Artículo de método

Multimodales ópticos Métodos Microscopía Reveal Polyp Tissue Morfología y Estructura del Caribe del filón de construcción corales

DOI:

10.3791/51824

⸱

5 de septiembre de 2014

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

En este artículo

Resumen

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Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología tridimensional (3D) y la estructura celular de los tejidos de los pólipos que comprende la corales constructores de arrecifes del Caribe Montastraea annularis y M. faveolata. Estos enfoques incluyen microscopía de fluorescencia (FM), la cara de bloque serial de formación de imágenes (SBFI), y de dos fotones microscopía de barrido láser confocal (TPLSM). SBFI proporciona imágenes de tejido profundo después de seccionamiento física; se detalla la textura de la superficie del tejido y la visualización 3D a profundidades de tejido de más de 2 mm. FM complementaria y rendimiento TPLSM imágenes de ultra-alta resolución de la estructura celular del tejido. Los resultados han: (1) identificaron morfologías no reportados previamente tejido lobulados en la pared exterior de los pólipos de coral individuales y (2) creado el primer mapa de la superficie de la densidad de la distribución y el tejido 3D de cromatóforos y endosimbiontes zooxantelas dinoflagelado similares a algas. Guisante absorción espectralks de 500 nm y 675 nm, respectivamente, sugieren que M. annularis y M. faveolata contienen tipos similares de clorofila y cromatóforos. Sin embargo, M. annularis y M. faveolata exhibir diferencias significativas en la densidad del tejido y la distribución 3D de estos componentes celulares clave. Este estudio se centra en los métodos de imagen indica que SBFI es extremadamente útil para el análisis de grandes muestras mm escala de tejidos de coral descalcificar. FM cortesía y TPLSM revelan cambios sutiles escala submilimétrica en la distribución celular y la densidad en muestras de tejido de coral nondecalcified. La técnica TPLSM proporciona: (1) la preparación mínimamente invasiva de la muestra, (2) la capacidad de seccionamiento óptico superior, y (3) la absorción de luz mínima y la dispersión, permitiendo al mismo tiempo de formación de imágenes de tejido profundo.

Introducción

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El calentamiento global y el cambio ambiental que acompaña están afectando directamente la salud y la distribución de los corales marinos tropicales 1-4. Se observan múltiples impactos, incluyendo la decoloración del coral y la aparición de enfermedades infecciosas 5-6. Sin embargo, la predicción más exacta de la futura respuesta coral a estas amenazas ambientales, será necesario que se establezca una "línea de base" histológico, que define la morfología del tejido y la composición celular y la distribución de los corales "aparentemente sanos". A su vez, "impactados" corales pueden compararse cuantitativamente. Además, esta línea de base debe ser establecido para corales aparentemente sanos bajo una variedad de condiciones ambientales, por lo que "respuesta saludable" también se puede medir a través de gradientes ambientales. Como un primer paso hacia el establecimiento de esta línea de base, un estudio en 3D de alta resolución se ha llevado a cabo de la forma aparentemente tejido de los pólipos de coral saludablela morfología y la composición celular responde a los aumentos en la profundidad del agua (WD) y disminuciones que se acompañan en la luz del sol irradiancia. Resultados se pueden utilizar para establecer una comprensión mecanicista más completo de la adaptación de coral, así como para obtener una perspectiva de la evolución-coral simbionte y el mejoramiento de la recolección de luz.

Los corales pétreos (Scleractinia) son animales invertebrados marinos coloniales que acogen a un complejo conjunto de otros microorganismos, denominados colectivamente como el coral holobionte 7-10. La investigación llevada a cabo en el presente estudio busca utilizar un conjunto de tecnologías de imagen de vanguardia para seguir simultáneamente los cambios a medida que aumenta la profundidad del agua en los tejidos y pigmentos zooxantelas de los corales anfitriones aparentemente sanos. Esto establecerá el tejido celular comparativo "línea de base" necesaria a través de un gradiente batimétrico para los corales aparentemente sanos y actúan como indicadores de hea corallth 10. Pigmentos de coral, llamados cromatóforos, actúan para absorber, reflejar, de dispersión, refractan, difractan, o interferir con la radiación solar incidente 11. La relación endosimbiótica-zooxantelas chromatophore ha permitido a la coevolución de estratégicamente ventajosa optimización captador de luz y las estrategias de crecimiento del esqueleto, así como la plasticidad trófica (estrategias de alimentación desplazamiento de ida y vuelta desde autotrofia a heterotrofía) para el animal coral 12.

