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Artículo de método

A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

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DOI:

10.3791/51810

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8 de junio de 2014

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1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

La diferenciación de las células precursoras en osteoclastos está regulada por citocinas y factores de crecimiento. En este trabajo se describe una nueva técnica de transferencia génica para la diferenciación de osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo celular para diferenciar células precursoras en osteoclastos in vitro como método para estudiar los efectos de las citocinas en la osteoclastogénesis.

Resumen

La diferenciación y activación de los osteoclastos juegan un papel clave en el desarrollo de enfermedades musculoesqueléticas, ya que estas células están principalmente involucradas en la resorción ósea. Los osteoclastos pueden generarse in vitro a partir de células precursoras de monocitos/macrófagos en presencia de ciertas citocinas, que promueven la supervivencia y la diferenciación. Aquí se demuestran técnicas tanto in vivo como in vitro, que permiten a los científicos estudiar diferentes contribuciones de citoquinas a la diferenciación, señalización y activación de osteoclastos. El sistema de transferencia de genes de entrega de ADN en minicírculos proporciona un método alternativo para establecer un modelo relacionado con la osteoporosis y es particularmente útil para estudiar la eficacia de varios inhibidores farmacológicos in vivo. De manera similar, los protocolos de cultivo in vitro para producir osteoclastos a partir de células precursoras humanas en presencia de citocinas específicas permiten a los científicos estudiar la osteoclastogénesis en células humanas para aplicaciones traslacionales. Combinadas, estas técnicas tienen el potencial de acelerar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para terapias dirigidas específicas de osteoclastos, lo que puede beneficiar a millones de pacientes con osteoporosis y artritis en todo el mundo.

Introducción

Enfermedades musculoesqueléticas afectan a millones de personas en los Estados Unidos y del presente graves consecuencias para los sistemas de salud nacionales y locales 1. Estos trastornos se caracterizan por la pérdida de hueso y función de las articulaciones que requieren tratamiento extenso y largos períodos de recuperación. Comúnmente, un aumento relativo en el número y / o actividad de los osteoclastos, células especializadas para reabsorber el hueso, en la osteoporosis y la artritis se observa 2. En condiciones fisiológicas el número y la actividad de los osteoclastos está regulada por el activador del receptor del factor nuclear κ-B ligando (RANKL), que es producida por los osteoblastos. La osteoprotegerina (OPG), un receptor señuelo para RANKL también es producida por los osteoblastos 3 modelos animales in vivo que implican la sobreexpresión sistémica de sRANKL, o supresión de OPG son muy valiosa en la investigación de la osteoporosis.; Sin embargo, estos métodos requieren la generación de ratones transgénicos 4,5. Aquí, una nueva alternativamétodo de sobreexpresar sRANKL para el estudio de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-se describe. Específicamente, minicircle (MC) la tecnología del ADN y los métodos de entrega hidrodinámicas se utilizaron para lograr la transferencia de genes de sRANKL in vivo e sobreexpresan ratón sRANKL sistémicamente 6.

Este método también es complementaria a otros modelos in vivo de la osteoporosis, tales como la modulación hormonal de los osteoclastos siguientes ovariectomía 7 y la intervención dietética con dieta baja en calcio 8. Estos modelos son muy útiles para estudiar diferentes aspectos de los trastornos musculoesqueléticos relacionados-sin embargo, requieren de procedimientos quirúrgicos y pueden durar hasta varios meses, a un costo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedores es un modelo animal experimental en que la extirpación de los ovarios conduce a la deficiencia de estrógenos imitando así la osteoporosis posmenopáusica humana 10. La osteoporosis post-menopáusica humana, una condición donde Defici estrógenoparencia conduce a un mayor riesgo de fracturas óseas y la osteoporosis afecta a aproximadamente ocho millones de mujeres en los Estados Unidos solamente. Aunque el modelo OVX es útil para la osteoporosis post-menopáusica que ofrece ventajas limitadas en el estudio de la osteoporosis en general. El estrógeno suprime la pérdida de hueso, mediante la inducción de osteoclastos y la inhibición de la apoptosis de los osteoblastos, por lo tanto, en su ausencia se observa un aumento de la actividad de los osteoclastos 10-12. Un desequilibrio en la relación RANKL-OPG que favorece la resorción ósea también se observa 13. Sin embargo, la deficiencia de estrógenos en vivo también se acompaña de disminución de los niveles de transformación del factor de crecimiento β (TGF β), aumento de la interleucina-7 (IL-7) y de TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Como estas citoquinas han conocido funciones moduladoras de remodelación ósea independiente de la vía de RANKL, es imposible atribuir cualquier activación de los osteoclastos exclusivamente al eje RANKL-RANK. El modelo que se describe en este documento permite a los investigadores estudiar en vivo eje RANKL a RANK en la osteoclastogénesis y la pérdida ósea sin las citoquinas pro-inflamatorias en comparación con modelos de roedores OVX.

