Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones.
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Artículo de método
Multimodales ópticos Métodos Microscopía Reveal Polyp Tissue Morfología y Estructura del Caribe del filón de construcción corales
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Resumen
Resumen
Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología tridimensional (3D) y la estructura celular de los tejidos de los pólipos que comprende la corales constructores de arrecifes del Caribe Montastraea annularis y M. faveolata. Estos enfoques incluyen microscopía de fluorescencia (FM), la cara de bloque serial de formación de imágenes (SBFI), y de dos fotones microscopía de barrido láser confocal (TPLSM). SBFI proporciona imágenes de tejido profundo después de seccionamiento física; se detalla la textura de la superficie del tejido y la visualización 3D a profundidades de tejido de más de 2 mm. FM complementaria y rendimiento TPLSM imágenes de ultra-alta resolución de la estructura celular del tejido. Los resultados han: (1) identificaron morfologías no reportados previamente tejido lobulados en la pared exterior de los pólipos de coral individuales y (2) creado el primer mapa de la superficie de la densidad de la distribución y el tejido 3D de cromatóforos y endosimbiontes zooxantelas dinoflagelado similares a algas. Guisante absorción espectralks de 500 nm y 675 nm, respectivamente, sugieren que M. annularis y M. faveolata contienen tipos similares de clorofila y cromatóforos. Sin embargo, M. annularis y M. faveolata exhibir diferencias significativas en la densidad del tejido y la distribución 3D de estos componentes celulares clave. Este estudio se centra en los métodos de imagen indica que SBFI es extremadamente útil para el análisis de grandes muestras mm escala de tejidos de coral descalcificar. FM cortesía y TPLSM revelan cambios sutiles escala submilimétrica en la distribución celular y la densidad en muestras de tejido de coral nondecalcified. La técnica TPLSM proporciona: (1) la preparación mínimamente invasiva de la muestra, (2) la capacidad de seccionamiento óptico superior, y (3) la absorción de luz mínima y la dispersión, permitiendo al mismo tiempo de formación de imágenes de tejido profundo.
Introducción
El calentamiento global y el cambio ambiental que acompaña están afectando directamente la salud y la distribución de los corales marinos tropicales 1-4. Se observan múltiples impactos, incluyendo la decoloración del coral y la aparición de enfermedades infecciosas 5-6. Sin embargo, la predicción más exacta de la futura respuesta coral a estas amenazas ambientales, será necesario que se establezca una "línea de base" histológico, que define la morfología del tejido y la composición celular y la distribución de los corales "aparentemente sanos". A su vez, "impactados" corales pueden compararse cuantitativamente. Además, esta línea de base debe se....
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Protocolo
NOTA: Los reactivos que se preparen para Serial Bloquear Cara Imaging de Coral Muestras
1. Preinfiltration Cera
- Derretir 3,6 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio. Mezclar bien en un plato caliente (60-70 ° C).
- Añadir 400 mg de Sudán IV (para minimizar la cera de la fluorescencia de fondo). Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo.
- Añadir 96 ml de parafina fundida caliente (100%) y mezclar bien.
1.2) Incorporación de Cera
- Derretir 7,2 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio y mezc....
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Resultados
Un aparato SBFI diseñado a medida (fabricado específicamente para el presente estudio, figura 3) produjo los primeros mapas detallados 3D digitales de elevación (DEM) de la textura de la superficie exterior y la morfología de la M. annularis y M. Los pólipos de coral faveolature (Figura 4 y SI Videos 1-2). Esto produjo imágenes de lóbulos apilados previamente no descrita de tejido coralino concéntricamente irradia hacia fuera del centro de cad.......
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Discusión
Investigación de los arrecifes de coral es un esfuerzo de investigación altamente interdisciplinario, que involucra el análisis de la simultánea física, química, y los fenómenos biológicos que operan en el medio marino. Por lo tanto, mejor El estudio de los ecosistemas de arrecifes de coral complejos se completa dentro de un 'Powers of Ten' marco contextual (Figura 10). Esta compilación gráfico ilustra que el ecosistema de coral cubre una amplia gama de dimensiones espaciales (10 -9-10 5
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Donna Epps, históloga del Instituto de Biología Genómica de la Universidad de Illinois Urbana-Champaign (UIUC), por su competente asistencia técnica en la preparación y sección de muestras. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación a B.W. Fouke de la Oficina de Investigación Naval (N00014-00-1-0609). Además, C.A.H. Miller recibió subvenciones de la beca Wanless del Departamento de Geología de la UIUC, el fondo Leighton del Departamento de Geología de la UIUC y el fondo de trabajo de campo Roscoe Jackson del Departamento de Geología de la UIUC. Las interpretaciones presentadas en este manuscrito son las de los autores y no necesariamente repr....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Esqueleto | de tejido de coral Biopsia de 2,5 cm de hábitat natural Dispositivo de | ||
| extracción de muestras Arch Punch C.S | . Osborne and Company | No. 149 | Para la recolección de biopsias |
| de coral Paraformaldehído | Ciencias de Microscopía Electrónica RT | 15700 | 16% Prediluido |
| Histoclear/Safeclear II | Ciencias de Microscopía Electrónica RT | 64111-04 | Alternativa no tóxica al xileno, deshidratación y desparafinización |
| Xileno y etanol | Fisher Scientific | Deshidratación | |
| Cera de parafina | Richard Allen Scientific | Tipo H REF 8338 | Solución de infiltración |
| Vybar | El fabricante | Componente de la cera roja | |
| Estearina | El fabricante de velas | Componente de la cera roja | |
| Sudán IV | Fisher Chemical | S667-25 | Cera roja-Fondo opaco |
| Aglutinina de germen de trigo (WGA) | Life Technologies | W32466 | Para etiquetado Coral Mucus |
| Prolong, Gold | Life Technologies | P36095 | Medios de montaje antidecoloración |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | Para imágenes de dos fotones |
| Motor, controlador y controlador XY | Lin | 211-13-01R0, R325, R256-RO | movimiento traslacional XY |
| Corning | DC-220 | Derretimiento de toda la cera | |
| Horno de convección | Yamato | DX-600 Procesador de | infiltración e incrustación |
| Leica | ASP 300 | Microtomo de deshidratación, infiltración | |
| Leica | RM2055 | Cuchillos desechables | |
| Microscopio estereoscópico | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) |
| Microscopio de fluorescencia objetiva con ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, Sistema ApoTome I | Obtención de imágenes de la sección delgada de un pólipo: Zooxantelas |
| Cámara Axiocam | Carl Zeiss | MRm | Cámara monocromática 1388x1040 píxeles |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Versión 4.8 | Programa de adquisición de imágenes |
| Espectrofísica láser de dos fotones | Maitai eHP, láser pulsado (70 fs) | Con módulo DeepSee | |
| Microscopio de barrido láser | Carl Zeiss | LSM 710 con detector espectral | Detección PMT de 34 canales |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 o superior | para la adquisición de imágenes espectrales y de dos fotones |
| Software Imaris Suite | Bitplane, Inc., | versión 7.0 o superior | Volumen 3D, Representación de isosuperficie, Visualización |
Referencias
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B.
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Reimpresiones y permisos
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