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Artículo de método

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

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DOI:

10.3791/51805

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20 de octubre de 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

En este artículo

Resumen

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Resumen

Muchos receptores de señalización importantes se internalizan a través del bien estudiado proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME). Los ensayos biológicos celulares tradicionales, que miden los cambios globales en la endocitosis, han identificado más de 30 componentes conocidos que participan en CME, y los estudios bioquímicos han generado un mapa de interacción de muchos de estos componentes. Sin embargo, cada vez está más claro que la EMC es un proceso muy dinámico cuya regulación es compleja y delicada. En este manuscrito, describimos el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar directamente la dinámica de los componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina, en tiempo real en células vivas, a nivel de eventos individuales que median este proceso. Este enfoque es esencial para dilucidar los cambios sutiles que pueden alterar la endocitosis sin bloquearla globalmente, como se ve con la regulación fisiológica. Nos centraremos en el uso de esta técnica para analizar un área de interés emergente, el papel de la composición de la carga en la modulación de la dinámica de distintos pozos recubiertos de clatrina (CCP). Este protocolo es compatible con una variedad de sondas de fluorescencia ampliamente disponibles, y se puede aplicar para visualizar la dinámica de muchas moléculas de carga que se internalizan desde la superficie celular.

Introducción

El proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME) depende de la llegada oportuna de los muchos componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina para recoger y manipular la carga de la membrana plasmática en las vesículas 1-3. CME es iniciada por proteínas de deformación de la membrana y del adaptador de carga que se unen en sitios nacientes de endocitosis 1. Estas proteínas reclutan la proteína de la cubierta de clatrina, que se ensambla en una estructura en forma de jaula que forma la fosa revestidas de clatrina (CCP) 4. Una vez que el CCP está completamente montado en una forma esférica, la escisión de la membrana, principalmente a través de la acción de la gran GTPasa, dynamin, genera vesículas revestidas de clatrina libres (CCV) 5,6. Esta internalización desencadena un rápido desmontaje de la capa de clatrina, lo que permite a los componentes ser reutilizados para múltiples rondas de CME.

El descubrimiento y caracterización de las proteínas implicadas en CME se ha basado en Bioch tradicional, y las técnicas de microscopía genéticos emical 4-6,8. Estos ensayos han aclarado las funciones y puntos de interacción de estos componentes endocítica. Aunque muy útil para definir los componentes esenciales de la maquinaria de tráfico, estos ensayos son muy limitados en capturar el comportamiento dinámico de los componentes de CME o concentración de carga. Esta es una limitación crítica, ya que CME es impulsada por el conjunto coreografiado de conjuntos de módulos de la proteína en pasos definidos, y puesto que los pequeños cambios en la dinámica de los acontecimientos endocíticas individuales puede tener grandes consecuencias acumulativas sobre la endocitosis. Además, datos recientes indican que los PCC individuales pueden diferir tanto en la composición como en el comportamiento, lo que sugiere que la regulación fisiológica de este proceso es altamente espacial y temporalmente limitado 9-14. Visualización de eventos endocíticas individuales, por lo tanto, es esencial para entender por qué hay múltiples proteínas redundantes involucrados en CME y b cómo podrían controlarse estas proteínasseñales fisiológicas Y para regular la internalización de carga.

Aquí se describe el uso de Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) para observar CME en el nivel de la dinámica de los PCC individuales en las células vivas. TIRFM se basa en la diferencia en el índice de refracción entre el cubreobjetos de vidrio y el entorno fluido de células 15,16. Cuando la luz de excitación se dirige hacia las células en más que el ángulo crítico, se refleja internamente, creando una onda evanescente que mantiene un campo delgada de iluminación que se extiende aproximadamente 100 nm por encima del cubreobjetos. Esto garantiza que sólo las moléculas fluorescentes dentro de este estrecho campo están entusiasmados. Prácticamente, esto permite la excitación de las moléculas fluorescentes en o cerca de la membrana plasmática, y minimiza la fluorescencia de las partes interiores de la célula. Esto proporciona una relación señal-ruido y eje z significativamente mayor resolución para visualizar los eventos en la membrana plasmática, COmpared a los modos más comúnmente usados ​​tales como epifluorescencia convencional o microscopía de fluorescencia confocal. También describimos, en una introducción y nivel práctico, el uso de una plataforma de análisis de imagen comúnmente utilizado para analizar y cuantificar características y dinámica de los acontecimientos endocítica de carga individuales morfológicos simples.