El sur de la isla caribeña de Curaçao (antes parte de las Antillas Neerlandesas) está a 65 km al norte de Venezuela dentro de la tendencia este-oeste Aruba-La Blanquilla archipiélago (Figura 1A). La costa sur de 70 kilometros de largo de Curaçao contiene una antigua franja tracto arrecife de coral continua moderno y Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno 13,14. SST media anual en Curazao varía de aproximadamente 3 ° C unanuamente, que van desde un mínimo de 26 ° C a finales de enero a un máximo de 29 ° C a principios de septiembre, con una temperatura media anual de 27,5 ± 0,5 º C (SST datos NOAA Establece, 2000-2010). El arrecife de coral en Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), situada cerca de la punta noroeste de Curazao (Figura 1A), fue elegido para el muestreo, ya que ha sido previamente bien estudiado y la ecosistema marino en este lugar se baña en el agua de mar fresca 7,15-19 no contaminados. . Dos especies de coral escleractinios estrechamente relacionados, M. annularis y M faveolata, fueron elegidos para la experimentación y el análisis en este estudio porque cada especie: (1) exposiciones muy diferentes y que no se superponen las distribuciones batimétricas en el tracto arrecife con respecto al borde de la plataforma y la ambientes de depósito sedimentario carbonato asociados (rango annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarango = 10-20 m WD 20; las figuras 1B, 2A, y 2B); (2) es un coral común constructor marco de arrecifes en todo el Mar Caribe 21; y (3) tiene bien estudiado ecológica, fisiológica y relaciones evolutivas 22.

Muestreo de campo para el presente estudio se llevó a cabo usando técnicas estándar de buceo SCUBA en alta mar de Playa Kalki en Curazao. A batimétrico agua transecto-superficial-a lo profundo se estableció que corrió a través de la plataforma, el talud continental, y en los ambientes del arrecife frontal en aguas profundas. Al parecer, luego se identificaron cabezas de coral saludable para el muestreo a lo largo de este transecto batimétrico, incluyendo: (1) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. annularis, todos los cuales estaban en 5 m de profundidad de agua (WD); y (2) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. faveolata, todos los cuales estaban en 12 m WD. Radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió como 33-36% de PAR en 5 m WD y 18-22% PAR a 10 m WD. El muestreo se llevó a cabo en enero, cuando la SST fue de 26 ° C en las profundidades marinas de ambos extremos, 5 my 12 m. Cada uno de estos seis cabezas de coral se tomaron muestras por triplicado en las posiciones espaciales equivalentes (es decir., Aproximadamente 45 ° de latitud norte en cada una de las seis cabezas de coral hemisféricas). Cada muestra individual consistía en una biopsia de 2,5 cm de diámetro coral esqueleto de tejido de núcleo que se recogió con un arco punch limpiado. Tres biopsias de tejido esqueleto de coral se muestrearon en SCUBA estándar con las manos enguantadas de cada una de las cabezas de coral (9 de M. annularis colonias a 5 m WD y 9 de M. faveolata a 12 m WD). Inmediatamente después de la recolección en profundidad, cada muestra de biopsia de núcleo se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml estéril, con tapa de rosca sellado, y volvió a la superficie. El agua de mar se decantó de cada tubo de centrífuga y luego cada uno de biopsia de núcleo se sumergió, almacenada y transportada en 4% de paraformaldehído.

imágenes SBFI previamente se ha realizado en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo todo el cerebro y los tejidos humanos de todo el corazón, los embriones de ratón intactas, embriones de pez cebra, y múltiples tipos de muestras de animales con huesos intactos 23-30. La mayoría de estos estudios utilizaron microscopía óptica / luz, ya sea con fluorescencia o técnicas de campo claro. Sin embargo, se han realizado estudios en ultra-grandes aumentos utilizando imágenes de la cara del bloque de serie electrónico de barrido en el pasado 31. En el presente estudio, un protocolo SBFI modificado ha sido desarrollado para y se aplica a los corales por primera vez. Debido a que M. annularis y M. pólipos de coral faveolata son de 1-2 mm de espesor, ninguna de las técnicas de microscopía de luz de rutina sería capaz de penetrar todo el espesor del tejido de los pólipos de coral. Por lo tanto, tenemos SBFI protocolo de preparación de muestra diseñada específicamente para muestras de coral. Además, hemos diseñado a medida un soporte estereoscópico, Que está motorizado para moverse en ambas direcciones x e y. Este aparato toma imágenes de la cara del bloque de la muestra en lugar de la recogida de las secciones usando un microtomo regular en frente del microscopio. También hemos introducido otra técnica microscópica de dos fotones óptica no lineal a la imagen los mismos pólipos de coral a través de todo el espesor de los tejidos de coral. Esto supera las limitaciones impuestas por la SBIF en términos de la descalcificación y la posibilidad de cambios en la morfología de los tejidos y el volumen (contracción) que pueden ser inducidas por la preparación de muestras (deshidratación) y protocolos de tratamiento. Además, los perfiles de emisión de los corales fueron resueltos espectralmente para identificar sus picos de emisiones y las variaciones entre los cromatóforos y las zooxantelas fotosintética. Estos resultados se evaluaron en el contexto del método utilizado y sus ventajas individuales con respecto a tiempo de adquisición, el tiempo de análisis, y la capacidad de resolver detalles finos estructurales sin comprometer strintegridad uctural del tejido del coral.

