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Artículo de método

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/51857

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28 de octubre de 2014

 , 
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

En este artículo

Resumen

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Resumen

Una variedad de procesos celulares, tanto fisiológicos como fisiopatológicos, requieren o están gobernados por el calcio, incluyendo la exocitosis, la función mitocondrial, la muerte celular, el metabolismo celular y la migración celular, por nombrar solo algunos. El calcio citosólico se mantiene normalmente a bajas concentraciones nanomolares; más bien se encuentra en altas concentraciones micromolares a milimolares en el retículo endoplásmico, la matriz mitocondrial y el compartimento extracelular. Tras la estimulación, un aumento transitorio del calcio citosólico sirve para señalar eventos posteriores. La detección de cambios en el calcio citosólico normalmente se realiza utilizando una imagen de células vivas configurada con tintes de unión al calcio que exhiben un aumento en la intensidad de la fluorescencia o un cambio en la longitud de onda de emisión al unirse al calcio. Sin embargo, una configuración de imágenes de células vivas no es de libre acceso para todos los investigadores. Se han optimizado métodos de detección alternativos para células inmunológicas con citometría de flujo y para células adherentes no inmunológicas con un lector de microplacas de fluorescencia. Aquí, describimos un método simple y optimizado para detectar cambios en las células epiteliales con citometría de flujo utilizando un colorante de unión al calcio de una sola longitud de onda. Las células epiteliales del túbulo proximal renal adherente, que normalmente son difíciles de cargar con colorantes, se cargaron con un colorante de unión al calcio permeable a las células fluorescentes en presencia de probenecid, se pusieron en suspensión y se monitorizaron las señales de calcio antes y después de la adición de thapsigargina, tunicamicina e ionomicina.

Introducción

El calcio es un segundo mensajero importante responsable de la transmisión de señales fisiopatológicos 1 fisiológica celular y. Las concentraciones de calcio citosólico se mantienen bajos a través de la actividad de las bombas y los intercambiadores de calcio de calcio. La ATPasa de calcio del retículo / endoplasmático sarcoplásmico (SERCA) rellena el retículo endoplasmático (ER) de la tienda de calcio como parte de un sistema de "fuga de la bomba", mientras que la ATPasa de calcio de la membrana plasmática (PMCA) extruye calcio para el compartimiento extracelular, tanto en modales dependientes de ATP 2. Mensajeros fisiológicos, tales como hormonas o neurotransmisores, transmiten sus señales a través de receptores acoplados a proteína G, activación de la fosfolipasa C, que hidroliza fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en la membrana de plasma para generar diacilglicerol e inositol trifosfato (IP3) 3. Mientras diacilglicerol permanece en la membrana plasmática, IP3 se difunde en el citosol y se une al receptor de IP3s (IP3Rs), que son los canales de calcio activados ligando, que se encuentran en la membrana del RE y el calcio se libera de la tienda luminal ER que culmina en un aumento de las concentraciones de calcio citosólico 4. Una ruta alternativa para el calcio para alcanzar el citosol es a través de los canales de calcio e intercambiadores presentes en la membrana plasmática. Diafonía entre estos dos compartimentos se han descrito: la liberación de calcio inducida por calcio (CICR), donde el calcio extracelular induce la liberación de calcio desde las tiendas ER 5, y la tienda que funciona la entrada de calcio (SOCE) donde el vaciado de las tiendas ER es detectada por STIM y provoca la apertura de Orai canales de calcio en la membrana plasmática para promover la recarga de las tiendas ER 6.

