Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

El procesamiento sensorial en el cerebro de los mamíferos normalmente abarca múltiples circuitos neuronales conectadas recíprocamente-, cada uno de los cuales extrae los rasgos particulares de la información sensorial. En las vías sensoriales, procesamiento de la información temprana es vital para la percepción y el comportamiento normal. En el sistema olfativo accesorio (AOS), el bulbo olfativo accesorio (AOB) es el circuito de los nervios principales que une la periferia sensorial a las estructuras posteriores que determinan el equilibrio hormonal ^1,2, la agresión ^{3, 4} y la excitación. Como tal, el procesamiento de la información dentro de este circuito está fuertemente ligada a los cambios en el comportamiento animal.

El bulbo olfativo accesorio se encuentra en ratones y ratas en la cara dorsal / caudal / posterior del bulbo olfatorio principal (MOB) debajo de la densa, vascularizado sinusal rinal. La AOB recibe inervación aferente de los axones de las neuronas sensoriales vomeronasal periférica (VSNS) que residen en el órgano vomeronasal (OVN), un Small tubo y sin salida en el hocico anterior justo por encima del paladar blando. Estos axones atraviesan la delicada hoja de tejido septal en el límite medial de los pasajes nasales. Varios estudios han investigado AOB respuestas neuronales a las fuentes de olores adicionales opcionales (tales como la orina del ratón) in vivo utilizando ratones anestesiados ^5-7 o animales libremente-Explorando ^8. La heroica anestesiados estudios in vivo que participan (a) traqueotomía para asegurar una anestesia profunda y prevenir la aspiración del líquido estímulos ^5-7, (b) la estimulación del ganglio simpático cervical ⁶ o canulación directa del órgano vomeronasal ^5,7 introducir olores volátiles y (c) craneotomías con o sin ablaciones del lóbulo frontal para permitir el avance del electrodo en la AOB ^6. Awake / comportándose estudios ^8-10 implantación quirúrgica involucrados de microdrive. En suma, estos paradigmas experimentales son de gran alcance, pero extremadamente difícil y a menudo requieren anestesia.

(ex vivo) con cierto éxito ^11-15. Debido a que las conexiones entre el OVN y AOB permanecen ipsilateral, y porque el tejido septal línea media puede estar expuesto a superperfundido oxigenada en un solo hemisferio, Hemos tratado de desarrollar un enfoque de este tipo in vivo de un solo hemisferio ex para aislar estas estructuras y manteniendo su conectividad funcional. Recientemente hemos tenido éxito en el logro de este objetivo ^16. Esta preparación mantiene tanto el OVN y AOB vivo y funcionalmente conectado por lo menos 4 - 6 de HR porque tanto los axones (a lo largo de la línea media tejido septal suave) y AOB son relativamente poco profundas <600 micras características que son accesibles a superfused líquido cefalorraquídeo artificial oxigenada ( LCRa). Esta VNO-AOB ex vivo preparación permite la introducción de estímulos controlados en el VNO a través de una cánula delgada, yacceso visual directo a la pequeña AOB para la colocación de electrodos específica y / o microscopía de fluorescencia en vivo. Este método es ventajoso si se desea estudiar estos circuitos en ausencia de anestésicos. Debido a que este enfoque corta conexiones centrífugas, que no se adapta bien a las investigaciones sobre la modulación de la función centrífuga AOB. El VNO-AOB ex vivo preparación es difícil de aprender, pero una vez logrado produce una plataforma fiable sobre la que investigar la organización del circuito, procesamiento de información, y la plasticidad neural en este circuito sensorial de gran alcance.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional del sudoeste UT, y se eligieron con el fin de minimizar el estrés, molestias, y dolor experimentado por los animales de experimentación.

1. Cámara Disección

Una cámara de disección de encargo y pequeña, tablón plástico fino se requieren para obtener los mejores resultados (Figura 1). Construir o obtener una cámara de este tipo antes de intentar este protocolo.

