada. En este manuscrito, describimos el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar directamente la dinámica de los componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina, en tiempo real en células vivas, a nivel de eventos individuales que median este proceso. Este enfoque es esencial para dilucidar los cambios sutiles que pueden alterar la endocitosis sin bloquearla globalmente, como se ve con la regulación fisiológica. Nos centraremos en el uso de esta técnica para analizar un área de interés emergente, el papel de la composición de la carga en la modulación de la dinámica de distintos pozos recubiertos de clatrina (CCP). Este protocolo es compatible con una variedad de sondas de fluorescencia ampliamente disponibles, y se puede aplicar para visualizar la dinámica de muchas moléculas de carga que se internalizan desde la superficie celular.
Introducción
El proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME) depende de la llegada oportuna de los muchos componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina para recoger y manipular la carga de la membrana plasmática en las vesículas 1-3. CME es iniciada por proteínas de deformación de la membrana y del adaptador de carga que se unen en sitios nacientes de endocitosis 1. Estas proteínas reclutan la proteína de la cubierta de clatrina, que se ensambla en una estructura en forma de jaula que forma la fosa revestidas de clatrina (CCP) 4. Una vez que el CCP está completamente montado en una forma esférica, la escisión de la membrana, pr....
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Protocolo
1. Expresión de marcado con fluorescencia CME Componentes en células cultivadas
HEK293 células son células modelo de utilidad que se han utilizado ampliamente para estudiar la biología GPCR y la endocitosis, y por lo tanto se utilizan como modelos en este protocolo. Usar cualquier protocolo de transfección proporcionar expresión uniforme sin sobreexpresión y baja citotoxicidad.
- Manejar todo el cultivo de células en una campana de flujo laminar estéril. Llenar 4 pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 ml de medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS). Desde un matraz T25 confluente de célu....
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Resultados
Uso de células vivas TIRF de Microscopía hemos registrado la dinámica endocítica de la μ-opioide-receptor (MOR), un receptor acoplado a proteína G (GPCR) y su endocítica proteína adaptadora β-arrestina. El constructo de β-arrestina se transfectó transitoriamente en una línea celular que expresa de forma estable MOR usando el protocolo descrito en la Figura 1, y la imagen 96 horas más tarde. El MOR en la línea celular estable es N-terminal marcado con una GFP sensible al pH. Esta proteína fluorescente só.......
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Discusión
Aquí se describe el uso de TIRFM para visualizar la endocitosis mediada por clatrina (CME) a nivel de individuo PCC en las células vivas en tiempo real. CME es un evento rápido y muy dinámico mediada por el efecto acumulativo de muchos eventos espacial y temporalmente separados individuales. La mayoría de los ensayos que se utilizan actualmente, como las mediciones bioquímicas de internalización mediante biotinilación superficie o de unión del ligando, la citometría de flujo o ensayos de células fijas que miden la can.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los Dres. C. Szalinski, H. Teng y M. Bruchez por su ayuda con Imaris, R. Vistein y D. Shiwarski por su ayuda técnica y consejo, y al Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin y Dr. W Almers por los reactivos y la útil discusión. Los fondos proporcionados por la subvención T32 NS007433 a SLB y NIH DA024698 y DA036086 a MAP.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/Glucosa alta con L-glutamina y piruvato de sodio | Fisher Scientific | ||
| Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio | Gibco, de Life Technologies | 21600-010 | |
| Ácido libre de EDTA | Amresco | 0322-500G | |
| Suero fetal bovino | Gibco, de Life Technologies | 10437-028 | |
| L-15 de Leibovitz, sin rojo fenol | Gibco, de Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, de Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE de Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Reactivo de transfección |
| de 25 mm cubreobjetos | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Matraces tratados con cultivo celular Corning, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Greiner Bio-One, de VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Kit | de etiquetado de proteínasLife Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Software de análisis de imágenes | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análisis automatizado | |
| Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti y accesorios necesarios, incluidos cubos de filtro y filtros | Nikon | ||
| Nikon Brazo TIRF con los adaptadores necesarios para Nikon Eclipse Ti | Nikon | ángulo de incidencia | |
| iXon+ EMCCD cámara y adaptadores | Andor |
Referencias
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
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Reimpresiones y permisos