En condiciones fisiopatológicas, la respuesta de calcio celular está desregulado y citosólicas aumentos de calcio en la ausencia de estimuladores fisiológicos 1. La respuesta de calcio puede verse afectada en un número de maneras: calcio prolongaseñal, retraso en la eliminación de calcio desde el citosol, el agotamiento de las reservas de calcio o cambios localizados en el calcio. Además, las mitocondrias asumen un papel central en el almacenamiento en búfer y la liberación de calcio 7. Prolongado y / o aumento de calcio citosólico supramáximo conduce a la muerte celular. De hecho, el calcio es más a menudo que no participa en la respuesta fisiopatológica celular y es un evento clave en una amplia gama de enfermedades, tales como enfermedad neurodegenerativa, enfermedad del corazón, cáncer, enfermedad ósea y la enfermedad de riñón, que se asocia principalmente con la muerte celular y la pérdida o alteración de la función de órgano o tejido 8-10. Por otra parte, la perturbación de las señales de calcio se ha vinculado a la adaptación celular y cambios en las funciones celulares y las respuestas.

Tradicionalmente, las señales de calcio se miden con un indicador de calcio fluorescente cargado negativamente que se carga en las células en una forma de éster de acetoximetilo celular permeable (AM). Una vez escindida por esteras celulareses, los indicadores fluorescentes permanecen dentro del compartimento intracelular y el aumento de la intensidad de fluorescencia cuando se une el calcio. El indicador de calcio más conocido y utilizado es el radiométrico Fura-2 desarrollado por Roger Tsien y sus colegas 11. Indicadores de calcio con diferentes afinidades para calcio permiten diferentes piscinas de calcio para ser monitoreados. Los métodos de detección incluyen imágenes de células vivas, lector de microplacas de fluorescencia y citometría de flujo. La cinética relativamente rápidas de señales de calcio (por lo general dentro de un par de segundos a minutos) hace que células vivas imágenes del mejor método para ganar la mayoría de la información sobre las características de la señal de calcio. Aparte de la cinética rápida de señales de calcio (dentro de milisegundos), imágenes de células vivas es un mejor método para el estudio de la compartimentación celular de señalización de calcio dentro de una sola célula 12. Las concentraciones de calcio absolutos se pueden calcular mediante la determinación de la fluorescencia mínima y máxima de la ind calcioicator mediante la adición de un quelante de calcio y de permeabilización de las células, respectivamente, como se describe por Grynkiewicz et al. 11.

El uso de citometría de flujo para medir las señales de calcio fue desarrollado por primera vez en la década de 1980 en las células inmunológicas, donde la oportunidad de medir varios parámetros, tales como la integridad de la membrana y la separación de la población celular, y la exigencia de células en suspensión combinada con el desarrollo de la única longitud de onda indicadores de calcio hacen citometría de flujo de un método ideal y convenientdetection 13-15. En las células adherentes, imágenes de células vivas proporciona la mayoría de la información acerca de la señalización de calcio, lo más importante la cinética, pero requiere una instalación complicada que comprende un microscopio de fluorescencia, un sistema de perfusión, el mantenimiento del entorno celular, tales como la temperatura, y software especializado microscopio para la adquisición de y analizar los datos. Los métodos alternativos, tales como un lector de microplacas de fluorescencia o Pharmacolmedios gico a través del uso de quelantes de calcio son incomparables en términos de la información obtenida. La citometría de flujo es cada vez más ampliamente utilizados para monitorear el calcio citosólico en células adherentes, sin embargo, en la mayoría de estudios, sólo punto final de las mediciones se realizan. Utilizando el método desarrollado inicialmente por Gergely et al. En las células B inmunológicos 16, los cambios en la concentración de calcio libre citosólico mediante citometría de flujo con la cinética en tiempo real y el seguimiento de la intensidad de fluorescencia en las células individuales a partir de una población de muestra se han medido con éxito en las células epiteliales de cáncer y de células madre de cáncer híbridos 17. Este método fue adaptado, además, para su uso en células epiteliales adherentes, que son difíciles de cargar con indicadores de calcio 18.