2. Soluciones de disección

1. Preparar 1 L de estándar de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) para su uso en los pasos 3.22 a 5.4. Añadir NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, _CaCl2 2 mM, _MgCl2 1 mM, _NaHCO3 25 mM, NaH ₂ PO ₄ 1,25 mM, mio-inositol 3 mM, piruvato de sodio 2 mM, ascorbato de sodio 0,4 mM, y glucosa 25 mM a 1 l de agua libre de pirógenos.
2. Prepare el LCRa disección inicial (200 ml) parautilizar en los pasos 3.3 a 3.22. Tomar 200 ml de Estándar LCRa y aumentar la concentración de MgCl ₂ por 9 mM mediante la adición de 0.366 g de _MgCl2 hexahidratado.
3. Preparar la solución estándar de Ringer para llevar a los estímulos a la VNO a través de la cánula para el uso en los pasos 04.11 a 05.04 que contiene NaCl 115 mM, KCl 5 mM, _CaCl2 2 mM, _MgCl2 2 mM, _NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM.
4. Burbuja el 0,8 L de LCRa estándar y 0,5 L de Ringer con 95% de O _2, 5% de CO ₂ de gas en un baño de agua a 37 ° C durante un mínimo de 15 min hasta su uso.
5. Burbuja de los 200 ml de LCRa disección inicial con 95% de _O2, 5% de CO ₂ gas en hielo durante 15 a 20 min, hasta que llega a 4 ° C.