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Protocolo

1. Expresión de marcado con fluorescencia CME Componentes en células cultivadas

HEK293 células son células modelo de utilidad que se han utilizado ampliamente para estudiar la biología GPCR y la endocitosis, y por lo tanto se utilizan como modelos en este protocolo. Usar cualquier protocolo de transfección proporcionar expresión uniforme sin sobreexpresión y baja citotoxicidad.

  1. Manejar todo el cultivo de células en una campana de flujo laminar estéril. Llenar 4 pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 ml de medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS). Desde un matraz T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, en cada uno de los 4 pocillos.
    1. Alternativamente, sembrar las células a una placa de múltiples pocillos de tamaño deseado, según las instrucciones del fabricante. Semillas 0,4-2 x 10 4 células en una placa de 12 pocillos. Cultivar las células durante la noche en un recipiente estéril 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad.
      NOTA: Teniendo en cuenta que el crecimiento rates varían dependiendo de las condiciones y líneas celulares, que podría ser preferible sembrar múltiples pozos para garantizar confluencia ideal para la transfección el día siguiente o la posibilidad de realizar transfecciones por duplicado.
  2. A la mañana siguiente, seleccionar un pozo que es de ~ 70% de confluencia para la transfección (véase la Figura 1B). Si no hay ningún pozo ha alcanzado este estado, esperar un día más.
    NOTA: el 70% de confluencia es ideal para las células HEK293. La transfección de células que son resultados más escasos en la muerte celular y la toxicidad. Transfección de células resultados sobre-confluentes en mala expresión.
  3. Añadir 60 l de tampón CE (del kit de transfección), 400 ng de plásmidos que codifican GPCR marcado y / o componentes de la maquinaria de clatrina, y 2,4 l de potenciadora en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como se describe en el protocolo del fabricante. Vortex durante 2 segundos para asegurar una mezcla suficiente, y girar en una microcentrífuga a 2.000 xg durante 2 segundos para recoger el líquido en la parte inferior.
  4. Añadir6 l Effectene como se describe en el protocolo del fabricante. Vortex durante 2 segundos, y giran a 2.000 xg durante 2 segundos en una microcentrífuga para recoger el líquido en la parte inferior. Espere 20 min para permitir la formación de micelas de complejos de transfección.
  5. Aspirar los medios de comunicación desde el pozo a ser transfectados. Añadir con cuidado 0,8 ml de DMEM con FBS al 10% a la mezcla de reactivo de transfección y mezclar pipeteando arriba y abajo lentamente para reducir romper las micelas. Añadir los medios de comunicación y a la mezcla de transfección bien muy lentamente desde el lado. Añadir cualquier mezcla de transfección restante del tubo de microcentrífuga al pozo utilizando una micropipeta.
    NOTA: Opcionalmente, añadir un extra de 0,5 ml de DMEM con 10% de FBS al pozo transfectadas las células para dar alimento adicional que resulta en más suave de la transfección y expresión transitoria inferior.
  6. Volver a las células a los 37 ° C incubadora durante 5 horas.
  7. Aspirar los medios de comunicación que contienen la mezcla de transfección. Reemplazar con 1 ml de DMEM con 10% de SFB. Permitirque las células crezcan durante la noche.
  8. El día siguiente, pasar las células a cubreobjetos sin revestir, previamente esterilizados en autoclave.
    1. Añadir 0,5 ml de tampón fosfato salino (PBS) con EDTA 1 mM a cada pocillo. Como alternativa, utilice 0.5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deja en la incubadora durante 1 min.
    2. Coloque la 3 ronda, estériles cubreobjetos de 25 mm en pocillos separados de una placa de 6 pocillos. Llene cada pocillo con 2 ml de los medios de comunicación. Empuje suavemente el cubreobjetos hasta el fondo del pozo para evitar que las células crezcan en la parte inferior del cubreobjetos.
    3. Agitar manualmente el bien para despegar las células de la parte inferior del pozo. Añadir 1 ml de DMEM con 10% de SFB para volver a suspender. Distribuir las células despegadas de 1 pocillo de una placa de 12 pocillos de manera uniforme entre los 3 cubreobjetos. Alternativamente, la placa células en 3 platos con fondo de cristal.
  9. Permitir que las células que crecen en los cubreobjetos durante al menos 48 horas antes de formación de imágenes. Asegúrese de que las células se separan hacia fuera y plana.