Aquí, usando una línea celular epitelial adherente inmortalizada derivada del segmento S1 del túbulo proximal del riñón de rata (WKPT-0293 CL.2) 19, se describe un m simplificado optimizadoétodo para la medición de los cambios en la concentración de calcio citosólico por citometría de flujo. Dado que muchas células epiteliales poseen un número de transportadores orgánicos de compuestos aniónicos, la carga de las células con un indicador de calcio puede llegar a ser un reto. Para evitar que el flujo de salida de indicadores de calcio, probenecid, el inhibidor prototípico de los transportadores de aniones orgánicos y originalmente desarrollado para reducir la excreción renal de la penicilina 20, se aplica simultáneamente en el medio de incubación. Las células se mantienen en monocapas de indicador de calcio de carga, llevados en señales de suspensión y de calcio pueden ser detectados inmediatamente después de la adición del compuesto.

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Protocolo

1. Preparación de Reactivos y Soluciones

  1. Preparar la solución de una sal equilibrada de Hank modificada (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 de NaHCO3, pH 7,2, sin rojo de fenol). Almacenar a 4 ° C.
  2. Hacer 1,5 M CaCl 2 y 2 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluciones madre usando agua destilada.
  3. Preparar una solución madre 250 mM de probenecid. Por la forma de ácido libre (a menudo referida como insolubles en agua), disolver en polvo probenecid en NaOH 1 N, llenar tres cuartas partes del volumen final con agua destilada y titular lentamente a pH 7,4 con HCl 1N. Almacenar a 4 ° C.
  4. Disolver membrana fluorescente de calcio permeable colorante de unión en sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO) a una concentración madre de 1 mM. Conservar a -20 ° C en la oscuridad.
  5. Antes de cada experimento, recién preparar H que contiene probenecid-BSS flujo (PHF) mediante la combinación de tampón modificado con HBSS (en concentraciones finales) 1,5 mM CaCl 2, HEPES 10 mM, pH 7,2, suero bovino fetal al 5%, probenecid 2 mM, 5,55 mM y glucosa. Calentar a 37 ° C.

2. Cultivo Celular

  1. Placa de células de 2,5 x 10 5 renales proximales tubulares (WKPT-0293 CL.2) por pocillo de una placa de 6 o 35 mm plato en medio de cultivo estándar y crecen durante 2 días alcanzando una confluencia de aproximadamente el 70%.

3. Calcio colorante de carga

  1. Para cada plato o bien, mezclar 1 ml de medio de cultivo que contiene suero bovino fetal al 5%, 4 mM celular permeable colorante de unión a calcio y probenecid 2 mM.
  2. Sustituir el medio de cultivo con 1 ml de mezcla de colorante de carga en cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 30 min en un incubador humidificado con 5% de CO 2. Cubrir la placa con papel de aluminio para evitar la decoloración del indicador fluorescente.

4. Preparación de CeLLS para citometría de flujo

  1. Ácido etilendiaminotetraacético caliente tripsina 0,05% (EDTA) solución a 37 ° C.
  2. Aspirar la solución de calcio colorante de carga de cada pocillo y añadir 1 ml de tripsina a lo largo de la pared del pozo.
  3. Incubar a 37 ° C hasta que se separan todas las células.
  4. La transferencia de células a un tubo de 1,5 ml y pellet por centrifugación en una microcentrífuga a 10.000 g durante 1 min.
  5. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
  6. Lavar las células mediante la adición de tampón de PHF 1 ml y resuspender pipeteando arriba y abajo.
  7. Sedimentar las células por centrifugación a 10.000 g durante 1 min.
  8. Repita los pasos 4.6. y 4.7. otras dos veces.
  9. Resuspender las células en un volumen final de 500 l de tampón PHF y utilizar las células para la experimentación dentro de 1 hr.
  10. Opcional: células de recuento para determinar la concentración de células y usan 5 × 10 4 - 1 x 10 5 células por medición.

