Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Resumen

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Resumen

La separación de proteínas por SDS-PAGE seguida de la digestión proteolítica en gel de las bandas de proteínas resueltas ha producido un análisis proteómico de alta resolución de muestras biológicas. Enfoques similares, que permitirían un análisis en profundidad de los glicanos transportados por las glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE, requieren consideraciones especiales para maximizar la recuperación y la sensibilidad cuando se utiliza la espectrometría de masas (MS) como método de detección. Un obstáculo importante que debe superarse para lograr datos de alta calidad es la eliminación de los contaminantes derivados del gel que interfieren con el análisis de MS. El flujo de trabajo de muestras que se presenta aquí es robusto, eficiente y elimina la necesidad de una limpieza de HPLC en línea antes de la EM. Las piezas de gel que contienen proteínas objetivo se lavan con acetonitrilo, agua y acetato de etilo para eliminar los contaminantes, incluidos los fragmentos de acrilamida polimérica. Los glicanos ligados a O se liberan de las proteínas objetivo mediante la eliminación de β reductores en gel y se recuperan mediante procedimientos de limpieza robustos y sencillos. Una ventaja de este flujo de trabajo es que mejora la sensibilidad para detectar y caracterizar glicanos sulfatados. Estos procedimientos producen una separación eficiente de los glicanos permetilados sulfatados de los glicanos permetilados no sulfatados (sialilados y neutros) mediante una rápida partición de fase antes del análisis de MS y, por lo tanto, mejoran los análisis glucómicos y sulfoglicómicos de las glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE.

Introducción

La glicosilación es una modificación esencial de proteína después de la traducción, lo que contribuye a la fisiología del organismo, patología del tejido, y el reconocimiento celular ^1-3. A pesar de los grandes avances en glicociencia analítica, la caracterización de la diversidad completa de glicanos en una proteína específica sigue siendo una tarea extremadamente difícil, sobre todo en las proteínas aisladas de fuentes biológicas primarias. No obstante, la microheterogeneidad de glicanos de glicoproteínas con frecuencia afecta a las interacciones funcionales con otras proteínas. Por lo tanto, la caracterización de la diversidad glicano es esencial para l....

Protocolo

NOTA: Las preocupaciones de seguridad de laboratorio

En consonancia con las mejores prácticas de laboratorio estándar, observar lo siguiente. Guarde todos los disolventes orgánicos en lugares apropiados. Mantenga todos los materiales de desecho en contenedores de residuos químicos con un etiquetado claro de composiciones químicas. Como varios reactivos utilizados en estos protocolos son carcinógenos potenciales o generar gases combustibles volátiles, manejar todos los reactivos en una campana de humos con ventilación. Use el equipo de protección personal como guantes, bata de laboratorio y protección para los ojos cuando ....

Resultados

Efecto de Etil Acetato de Tratamiento Antes del En-gel reductora β-eliminación

Un espectro de masas representativo de muestras permetilados glicanos O-ligados liberados de mucina bovina utilizando en gel reductora β-eliminación se muestra en la Figura 3. El lavado EtOAc de las piezas de gel SDS y elimina de forma efectiva poliacrílicos contaminantes que interfieren con el posterior análisis MS ^27.