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Protocolo

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NOTA: Los reactivos que se preparen para Serial Bloquear Cara Imaging de Coral Muestras

1. Preinfiltration Cera

  1. Derretir 3,6 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio. Mezclar bien en un plato caliente (60-70 ° C).
  2. Añadir 400 mg de Sudán IV (para minimizar la cera de la fluorescencia de fondo). Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo.
  3. Añadir 96 ml de parafina fundida caliente (100%) y mezclar bien.

1.2) Incorporación de Cera

  1. Derretir 7,2 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio y mezclar bien sobre una placa caliente (60-70 ° C).
  2. Añadir 0,8 g de Sudán IV. Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo.
  3. Añadir gránulos de parafina (162 g) y mezclar hasta que la parafina se derrite por completo.
  4. Añadir 30 g de blanco granular Vybar y fundir completamente en el mismo vaso de precipitados; una vez derretida, mezclar.
  5. Sin apretar cerrar la botella de vidrio con una tapa. Coloque la botella de vidrio en un 60 ° C convección oven mantener los ingredientes en estado líquido. Llevar a cabo todas las infiltraciones en este horno.
  6. Dividir el volumen total de la 200 ml de cera roja en dos frascos de vidrio de 100 ml cada uno. Utilice una alícuota para la infiltración y el otro para la incrustación final.

1.3) incrustación de coral Los tejidos para Serial Bloquear Cara Imaging

  1. Lave los pólipos de coral recogidos sobre el terreno (SI Video 1) y almacenados (3-6 meses a 4-5 ° C en paraformaldehído) en tampón fosfato salino (3x 5 min) y descalcificación cuando esté listo para ser fotografiado. Descalcifique los pólipos en solución Excal durante 24 horas o hasta que los pólipos son totalmente desprovisto de CaCO3. Incubar varios pólipos de coral descalcificada como un solo bloque en una serie 25, 50, 75, y 100% de etanol, seguido por 1x sustituto de xileno para deshidratar las muestras.
  2. Coloca los pólipos procesados ​​en un horno C 65 ° precalentado que contiene 100% sustituto xileno. Incubar durante 30 minutos dos veces por changing a solución fresca. Orientar los pólipos de tal manera que la parte superior de los pólipos está orientado hacia abajo y la superficie superior es tan plana como sea posible.
  3. Hacen que las soluciones de 2: 1, 1: 1, y 1: 2 xileno sustituto y cera preinfiltration (paso 1.1) en 50 ml tubos Falcon.
  4. Incubar los pólipos de coral con estas tres concentraciones crecientes de cera preinfiltration, seguido de 3x incubación en 100% de cera preinfiltration durante 30-60 minutos cada vez.
  5. Nota: Dependiendo del grosor de las muestras, los pasos 1.3.1-1.3.5 podrían incrementarse con períodos más largos de tiempo.
  6. Mueva las muestras a la incrustación de cera (vea el paso 1.2.6) después de la incubación 3x en el 100% de cera preinfiltration.
  7. Quite la cera de incrustación después de 30 min. Reemplace con cera incrustación fresco y continuar la incubación durante un mínimo de 4 horas a 65 ° C.