3. Disección primaria

1. Prepare el área de disección. Coloque tres platos de 35 mm de Petri, oxigenada LCRa, tijeras de decapitación, curvas tijeras de disección, disección recta tijeras, fórceps Adson, un cuero cabelludo # 11el mango y la hoja y una hoja de afeitar en el hielo.
2. Después oxigenada LCRa se ha enfriado a 4 ° C, profundamente anestesiar al animal en una cámara de desecación con 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorano). Realizar pruebas de arrastre de la cola y los pies para asegurarse de que el animal está profundamente anestesiado.
3. Una vez que se confirmó la anestesia profunda, decapitar al animal e inmediatamente colocar la cabeza en una placa de Petri llena de la LCRa disección refrigerada. NOTA: Sumergir el tejido en la disección fría LCRa para mantenerlo fresco durante todo el procedimiento cuando no esté en uso.
4. Retire el aspecto inferior (ventral faringe, mandíbula inferior y la lengua) con unas tijeras curvas.
5. El uso de fórceps Adson deglove (cáscara) de la piel superficial y las inserciones musculares del cráneo. Pelar el cuero cabelludo de caudal a rostral hasta el único sitio de unión está en los dientes frontales. Cortar el tejido en el punto de unión utilizando unas tijeras curvas. Quitar los ojos, sujetándola con pinzas y tire de ella fuera de la preparación. Noído el final de la técnica de disección, evitar el exceso de fuerza en el cartílago nasal delicada utilizando las pinzas de Adson con inserciones musculares libres de los huesos de la mandíbula superior. NOTA: Desconecte el cuero cabelludo de la parte caudal del cráneo con tijeras rectas.
6. Con las tijeras rectas, cortadas por la línea media del cráneo de caudal a rostral hasta que las puntas de las tijeras son de unos pocos milímetros en los huesos frontales (justo antes del seno rinal).
7. Retirar los huesos parietal y frontal del cráneo usando fórceps Adson. NOTA: Las piezas del hueso frontal a menudo permanecer unidos a los huesos nasales caudal al seno rinal. Retire las piezas con cuidado de no tocar los bulbos olfatorios.
8. Utilice el bisturí para realizar un corte coronal a través del frontal mm caudal del lóbulo 2 a los senos y luego retire el caudal cerebro para el corte. Asegúrese de que la punta de los contactos de bisturí del contorno óseo del cráneo ventral para cortar por completo el tejido posterior. NOTA: Esto permiteeliminación de la mayoría del cerebro sin poner la tensión mecánica en las vías olfativas laterales o los bulbos olfatorios.
9. Retire los aspectos caudales expuestas de cráneo ventral con tijeras rectas. Deje los senos y el tejido nervioso restante.
10. Retire el arco cigomático y los músculos faciales en el lado derecho anatómico del cráneo con unas tijeras rectas
11. Gire el hocico largo (lado ventral hacia arriba) para exponer el techo de la boca.
12. Corte y retire el paladar inmediatamente caudal a los incisivos. Para ello, la inserción de la punta de la hoja de bisturí bajo el paladar paralelo al techo de la boca y luego mover la pala hacia los incisivos.
13. Sujete el liberado (rostral) borde del paladar con fórceps Adson y quitar tirando en sentido caudal.
14. En el lado izquierdo anatómica del cráneo, utilizar la hoja de bisturí para extender los agujero palatino caudalmente, a partir de las pequeñas agujero cerca de los molares. Lograr esto mediante la inserción de la punta del bisturí blades en el vacío cerca de los molares y la rotación de la muñeca. NOTA: Tenga mucho cuidado de utilizar sólo la punta de la hoja - un corte profundo puede dañar el tejido septal.
15. Con la punta de la hoja de bisturí, cortado de los agujero palatino a través de los incisivos, a partir rostral a la anatómica órgano vomeronasal izquierda. Utilice varios cortes de puntuación. No dañe el tejido septal y los nervios vomeronasal insertando la hoja demasiado profundo.
16. Girar el tejido de modo que el cráneo dorsal está orientada hacia arriba y luego orientar la cuchilla de la maquinilla de afeitar recta vertical (paralelo a la línea media) en el extremo caudal de la preparación.
17. En el borde ventral del tejido, toque el filo de la cuchilla de afeitar inmediatamente a la izquierda de la línea media. Agite suavemente la hoja y moverse a lo largo del foramen palatino (izquierdo cortado región introducida en el paso 3.14).
18. En el borde dorsal del tejido, coloque el borde de corte de la maquinilla de afeitar inmediatamente a la izquierda de la línea media (menos de 1 mm).
19. Custodiala cuchilla paralela a la línea media, a oscilar la cuchilla de afeitar lentamente con la presión hacia la parte anterior del tejido. Observe la resistencia en la lámina cribosa. Pare inmediatamente después de romper esta resistencia. NOTA: En este punto, el hemisferio derecho se afloja desde el hemisferio izquierdo. La conexión sólo queda es entre los hemisferios a lo largo de la dorsal del hocico por delante de la lámina cribosa.
20. Separe los hemisferios agarrando ellos cerca de los lados caudales con los dedos enguantados y suavemente girando lateralmente y anteriormente. NOTA: Este paso es una fuente de variabilidad experimental, especialmente en ratones con hocicos desviados o frágiles (por ejemplo, los ratones de más edad). Además, al intentar hacer girar los hemisferios de distancia el uno del otro, si se encuentra una fuerte resistencia puntuación de la hocico dorsal (anterior a la lámina cribosa) para debilitar los tejidos conectivos. Al hacerlo, tenga mucho cuidado de no introducir el bisturí profundamente, lo cual puede dañar el ti septalncidencia y nervios vomeronasal.
21. Aplique una pequeña cantidad (50 a 100 l) de goma de tejido a la tabla y colocar suavemente el borde lateral del hemisferio derecho en la cola utilizando fórceps Adson. Retire el exceso de humedad de la cara lateral de la preparación con una toalla de papel para evitar la polimerización prematura de pegamento y la adherencia suelta a la plancha. NOTA: Aplicar unas pocas gotas de la LCRa disección refrigerados en la muestra para acelerar la polimerización de pegamento después de tejido se coloca en la cola. Esto asegura que el tejido se mantiene firmemente retenida a la plancha.
22. Colocar una pequeña cantidad (3-5 mm de diámetro, 2 mm de profundidad) de grasa de vacío en el medio de la cámara de disección secundaria y colocar el lado de la plancha opuesto el tejido firmemente contra la grasa. Llenar inmediatamente la cubeta de disección con LCRa disección fría, traslado a la zona de disección fina y comenzar la perfusión con LCRa estándar oxigenada. Oriente el tablón para que el bulbo olfativo está directamente en elcorriente de LCRa estándar oxigenada.