Además, las técnicas de la osteoclastogénesis in vitro son herramientas esenciales para el estudio de la activación de los osteoclastos para posibles tratamientos terapéuticos de las enfermedades musculoesqueléticas. Estudios anteriores también han demostrado que el cultivo de macrófagos derivados de médula ósea de ratón (BMMs) con macrófagos de ratón factor estimulante de colonias (M-CSF) y el ratón sRANKL puede conducir a la diferenciación de los osteoclastos 3,16,17. Aquí se describen los protocolos para generar células similares a osteoclastos multinucleadas de médula ósea de ratón, así como de células de sangre periférica humana (PBMC) in vitro 18. Los ensayos basados ​​en células necesarios para definir un osteoclastos terminales diferenciadas y completamente funcional madura también se describen brevemente. Estas técnicas in vitro complementan la novela en el enfoque vivo y juntos sirven como pherramientas de investigación para estudiar owerful diferenciación de los osteoclastos y la activación. El uso de estos sistemas, los científicos son capaces de generar los osteoclastos in vivo e in vitro y definir los estímulos y señales requeridas para su proliferación y activación, así como probar la eficacia de los inhibidores farmacológicos y biológicos.

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Protocolo

1. Entrega hidrodinámico de ADN MC sRANKL

  1. Entrega hidrodinámica a través del ratón de la cola de la vena
    1. Pesar el ratón antes de la inyección en la vena de la cola. Diluir sRANKL o proteína fluorescente verde (GFP) MC en solución de Ringer (pre-calentamiento a 37 ° C) en un volumen total de ~ 10% del peso corporal del ratón.
    2. Caliente el ratón en una jaula durante 10 min antes de la inyección con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer que las venas laterales (LVs) visibles. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia.
    3. Tan pronto como los volúmenes lógicos están dilatados y visibles, transferir el ratón a la inmovilización e inserte el conector lo suficiente en el barril para restringir el movimiento. Monitorear el ratón para la actividad normal, como la respiración. Ajuste el tapón de inmovilización, si es necesario.
    4. Desinfectar el área de la inyección de 3/4 de la punta de la cola con un algodón con alcohol. Utilice una aguja de 27 a 30 para el ratón inyección en la vena de la cola. Sostenga la cola firmemente con una mano e inserte la aguja ena la vena de la cola. Aplique presión sobre la jeringa y completar la inyección dentro de 5-7 seg.
    5. Retire la aguja de la vena de la cola y aplique presión con un algodón sobre el lugar de la inyección para detener el sangrado. Monitorear el ratón durante 15-30 minutos, a continuación, transferir el ratón de nuevo a vivarium una vez que el ritmo de la respiración se reduce a su ritmo normal.
  2. Confirmación de la expresión y cuantificación de Ratón Serum TRACP5b Mensaje Gene Transfer sistémica Ratón sRANKL
    1. Caliente el ratón en una jaula durante 5-10 minutos con el fin de dilatar los vasos sanguíneos y hacer LV visible. Monitorear el ratón con cuidado para evitar la deshidratación y la hipertermia.
    2. Hacer una pequeña incisión con una cuchilla a la cola del ratón en un sitio de una cuarta parte de la punta de la cola.
    3. Recoge alrededor de 100 l de sangre en tubos de separación de suero.
    4. Incubar los tubos de separación de suero a temperatura ambiente durante 30 min.
    5. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min y recoger el suero. Store suero en -80 ° C para su posterior análisis.
    6. Realizar sRANKL ELISA y ensayo de TRACP5b suero de ratón en muestras de suero utilizando un kit comercial disponible.

2. In vitro generación de osteoclastos de Ratón BMMs

  1. Aislamiento y cultivo de BMMs
    1. El aislamiento de la tibia y los huesos de fémur: La eutanasia el ratón donante con CO 2, y desinfectar las piernas con etanol al 70%. Diseccionar desde el pubis hasta el hueso calcáneo, para quitar los huesos fémur y la tibia intacta.
    2. Quite la piel y el músculo cuidadosamente sin dañar el hueso. Coloque fémur procesado y hueso de la tibia en una placa de Petri que contiene tampón fosfato salino (PBS).
    3. La eliminación de la médula ósea: Corte la punta en un lado de los huesos del fémur y de la tibia y enjuagar la médula ósea en un tubo de 50 ml utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 25, cargado con α-MEM que contiene 1% de penicilina / estreptomicina (osteoclastos Cultura Medio / OCM).
    4. Proceso de médula ósea: Mezclar y transferir la suspensión de la médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml pasando a través de un filtro de células de 70 m de nylon. Centrifugar las células a 300 xg y volver a suspender en α-MEM que contiene 1% de penicilina / estreptomicina y 10% de FBS (medio de osteoclastos Cultura / OCM (+)).
  2. Cultura de los macrófagos
    1. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
    2. Plate 1 x 10 6 células por pocillo en una placa de 6 pocillos o 3 x 10 5 células a cubreobjetos de vidrio (5 mm) o rodajas de dentina colocados en placas de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C.
    3. Aspirar todos los medios que contienen las células no adherentes y se incuban las células a 37 ° C con OCM fresca (+) que contiene 25 ng / ml ratón M-CSF durante 48 horas.
    4. Aspirar todos los medios de comunicación y se incuban las células a 37 ° C con frescos OCM (+) un medio que contenía 25 ng / ml ratón M-CSF, y 30 ng / ml sRANKL ratón para iniciar la osteoclastogénesis. Reponer los medios de comunicación cada 3 días según sea necesario.
    5. Se cultivan las célulasdurante aproximadamente 6-8 días para formar células multinucleares gigantes capaces de resorción ósea. En cuanto aparezcan células multinucleadas, realice TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) tinción utilizando un kit comercial disponible, y cuando está completamente madura, realizar ensayos funcionales. Visualizar anillos de actina F en cubreobjetos utilizando mancha faloidina y la imagen de las células unidas a la dentina rebanadas por microscopía electrónica de barrido (SEM) como se ha descrito previamente 19.