1.4) Incorporación en rojo de la cera

  1. Fotografiar el bloque (la bandeja de acero inoxidable donde se coloca la cera blanca y en la parte superior de la que el sample se coloca). Esto es necesario porque una vez incrustado en la cera, la ubicación de la muestra se volverá invisible como la incrustación de cera roja es opaco.
  2. Coloque pequeñas gotas de cera de alto punto de fusión en torno al nuevo molde de inclusión acero inoxidable precalentado y deje que se enfríe. Vierta un pequeño volumen de cera de incrustación recién fundido de segundo recipiente como se indica en el paso 1.2.6.
  3. Coloque el pólipo de coral hacia abajo rápidamente sobre el punto cera blanca, a continuación, colocar un soporte de muestra de plástico en la bandeja de acero inoxidable y se vierte cera más incrustación de manera que la cera se acerca a la superficie del molde de plástico.
  4. Tome toda la configuración de 65 ° C horno y deje que se enfríe en un banco o una superficie fría hasta que la cera se endurece por completo.
  5. Este proceso puede tardar 6 horas hasta uno o dos días. Coloque el bloque desecado en un refrigerador a 4 ° C, protegido de la luz, para almacenamiento a largo plazo.

1.5) seccionamiento en la serie de configuración de bloque de la cara

  1. Trim la manzana y cortar 1 micras secciones usando un microtomo. No recoger los apartados tal como serán como polvo. Recuerde, estamos Imaging sólo la cara del bloque. La muestra aparece cuando la cera blanca comienza a desaparecer.
  2. Capturar imágenes de la cara del bloque lisa que contiene la muestra cada vez que se retira una sección. Continúe hasta que el pólipo de coral desaparece como en SI Video 2.
  3. Grabar / Captura las imágenes con una cámara monocromática utilizando un filtro fluorescente FITC para recoger la autofluorescencia del cromatóforos / coral pólipo. Imagen 3-4 núcleos descalcificados de cada especie.

2. Imaging corales Bajo de dos fotones microscopía de fluorescencia

  1. Fijar núcleos de pólipos de coral, cada uno con alrededor de 10 a 12 pólipos alrededor de una pulgada de diámetro, en el 4% de paraformaldehído en el sitio de la colección (orilla del mar) tan pronto como se recogen bajo el agua.
  2. Mantenga las muestras a 4 ° C hasta que la imagen. Núcleos lavados se colocan en ee misma solución boca abajo en un plato con fondo de cristal cubierta (0,17 mm de grosor).
  3. El uso de un láser de dos fotones de excitación a 780 nm, imagen 3-4 pólipos en dos diferentes aumentos (zoom digital) con un (NA 0.3) objetivo de 10X. La forma pólipo de coral y la altura varía entre las muestras (generalmente 1-2 mm) y la profundidad de formación de imágenes también está limitada por la distancia de trabajo del objetivo de formación de imágenes.
  4. Utilice el modo de exploración de azulejos para recoger aproximadamente 25 a 100 (5 x 5 o 10 x 10 azulejos) imágenes por plano focal en xy y 50-100 imágenes a través del eje z en el intervalo de 10 o 20 micras, por un total de alrededor de 5.000-10.000 images / pólipo de coral.
  5. Imagen en tres en cuatro ámbitos de pólipos para representar una especie de núcleo y de coral. NOTA: La imagen de tiempo de adquisición varía entre 2-5 hr área / pólipo.
  6. Guarde todas las imágenes en formato de datos en bruto en el disco duro del sistema como LSM 5. Render 3D en un análisis de imágenes 3D y software de renderizado.

3. 3D Volume Rendering y Visualization de la SBIF y de dos fotones de fluorescencia espectral de datos

  1. Recortar los datos 2D para reducir el tamaño del archivo, centrándose en un solo pólipo utilizando la herramienta de recorte cuadrado en el programa y compilar en un solo archivo tiff (reducir el tamaño del archivo también guardando el archivo en formato de 8 bits) en el software de adquisición.
  2. Abra los archivos reunidos de los datos recogidos (SBIF en el paso 1.5.1) o las baldosas múltiples z-pilas de secciones ópticas de dos fotones (recogidos en el paso 2.1.4) en el programa Imaris Supera módulo de bajo volumen algoritmo.
  3. Proyectar los datos SBFI prestados en 3D usando una proyección de sombras. Crear un modo de isosuperficie donde se thresholded los voxels para crear un patrón de superficie sólida (SI vídeo 3).
  4. Visualice las proyecciones en 3D usando un algoritmo de plano de corte en xy, xz y yz modos ortogonales para revelar la estructura 3D y la forma de los corales.
  5. Animar las proyecciones utilizando un módulo de animación fotograma clave en el mismo programa Imaris (SI Videos 3-7).
  6. Generar archivos de vídeo en el 5% de compresión y generar unos clips de película en formato avi usando volumen (SI Videos 4 y 6), modalidades 3D y Isosurface (SI Videos 5 y 7).