4. Disección Secundaria

1. Retire cualquier contralateral (izquierda) bulbo olfatorio visible o tejido cortical de la preparación utilizando unas pinzas finas. Apriete juntos los pinzas finas (formando una punta roma semi), y luego se coloca en la parte dorsal y caudal del tejido cerca de la línea media. Pase suavemente el fórceps pellizcados en la línea media, descamación del tejido lejos del hemisferio derecho lentamente en movimiento anterior. Quite todo el tejido contralateral, incluyendo el tejido bulbo olfatorio contralateral. Tenga mucho cuidado de no apuñalar a través del tejido, que puede causar daños en el AOB o el nervio vomeronasal.
2. Observe la duramadre blanco a lo largo de la superficie dorsal / medial del bulbo olfatorio. Tear este duramadre lo largo del borde dorsal / caudal del bulbo olfatorio agarrando en la parte blanca de la duramadre con dos pares de pinzas finas y tirar de ellos lejos de ese punto. La duramadre es fuertementeenvuelto alrededor de los bulbos olfativos, y puede fácilmente cortar en sí a través del tejido mientras está siendo retirado. Evitar daños en la superficie medial del bulbo olfatorio y la propia AOB. NOTA: Si la duramadre resiste desgarrar fácilmente en este punto, introducir un pequeño corte con tijeras de disección de punta fina de primavera para facilitar la separación.
3. Poco a poco y con cuidado retire la corteza frontal con unas pinzas finas, sin dañar los bulbos olfatorios subyacentes. Observar una colección de vasos sanguíneos que aparecen como una red semitransparente inmediatamente caudal a la AOB. Eliminar a esta red con unas pinzas finas para facilitar la penetración del electrodo en experimentos electrofisiológicos. Sujete la red con pinzas, ya que se separa de la AOB durante la retracción corteza frontal y retírela tirando en sentido caudal y medial, con cuidado de no tocar la AOB. Una vez que la corteza frontal se ha separado de los bulbos olfatorios, retírelo cortando con unas pinzas ventral y posterior a la AOB. NOTA: Tenga extreme cuidado con absorción neta, ya que si se hace demasiado áspero la capa glomerular puede resultar dañado.
4. En la cavidad nasal contralateral expuesta, eliminar cualquier tejido septal contralateral restante (hoja endeble amarillento que contiene vasos sanguíneos) usando las pinzas finas. Agarre el tejido en la región caudal / dorsal (cerca del hueso septal) y tire / levantar el tejido hacia el lado anterior. NOTA: El tejido septal contralateral se puede quitar de forma inadvertida durante el paso de hemisección (Paso 3,20). En tal caso, observar un blanco, el cartílago septal avascular y el hueso septal vascularizado ligeramente transparente. Si este es el caso, el paso 4.4 se puede omitir.
5. Retire con cuidado el contralateral VNO ejecutando un solo punto de las pinzas finas entre el cartílago septal y el "ala" VNO (una fina pieza de tejido óseo que se extiende a lo largo del borde dorsal de ambos VNOs.
   1. Tras el desprendimiento del ala del cartílago, mueva la punta del fórceps ventralmenteen el OVN contralateral cerca de la línea media. Repita este paso en varios lugares a lo largo del eje de caudal / rostral del contralateral VNO para aflojarla, lo que le permite ser retirado agarrando con una pinza y el levantamiento de distancia.
6. Preparar para eliminar el cartílago septal haciendo un corte en el borde ventral / caudal (en el que se estrecha a una tira avascular blanco a lo largo del borde ventral del hueso septal) con unas pinzas finas.
7. Quitar el cartílago septal pellizcando juntos las pinzas finas para hacer una punta roma semi. Identificar el corte realizado en el paso 4.6, inserte el fórceps pellizcados detrás (lateral) a la corte, a continuación, levante lentamente el cartílago lejos del tejido septal y procediendo rostral. NOTA: No destruir el tejido septal subyacente. Como se levanta el cartílago, observe la hoja subyacente de estiramiento del tejido septal debido a adherencias laxas al cartílago. Un movimiento periódico, suave y estable de las pinzas finas pellizcados por este sitio de una flojadhesion puede facilitar en gran medida la separación exitosa de las dos estructuras.
8. Use un par de pinzas # 3 con una punta doblada para retirar el hueso septal. Enfoque el hueso septal en un ángulo casi paralelo al plano del hueso septal. Inserte el diente curvo entre el tejido y el hueso del tabique septal. Sujete el hueso con las pinzas y suavemente mover la columna vertebral y hacia atrás hasta que las grietas cerca de la lámina cribosa. NOTA: En algunos casos, el hueso septal resistirá rompiendo cerca de la lámina cribosa. En este caso, utilice unas pinzas finas para anotar suavemente el hueso septal lo largo de la / eje ventral dorsal justo anterior a la placa cribiforme, a continuación, repita el paso 4.8.
9. Quitar el cartílago rostral blanca justo al VNO apretando con un par de pinzas finas en la entrada y tirando rostral con otro par de pinzas finas.
10. Fije la cánula de poliimida a un dispositivo de perfusión rápida e iniciar el flujo de la solución de Ringer (0,1-0,3 ml / min) a través de la cánula de poliimida.NOTA: Caudal Medida con un, metro de flujo pequeño volumen en línea. El uso del dispositivo de conmutación de estímulo neumática controlada por ordenador reduce los cambios de caudal durante la estimulación. Compare las respuestas neuronales para poner a prueba los estímulos con respuestas a un estímulo maqueta (controlar la solución de Ringer) para asegurar que las respuestas son específicas de estímulo.
11. Oriente la cánula paralelo a la entrada VNO. Cuando la cánula está satisfactoriamente paralelo a la entrada VNO, ver como la presión de salida hace que el VNO a "inflar", que conduce a la evacuación del vaso sanguíneo. Inmediatamente inserte la cánula en el OVN, manteniendo el ángulo de la constante de la cánula de manera que permanece paralelo a la abertura VNO. NOTA: Puede ser útil para mantener la cánula con un par de pinzas finas contra la plancha de plástico y usar otro par de pinzas finas para inclinar el extremo de la cánula ligeramente hacia arriba. Si uno coloca inadvertidamente la cánula detrás del VNO, el flujo de salida también puede provocar que el vaso sanguíneo VNOpara evacuar, lo que lleva a la impresión se llevó a cabo una canulación correcta. La ubicación apropiada se puede confirmar mediante la incorporación de un colorante en la solución de Ringer. Cuando la cánula se coloca correctamente, el colorante sólo debe salir por la entrada VNO. Además, se puede confirmar la colocación adecuada, garantizando que la cánula es fácilmente visible a través de la cara medial semi-transparente del OVN.
12. Mueva el tablón plástico lentamente hasta que el AOB está en el flujo directo de la norma LCRa, teniendo cuidado de no desplazar la cánula del VNO. La disección es completa y valoración de la función fisiológica puede comenzar de inmediato. Paso 5 describe brevemente un enfoque para hacer una evaluación de este tipo.