2.Imaging CCP y Dinámica de Carga Utilizando TIRFM

  1. Conjugado M1 anticuerpos anti-FLAG con tintes Alexa utilizando kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor acuerdo con el protocolo del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos pre-conjugados pueden ser comprados.
  2. Pre-incubar las células con los anticuerpos en una dilución 1: 1000 en 1 ml de medio de pre-calentado Leibovitz con FBS al 10%, o Opti-MEM con 50 mM HEPES pH 7,4 y 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (formación de imágenes medio), para etiquetar los GPCR marcado con FLAG en la superficie celular. Saltar estos pasos si las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, tales como las buenas prácticas agrarias, se utilizan como etiquetas (véase la discusión para más detalles).
  3. Transferir el portaobjetos a una cámara de imágenes de células vivas. Alternativamente, para los platos de fondo de cristal, aspirado medios anticuerpo etiquetado y añadir 700 l de medio de imágenes pre-calentado.
    1. Use un par de pinzas y doblar la punta de una aguja de calibre 25 en forma de gancho.
    2. Mantenga un par de pinzas en la mano dominante. Sostenga la aguja doblada en el other. Gire la aguja hasta las curvas de gancho hacia abajo hacia el cristal. Arrastrar suavemente el, lado del gancho de la aguja hacia abajo, a través de la parte inferior de una placa de 6 pocillos hasta que se engancha en el cubreobjetos. Tenga cuidado de no rayar la superficie del cubreobjetos, ya que separar las células. Levante suavemente el cubreobjetos desde el fondo del pozo. Equilibrar el cubreobjetos contra la pared del pozo para el apoyo.
    3. Utilice las pinzas para agarrar cerca del borde del cubreobjetos y mover el lado de células cubreobjetos hasta la cámara de formación de imágenes, y montar la cámara. Añadir 700 l (o la cantidad que proceda) del medio de imágenes pre-calentado. Maneje los cubreobjetos con cuidado, sin presión para evitar que se agriete o se rompa.
  4. Transferencia de la cámara en el microscopio y mantener la temperatura de las células a 37 ° C usando un calentador de etapa o una incubadora cerrada.
  5. Traiga células en foco utilizando un objetivo de inmersión 100X o 60X TIRF (1,45 NA o superior). Imagen de las células en epifluorescencia convencional o en contrafocales de los modos de iluminación (es decir, no TIRFM) para identificar células que expresan los constructos apropiados. Fuera de foco células son casi invisibles en la profundidad delgada de iluminación TIRF por lo que es difícil encontrar el plano focal y las células.
    NOTA: Algunos sistemas utilizan los mismos láseres para TIRFM a la imagen en epifluorescencia convencional, moviendo el ángulo de incidencia del láser por encima del ángulo crítico. Como una medida de seguridad importante, siempre tener en cuenta el ángulo del haz de láser, y siempre dirigirlo lejos del observador.
  6. Enfoque hacia abajo a la superficie inferior de una célula que expresa hasta que el contorno de la membrana de plasma alrededor de la célula desaparece y el centro de la célula aparece. Esto es más evidente con una proteína de carga localizada membrana plasmática tal como el receptor μ-opioide (véase la Figura 2A).
  7. Cambie a imágenes TIRF.
    1. Si el uso de los mismos láseres para formación de imágenes en epifluorescencia convencional, aumentar el ángulo de incidencia de laláser hasta que la fluorescencia fuera de foco en el interior de la célula desaparece, y sin contorno de la membrana de plasma alrededor de la celda se ve. (Comparar la Figura 2C a las figuras 2A y 2B)
      NOTA: En TIRFM, moviendo el plano focal hace que la imagen para ir completamente fuera de foco y / o tenue, y los niveles generales de fluorescencia disminuye debido a la menor profundidad de la iluminación. Por lo tanto, un método alternativo para cambiar a la iluminación TIRFM es primero enfoque en el centro de la célula en epifluorescencia confocal / convencional, a continuación, aumentar el ángulo de incidencia hasta que pierde la mayor parte de la fluorescencia y, a continuación, hacia abajo para centrar la membrana plasmática.
    2. Una vez en TIRFM, asegurar el láser de excitación refleja de vuelta a través del objetivo y no es visible por encima del objetivo. Confirme esto comprobando si el punto láser es visible.
      NOTA: En los modos de epifluorescencia o confocal convencionales, la iluminación láser es visible por encima del objetivo,tales como en el techo.
    3. Refine el enfoque para obtener una imagen nítida. Los principales componentes de la maquinaria endocítica, como clatrina, serán visibles en puntos lagrimales. Ajuste el enfoque de bien, así que los puntos lagrimales son tan redondos como sea posible.
      NOTA: Para la carga localizada en la membrana, ajustar el enfoque fino hasta que el filopodios parece distinta.
    4. Utilice un programa de adquisición para guardar todos los parámetros de imagen, como espejos y ángulo TIRF. Haga esto para todas las longitudes de onda necesarias.
  8. Analiza alrededor del cubreobjetos para encontrar células que expresan todos los marcadores endocítica deseados: el receptor μ-opioide y el adaptador de β-arrestina en el ejemplo mostrado en la Figura 3A. Seleccionar las células que están expresando, pero no sobre-expresan. Véase la discusión para más detalles.
  9. Una vez que se identifican las células, adquirir imágenes cada 3 s durante 10 min. Esto es suficiente para capturar el tiempo de vida de un PCC, ya que la vida media de un PCC en HEK293 células fotografiados en estas condiciones es around 40 seg 10-11. Esto permite a unos 12-14 frames para observar el PCCh. Por ejemplo ver películas 1. Repite todos los pasos para células adicionales de imagen.