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Resultados

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Un aparato SBFI diseñado a medida (fabricado específicamente para el presente estudio, figura 3) produjo los primeros mapas detallados 3D digitales de elevación (DEM) de la textura de la superficie exterior y la morfología de la M. annularis y M. Los pólipos de coral faveolature (Figura 4 y SI Videos 1-2). Esto produjo imágenes de lóbulos apilados previamente no descrita de tejido coralino concéntricamente irradia hacia fuera del centro de cad...

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Discusión

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Investigación de los arrecifes de coral es un esfuerzo de investigación altamente interdisciplinario, que involucra el análisis de la simultánea física, química, y los fenómenos biológicos que operan en el medio marino. Por lo tanto, mejor El estudio de los ecosistemas de arrecifes de coral complejos se completa dentro de un 'Powers of Ten' marco contextual (Figura 10). Esta compilación gráfico ilustra que el ecosistema de coral cubre una amplia gama de dimensiones espaciales (10 -9-10 5

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos a Donna Epps, históloga del Instituto de Biología Genómica de la Universidad de Illinois Urbana-Champaign (UIUC), por su competente asistencia técnica en la preparación y sección de muestras. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación a B.W. Fouke de la Oficina de Investigación Naval (N00014-00-1-0609). Además, C.A.H. Miller recibió subvenciones de la beca Wanless del Departamento de Geología de la UIUC, el fondo Leighton del Departamento de Geología de la UIUC y el fondo de trabajo de campo Roscoe Jackson del Departamento de Geología de la UIUC. Las interpretaciones presentadas en este manuscrito son las de los autores y no necesariamente representan las de las instituciones otorgantes. También agradecemos al laboratorio de Investigación y Gestión de la Biodiversidad del Caribe (Carmabi) en Curazao por su apoyo y colaboración en la recolección de las muestras de biopsia de tejido de coral. Agradecemos a Claudia Lutz, Especialista en Comunicación de Medios de IGB por su hábil corrección del lenguaje.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Esqueletode tejido de coral Biopsia de 2,5 cm de hábitat natural Dispositivo de
extracción de muestras Arch Punch C.S. Osborne and CompanyNo. 149Para la recolección de biopsias
de coral ParaformaldehídoCiencias de Microscopía Electrónica RT1570016% Prediluido
Histoclear/Safeclear IICiencias de Microscopía Electrónica RT64111-04Alternativa no tóxica al xileno, deshidratación y desparafinización
Xileno y etanolFisher ScientificDeshidratación
Cera de parafinaRichard Allen ScientificTipo H REF 8338Solución de infiltración
VybarEl fabricanteComponente de la cera roja
EstearinaEl fabricante de velasComponente de la cera roja
Sudán IVFisher ChemicalS667-25Cera roja-Fondo opaco
Aglutinina de germen de trigo (WGA)Life TechnologiesW32466Para etiquetado  Coral Mucus
Prolong, GoldLife TechnologiesP36095Medios de montaje antidecoloración
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100Para imágenes de dos fotones
Motor, controlador y controlador XYLin211-13-01R0, R325, R256-ROmovimiento traslacional XY
CorningDC-220Derretimiento de toda la cera
Horno de convecciónYamatoDX-600 Procesador deinfiltración e incrustación
LeicaASP 300Microtomo de deshidratación, infiltración
LeicaRM2055Cuchillos desechables
Microscopio estereoscópicoCarl ZeissStereolumar V 121.5x (30 mm WD)
Microscopio de fluorescencia objetiva con ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, Sistema ApoTome IObtención de imágenes de la sección delgada de un pólipo: Zooxantelas
Cámara AxiocamCarl ZeissMRmCámara monocromática 1388x1040 píxeles
Axiovision SoftwareCarl ZeissVersión 4.8Programa de adquisición de imágenes
Espectrofísica láser de dos fotonesMaitai eHP, láser pulsado (70 fs)Con módulo DeepSee
Microscopio de barrido láserCarl ZeissLSM 710 con detector espectralDetección PMT de 34 canales
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 o superiorpara la adquisición de imágenes espectrales y de dos fotones
Software Imaris SuiteBitplane, Inc.,versión 7.0 o superiorVolumen 3D, Representación de isosuperficie, Visualización
de velas Engineering Placa calefactora de tejidos de

Referencias

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