Discusión

La combinación de la eliminación de β reductora en gel con la extracción acuosa-orgánica mejora la sensibilidad y la profundidad de los datos estructurales que se pueden adquirir para caracterizar glicanos sulfatados y no sulfatados ligados a O recolectados de pequeñas cantidades de glicoproteínas de tipo mucina resueltas de otras proteínas por SDS-PAGE. Los avances esenciales de los enfoques técnicos presentados en este estudio son: (a) eliminación fácil de contaminantes derivados del gel mediante simples pasos de lavad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua, agua desionizada	Sigma-Aldrich	270733-4L	CHROMASOLV, para HPLC
Ácido acético, Glacial	Fisher	A38-500	Certificado ACS ≥ 99.7% p/p
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	CHROMASOLV, para HPLC, ≥ 99,9%
Bicarbonato de amonio	Fluka	09830-500G	BioUltra, ≥ 99.5% (T), Paso 1
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	34998-4L	CHROMASOLV Plus, para HPLC, ≥ 99.9%, Paso 1
Acetato de etilo	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV, Paso 1
Borohidruro de sodio	Aldrich	213462-25G	ReagentPlus, 99%, Paso 2
Yodometano	Sigma-Aldrich	289566-100G	ReagentPlus, 99,5%,  Paso 6.  Tienda a 4 & grados; C hasta su uso.  Siéntese a temperatura ambiente antes de usar.
Solución de hidróxido de sodio, 50% p/p		SS254-1	Certificado, Paso 6
Dimetilsulfóxido, anhidro	Sigma-Aldrich	276855-1L	Anhidro, ≥ 99.9%, Paso 6
Metanol,	Sigma-Aldrich anhidro	322415-100ML	Anhidro, 99.8%, Paso 6
Diclorometano	Sigma-Aldrich	34856-4L	CHROMASOL®, para HPLC, ≥ 99.8%, contiene amileno como estabilizador, Paso 7
Dowex 50WX8 forma de hidrógenoforma de hidrógeno 100-200   malla	Sigma-Aldrich	217506-500G	Paso 3
AG 50W-X8 Resina	Bio-Rad	142-1441	Paso 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Columna de Extracción en Fase Sólida, PP, Octadecilo (C18) Fase Inversa	JT Baker	JT-7020-01	Paso 5 y 8
7.5% Mini-PROTEAN TGX Gel Prefabricado	Bio-Rad		Paso 1
Tinción de Coomassie Bio-Segura	Bio-RAD	161-0786	G-250, Paso 1 Kit de
tinción de plata para espectrometría de masas	Pierce	24600	Paso 1
Kit de Oligosacáridos (Maltotriosa, Dp3: R474140)	Supelco	47265
Kit de Oligosacáridos (Maltotetraosa, Dp4: R474135)	Supelco	47265
Pipetas Pasteur Desechables, Vidrio, Punta Corta	VWR	14673-010	Lavar antes de usar
PYREX 13 x 100 mm Tubos de cultivo roscados desechables de fondo redondo	Corning	99447-13	Lavar antes de usar
PYREX 16 x 125 mm Tubos de cultivo roscados de fondo redondo desechables	Corning	99447-16	Lavar antes de usar
Tapones/cierres fenólicos con revestimiento de caucho con revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE	Kimble	45066C-13	Lavar antes de usar
Tapones/cierres fenólicos con revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE	Kimble	45066C-15	Lavar antes de usar
Jeringa de HPLC HAMILTON		81265	volumen 500  μ l, tamaño de la aguja 22 G
Jeringa de HPLC HAMILTON	HAMILTON	81165	volumen 250  μ l, tamaño de la aguja 22 G
Jeringa de HPLC HAMILTON		81065	volumen 100  μ l, tamaño de la aguja 22s G
Jeringa de HPLC HAMILTON		80965	volumen 50  μ l, tamaño de la aguja 22s G
Jeringas calibradas Hamilton	HAMILTON	80300	volumen 10  μ l, tamaño de la aguja 26s G
Placa de Petri Vidrio 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	Lavar antes de usar, Paso 1
Cuchillas quirúrgicas Bard-Parker	Fisher	371310	Paso 1
Módulo de calentamiento/agitación Reacti-Therm	Pierce	18870	Paso 1, 4 y 7
Bloques calefactores	Fisher	125D	Paso 2
Tamaño de poro de borosilicato de lana de vidrio de fibra Pyrex 8  μ m	Aldrich	CLS3950	Paso 3
Cortador de sílice fundidaCortador de tubos	alltech	3194	Paso 3
Vórtices multitubo	VWR	444-7063	Paso 6
Liofilizador 25EL Freezemobile	Centrífuga Virtis	25EL
VWR		Clinical 50
LTQ Orbitrap Discovery	Thermo Fisher Scientific

Fisher HAMILTON HAMILTON