3. Análisis de Endocítica Dinámica de Verificación Manual

Aunque la verificación manual de los tiempos de vida del PCCh se limita en gran medida por el número de entidades de contrapartida central que pueden ser detectados, todavía sigue siendo un medio preciso para la detección sin inmutarse por los cambios globales en los artefactos de imagen y detección. Véase la discusión para más detalles.

  1. Abra el archivo en ImageJ. Las imágenes se almacenan en una única pila de archivos TIFF con canales intercalados. Convertir imágenes a hyperstacks. Ir a Imagen> Hyperstacks> Stack para HyperStack. Introduce el número de canales adquiridos (es decir, si por imágenes β-arrestina y el receptor μ-opioide, entran 2), introduzca 1 para Z pila (TIRFM es un solo plano), y el número de fotogramas de la película (es decir, a 10 min película en 1 fotograma cada i 3 segs 200) en la ventana emergente.
  2. El formato HyperStack produce una ventana con dos barras de desplazamiento. Utilice la barra superior para moverse a través de los canales y la parte inferior para desplazarse a través del tiempo. Desplácese hasta el canal de la proteína cuya vida útil se ensaya.
  3. Mueva al bastidor 10 o 15 de la película para reducir la inclusión de entidades de contrapartida central preexistentes cuyas duraciones entero no son visibles. Dibuja un cuadro de región en torno a un punto elegido al azar.
  4. Cuente el número de fotogramas de una mancha es visible.
    NOTA: Consulte la Figura 3B y 3C para ejemplos de tres categorías morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19.

4. Análisis de Endocítica Dinámica de Reconocimiento Objetivo

Reconocimiento objetivo permite la detección de prácticamente todos los PCC fotografiados en una célula, pero puede ser propenso a error debido a la detección falsa de las estructuras erróneas. Véase la discusión para más detalles sopesar las ventajas y desventajas de correométodo ach. Varios programas, incluyendo los algoritmos a medida, se pueden usar para detectar objetivamente los PCC. Este protocolo describe reconocimiento objetivo de los PCC mediante Imaris, un software de análisis de imágenes (ver Materiales).