5. Evaluación

1. Penetrar en la superficie de la AOB con un microelectrodo de vidrio de borosilicato 2-4 MΩ unido a un amplificador extracelular y el osciloscopio.
2. Avanzar lentamente el microelectrodo a una profundidad de 100-200 micras de lasuperficie a una velocidad de 50 m / min. NOTA: A esta profundidad del tejido, uno encontrará acción espontánea posibles formas de onda ocasionales ejemplificadas por breves desviaciones agudas, (~ 1-2 mseg) en la tensión de microelectrodos.
3. Al encontrarse con un potencial de la forma de onda de acción, detener el avance de la microelectrodos.
4. Observar y / o grabar la tasa potencial de acción, mientras que el cambio de la solución de entrega de estímulos de control de Ringer a un conocido activador de la actividad VSN (por ejemplo, solución de Ringer que contenía KCl 50 mM). Si la disección tuvo éxito, se puede observar un cambio de estímulo-dependiente en la acción tasa potencial o potencial de campo local. NOTA: No todas las neuronas AOB responderán a cada estímulo con un aumento en la tasa de disparo (incluyendo la solución de Ringer que contiene 50 mM de KCl). Una disminución de estímulo-dependiente en la tasa de disparo también indica la conectividad funcional y una disección de éxito. En el caso de que se encuentran dos o más neuronas queno responden a la estimulación del OVN, o si no se observan los potenciales de acción después de múltiples penetraciones de electrodos, esto sugiere una disección sin éxito. Si este es el caso, una nueva disección puede ser iniciado en el Paso 3.