3. Generación de osteoclastos in vitro de las PBMC humanas

  1. Aislamiento de PBMC humanas
    1. Añadir 10 ml de pre-calentado Histopaque-1077 en un tubo de 50 ml.
    2. Filtro de leucocitos vacío obtiene a partir del banco de sangre con PBS estéril en un tubo de 50 ml (proporción de 1:1 de sangre con PBS). Capa de la sangre diluida sobre la solución Histopaque muy lentamente, asegurándose de que la sangre no se mezcla con el histopaque.
    3. Centrifugar las muestras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugación, aislar cuidadosamente la capa de la capa leucocitaria blanca que contiene las células blancas de la sangre y transferir a un nuevo tubo de 50 ml.
    4. Diluir las células con PBS y se centrifuga de nuevo a 650 xg durante 5 minutos para recoger las células.
    5. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en OCM (-) de los medios y contar las células utilizando un contador de células.
  2. Plating y cultivo de CMSP
    1. Resuspender las células en las OCM (+) los medios de comunicación y la placa de 8 x 10 6 células / ml por pocillo en una placa de 6 pocillos o 1 x 10 6 células / ml por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células de la placa sobre cubreobjetos de vidrio (5 mm) según se requiera para obtener imágenes de inmunofluorescencia, así como en secciones de hueso adecuados para ensayos de resorción ósea como anteriormente descritos 20.
    2. Cambio de los medios de cultivo, la reposición de las células con M-CSF humano cada 2-3 días o según sea necesario. A continuación, proceder a la etapa de diferenciación en el día 5 por la adición de 30 ng / ml de sRANKL humana junto con 25 ml de M-CSF ng / humano en OCM (+) medios para iniciar osteoclastogeneses.
    3. Se cultivan las células durante aproximadamente 14 a 21 días para formar células multinucleares gigantes. Tan pronto como aparecen células multinucleadas, a continuación, estas células se pueden etiquetar para TRAP, y cuando está completamente madurado, ensayos funcionales pueden llevarse a cabo. Anillos de actina F se pueden visualizar en cubreobjetos utilizando tinción phalloidin. La morfología de las células puede examinarse en células unidas a la dentina rebanadas por SEM.

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Resultados

Aquí, una técnica de transferencia de gen nuevo para la diferenciación de los osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo de células para la diferenciación de células precursoras en los osteoclastos in vitro como un método para estudiar los efectos de las citoquinas en la osteoclastogénesis se describen. En la Figura 1, se muestran los resultados representativos de la transferencia de genes exitosa de GFP y ratón sRANKL MC en ratones. En la Figura 2, se muestran las i...

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Discusión

Las afecciones musculoesqueléticas son las principales causas de morbilidad y discapacidad, y se componen de más de 150 enfermedades y síndromes; que afecta hoy a unos 90 millones de estadounidenses. Inflamación de las articulaciones y la destrucción ósea son las características predominantes de los trastornos musculoesqueléticos, como la artritis y la osteoporosis. La osteoporosis es una enfermedad que debilita la integridad ósea, a menudo conduce a las fracturas de los huesos. La artritis es una enfermedad crónica car...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación fue financiada en parte por las becas de investigación de los NIH R01 AR062173 y SHC 250862 a la IEA. ES es el beneficiario de la beca predoctoral NIH T32 CTSC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
alpha-MEMTecnologías de Vida 12561-056
M-CSF HumanoMiltenyi Biotec130-096-492
Ratón M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Ligando RANK Humano - solubleMiltenyi Biotec130-094-631
Ratón RANK-Ligando - solubleMiltenyi Biotec130-094-076
Restricción de venas de cola para ratonesBraintreeTV-150 Ratón STD
TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit R& D systemsMTR00
Kit de fosfatasa ácida, leucocitos (TRAP) Sigma387A
Ensayo MouseTRAP sistema de inmunodiagnósticoSB-TR103

Referencias

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