  1. Para empezar, abra el archivo de imagen RAW en el software de análisis de imágenes. Por defecto, aparece una imagen en color resultante de la fusión. Utilice la ventana "Ajuste de pantalla" para ajustar el brillo de un canal. Haga clic en el nombre de un canal para cambiar el color que se muestra. Desmarque la casilla situada junto al canal para evitar que su indicador (Figura 4A).
  2. Crear "puntos" haciendo clic en el icono con manchas anaranjadas. Véase la Figura 4B. Seleccione una región de interés (ROI) alrededor de la célula. Véase la Figura 4C. Utilice un retorno de la inversión para excluir áreas que detectarán incorrectamente bordes delanteros brillantes y placas. Analizar múltiples células con diferentes niveles de expresión por separado.
  3. Mida el diámetro de un punto a equipamientDe las estimaciones iniciales para el algoritmo. Cambie al modo de "Slice", y haga clic en los extremos polares de un punto para medir su diámetro. Ver Figura 4E. Haga esto durante 4 o 5 puntos redondos que parecen indicativos de un PCC en el apogeo de su estabilidad, después de la formación y antes de la escisión. Utilice estas medidas para calcular el diámetro promedio hasta la décima de micra.
  4. Detectar puntos. Vuelta al modo de "Supera". Seleccione el canal adecuado para la detección. Introduzca el diámetro medido promedio, por lo general 0,3 o 0,4 micras. Haga clic en la flecha de avance azul para cuantificar los Spots. Ver Figura 4E. Si se subestima el diámetro de manchas, puntos falsos de fluorescencia se identificarán como Spots. Si el diámetro es demasiado grande, se pasarán por alto los verdaderos puntos. Cuando no esté seguro, estimar un poco más bajo, y filtrar las detecciones incorrectas más tarde.
  5. Filtra Spots de Calidad. Ajuste el filtro para capturar la mayor cantidad de puntos posible sin respaldosuelo. El filtro de Calidad está seleccionada por defecto 20. Ver Figura 4F.
    1. Utilice la curva de "calidad" como una guía para establecer un umbral apropiado. Mueva el umbral inferior del filtro con el botón izquierdo del ratón para este primer chapuzón en la curva. Este es un buen punto de partida para el filtro, ya que esta posición suele refina la detección de manchas sólo visibles. Ver Figura 4F.
    2. Manchas detectadas aparecen en la película como esferas o centros de píxeles. Uso de la ficha "Colores", ajustar el color de las manchas de un color que contraste para que sea más fácil verlos. Desplácese por la película para revisar los puntos en cada fotograma. El objetivo es detectar la mayor cantidad de puntos posibles para la totalidad de su vida.
    3. Eliminar las manchas de dimmer o manualmente conectarlos en pistas continuas más tarde, ya que no se detectan bien en el transcurso de sus vidas.
    4. Retire las placas brillantes con un fil "Intensidad"ter, si es necesario. Haga clic en el signo más verde para añadir un nuevo filtro. Ver Figura 4F. Crear un filtro de Intensidad para filtrar o reducir Spots de un dado señales de fluorescencia. Utilice la curva generada Intensidad, (análogo a la curva de Calidad discutido en 4.5) para establecer el umbral. Utilice el botón izquierdo del ratón para eliminar el extremo izquierdo de la curva que representa los puntos más brillantes.
      NOTA: Las grandes estructuras de placa suelen estar entre los elementos más brillantes de la célula, y son fácilmente excluidos con este filtro.
    5. Desplácese por la película para asegurarse de que las entidades de contrapartida central se detectan como manchas y las placas más brillantes ya no se detectan. Figura 3D muestra una celda en la detección de los PCC (denotado por esferas blancas) se optimizan con el filtro de la calidad y las placas fueron excluidos con la calidad filtro.
    6. Reducir bordes de células brillantes con el filtro de calidad. Los objetos brillantes todavía pueden necesitar ser retirado manualmente, en el siguiente paso. Continuar con el azulflecha.
    7. Retire Spots aberrantes en la pantalla Spots Edit. Cambie a "Select" de modo. Haga clic en el acto. Es a su vez de color amarillo. Haga clic en "Eliminar". Haga clic en la flecha azul para continuar construyendo el algoritmo. Ver Figura 4G.
  6. Pistas medida. Establecer pistas de "movimiento browniano." El PCCh no debería presentar ningún movimiento dirigido, sólo deriva mínima a través de la membrana plasmática. Este algoritmo es el más apropiado para ese movimiento. Ver Figura 4H.
    1. Establezca la Distancia máxima a un valor pequeño como 0,7 micras. Ver Figura 4H.
      NOTA: Ajuste de una pequeña distancia minimiza la conexión de puntos adyacentes y todavía permite continuar el seguimiento de un sitio celular a través de CCP o el movimiento celular.
    2. Conjunto Max tamaño de hueco a 1. Esto permite una pista para continuar si sólo hay una trama que falta en sucesión. Haga clic en la flecha azul para calcular pistas. Ver Figura 4H.
      NOTA: Gap tamaños de más de 3 causas diferentes pistas para ser incorrectamente unidos entre sí.
    3. Cambiar la visualización de la pista a "Dragon Tail." Desplácese por la película de observación de la calidad de la detección. Si se están conectando puntos adyacentes, disminuir la Distancia máxima por debajo de 0,7 micras. Si Spots se rompen con demasiada facilidad, aumentar el tamaño máximo Gap. Haga clic en la flecha azul para crear pistas. Esto lleva a la pantalla de pistas de filtro. Ver Figura 4H.
  7. Filtro Pistas y exportación de datos. Utilice un filtro de "Intensidad" para eliminar placas brillantes adicionales. Utilice un filtro de "Desplazamiento" para eliminar los endosomas que entran en el campo de TIRF. Tenga cuidado, como manchas más largos tendrán desplazamientos más largos también. Haga clic en la doble flecha verde para completar el protocolo. Ver Figura 4E.
    1. Utilice la ficha Edit Tracks, con el icono del lápiz, para eliminar detecciones de falsos positivos de pistas que no pueden ser destituidos por filtros. Compruebe discontinuities o falsas conexiones. Para conectar dos pistas, selecciónelas mediante Ctrl-Izquierda-clic, a continuación, haga clic en "Connect" en el cuadro Edit Tracks. Para desconectar pistas en lugares separados, seleccione una pista y pulse "Disconnect". Seleccione varios Spots con Ctrl + clic izquierdo y clic en "Conectar" para crear una nueva pista. El método es el mismo para los puntos de edición, descritos en 4.5.7. Ver Figura 4J.
    2. Para exportar datos, vaya a la pestaña de estadísticas. Haga clic en el icono de un solo disco para exportar la estadística seleccionada. Haga clic en el icono que se parece a una serie de disquetes de exportar todas las estadísticas. La estadística de "Track Duración" contiene la longitud de las vías endocítica. Ver Figura 4K.