Lograr el éxito con esta preparación requiere práctica extensa, y tiene varias fases en las que puede fallar. Hay que esperar a requerir múltiples intentos antes de tener éxito. Se requiere que la cámara de la disección de encargo para la realización exitosa de este protocolo, y se debe obtener antes de comenzar las etapas posteriores de la disección. El diseño de la cámara presenta en la Figura 1 es suficiente para este propósito, y puede estar hecho de plástico relativamente de bajo costo con exigencias mínimas de mecanizado. Si uno carece de la capacidad para producir una cámara de este tipo, las empresas de mecanizado locales o en línea pueden ser consultados y puedan construir la cámara por un cargo.

Una gran fuente de variabilidad a través de las preparaciones es la densidad y fragilidad de los huesos del cráneo y el hocico de los animales de experimentación. Durante los pasos de hemisección (Pasos 3.14 a 3.20), el objetivo es aislar ambos órganos vomeronasal junto con el tejido septal ipsilateral yipsilateral bulbo olfativo accesorio. Sin embargo, no es infrecuente que el tejido septal a permanecer unido al hemisferio contralateral, especialmente cerca de los puntos de fijación a los huesos dorsales de la hocico. Figura 2 muestra un ejemplo de una hemisección eficaz e ineficaz.

Otros surgen errores comunes de disección durante la disección fina, durante el cual los axones del nervio vomeronasal se pueden dañar en el tejido septal cerca del órgano vomeronasal (Figuras 3A y 3B) o cerca de la AOB (Figuras 3C y 3D). Estos y otros eventos tendrán como resultado la conectividad incompleta entre VSNs y la AOB, haciendo los preparativos inutilizable.

El último obstáculo para el éxito de la preparación es el paso canulación VNO (paso 4,11). La colocación correcta de la cánula VNO se traducirá en la presurización de los lúmenes VNO, causando la expulsión inmediata de los sangre residual de la bomba vomeronasal. La cánula debe ser claramente visible debajo del epitelio vomeronasal relativamente transparente y la aparición de la cánula debe ser uniforme en toda su longitud dentro del VNO. Al completar con éxito el procedimiento, se puede verificar la conectividad funcional mediante un ensayo fisiológico como única unidad de registros electrofisiológicos de la actividad neuronal en respuesta a la estimulación del OVN con una fuente conocida de odorantes VSN (Figura 4).

Figura 1. A) Ingeniería dibujos de la cámara de disección personalizado que se utiliza en los Pasos 03.22 a 05.04. NOTA: Los agujeros pequeños se pueden perforar para dar cabida a la solución y gasificación entradas y salidas como se desee B) Fotografía Ejemplo de cámara de disección utilizado en este protocolo.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. A, b) Imágenes representativas de éxito (A) y (B) las preparaciones sin éxito después de la etapa de hemisección (paso 3,20). El VNO, tejidos septales, y los bulbos olfatorios (OB) todos deben ser mantenidos en el hemisferio ipsilateral (en este caso, el derecho (abajo) hemisferio. Si cornetes nasales son visibles en el hemisferio ipsilateral, la disección ha fallado. Las marcas de graduación son 1 mm de diferencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figura 3. A, B) Imágenes representativas de tejido septal intacta y dañada entre el VNO y AOB. En B, la pinza de disección hicieron contacto involuntario con el tejido, dañando los tractos de axones VN. C, D) AOB intactos y dañados. En D, la eliminación de la duramadre que rodea el OB ipsilateral resultó en cortar el nervio vomeronasal cerca de la AOB, causando una mancha visible de tejido cerca de la AOB medial. Las barras de escala son de 1 mm de longitud.

Figura 4. A) parcela Ejemplo raster de potenciales de acción registrados a partir de una neurona AOB (grabación de una sola unidad extracelular) en una preparación exitosa. Rastros en negro muestran ningún cambio en la tasa de disparos cuando la solución de control de Ringer fue entregado a la VNO durante 5 s (gris bbuey). Rastros en rojo muestran la respuesta de la misma neurona a VNO estimulación con BALB / c hembra orina del ratón diluido 100 veces en solución salina de Ringer. B) Peri-estímulo histograma de tiempo de las mismas respuestas en un archivo. Las barras de error representan los errores estándar de la media.

Los autores no tienen conflictos de intereses significativos a revelar.