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Resultados

Uso de células vivas TIRF de Microscopía hemos registrado la dinámica endocítica de la μ-opioide-receptor (MOR), un receptor acoplado a proteína G (GPCR) y su endocítica proteína adaptadora β-arrestina. El constructo de β-arrestina se transfectó transitoriamente en una línea celular que expresa de forma estable MOR usando el protocolo descrito en la Figura 1, y la imagen 96 horas más tarde. El MOR en la línea celular estable es N-terminal marcado con una GFP sensible al pH. Esta proteína fluorescente só...

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Discusión

Aquí se describe el uso de TIRFM para visualizar la endocitosis mediada por clatrina (CME) a ​​nivel de individuo PCC en las células vivas en tiempo real. CME es un evento rápido y muy dinámico mediada por el efecto acumulativo de muchos eventos espacial y temporalmente separados individuales. La mayoría de los ensayos que se utilizan actualmente, como las mediciones bioquímicas de internalización mediante biotinilación superficie o de unión del ligando, la citometría de flujo o ensayos de células fijas que miden la can...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los Dres. C. Szalinski, H. Teng y M. Bruchez por su ayuda con Imaris, R. Vistein y D. Shiwarski por su ayuda técnica y consejo, y al Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin y Dr. W Almers por los reactivos y la útil discusión. Los fondos proporcionados por la subvención T32 NS007433 a SLB y NIH DA024698 y DA036086 a MAP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/Glucosa alta con L-glutamina y piruvato de sodioFisher Scientific 
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, sin calcio, sin magnesioGibco, de Life Technologies21600-010
Ácido libre de EDTAAmresco0322-500G
Suero fetal bovinoGibco, de Life Technologies10437-028
L-15 de Leibovitz, sin rojo fenolGibco, de Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, de Life Technologies
HEPESCellPURE de Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Reactivo de transfección
de 25 mm cubreobjetosFisher Scientific12-545-86
Matraces tratados con cultivo celular Corning, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Placa de cultivo celular de 6 pocillosGreiner Bio-One, de VWR82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sal de acetato de encefalina (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Kitde etiquetado de proteínasLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Software de análisis de imágenesBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, para análisis automatizado
Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti y accesorios necesarios, incluidos cubos de filtro y filtrosNikon
Nikon Brazo TIRF con los adaptadores necesarios para Nikon Eclipse TiNikonángulo de incidencia
iXon+ EMCCD cámara y adaptadoresAndor
SH3024301 Medio Para ajustar el

Referencias

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