5. Flujo CytConfiguración ometer

  1. Iniciar el citómetro de flujo, abrir el cajón de fluidos y activa el interruptor de palanca de válvula de ventilación para aumentar la presión de aire del tanque de fluido de funda.
  2. "Prime" el instrumento para eliminar posibles burbujas de aire que residen dentro de las cámaras de aire y la cámara de flujo.
  3. En el software de citometría de flujo, abrir dos ventanas de la trama de puntos.
    1. El primer gráfico de puntos requiere luz dispersada hacia adelante (FSC) para el parámetro X y luz dispersada lateral (SSC) para el parámetro Y para el control de la calidad de las células dentro de la muestra a través de su tamaño y su granularidad, respectivamente.
    2. El segundo gráfico de puntos mide la intensidad de la fluorescencia del colorante de calcio unido. Seleccione el canal de detección de fluorescencia adecuado para el parámetro Y usando una escala logarítmica y el tiempo en segundos para el parámetro X en una escala lineal.
  4. Ajuste el caudal de "alto".

6. Citometría de Flujo Measurement

  1. Realizar las mediciones a temperatura ambiente. En un tubo de citometría de flujo de la muestra (11,5 x 75 mm), añadir tampón de PHF 480 l.
  2. Añadir 20 l de suspensión celular y vortex brevemente para mezclar.
  3. Mover el brazo de soporte de tubo a un lado y posicionar el tubo de muestra sobre el tubo de inyección de la muestra hasta que se forme un sello hermético. Devuelva el brazo de soporte del tubo a su posición centrada originales.
  4. Optimizar la medición mediante el ajuste del canal de fluorescencia de tal manera que la intensidad de fluorescencia media de la muestra es de aproximadamente 10 2 en el eje y. Guardar y utilizar para experimentos posteriores.
  5. Para iniciar un experimento, repita los pasos 6.1 a 6.3.
  6. Fluorescencia basal Record de 50 seg.
  7. Pausa de medición, retire el tubo de la muestra, añadir compuesto de interés, vórtice brevemente y volver al tubo de inyección de la muestra. Este paso no debe tomar más de 15 segundos.
  8. Reanudar la medición y continuar por un total de 204,8 seg.
  9. Use un i calcioonophore, tales como ionomicina (10 mM), y un quelante de calcio, tal como etilenglicol tetraacético (EGTA), MnCl 2 o CoCl 2 (2 mM), para los controles positivos y negativos, respectivamente.

Análisis 7. Datos

  1. Analizar datos utilizando el software citometría de flujo dedicado para análisis fuera de línea, como WinMDI (Windows Interfaz de documentos múltiples para citometría de flujo), un paquete de software libre desarrollado por Joe Trotter en el Instituto Scripps, Fondo de Citometría de Flujo.
  2. Abrir un gráfico de puntos con los parámetros del SSC y FSC.
  3. Seleccione la región de las células para el análisis utilizando la herramienta "Regiones" (botón derecho del ratón en la imagen) para excluir las células muertas o restos de células que se encuentra en la esquina inferior izquierda del análisis de datos (Figura 1).
  4. Cuadrante análisis (Figura 2)
    1. Abrir una gráfica de densidad con el tiempo en el eje x y la intensidad de fluorescencia en el eje y. Utilice todos los eventos.
    2. Nosotrose la misma región gating como en 7.3.
    3. Cuantificar los datos mediante el uso de la herramienta "Cuadrante".
    4. Ajuste los separadores de cuadrante de modo que la línea vertical se coloca en el momento de la adición del compuesto y la línea horizontal se coloca en el centro de la fluorescencia basal en los controles. Asegúrese de que la colocación de los separadores de cuadrante es igual en todas las muestras.
    5. El porcentaje de células en cada cuadrante se muestra en cada esquina (Figura 2). Compare el cuadrante superior derecho (UR) entre las muestras.
  5. Análisis de histograma (Figura 3)
    1. Abra los datos de control en una ventana del histograma con la intensidad de fluorescencia en el eje x y eventos en el eje y. Utilice todos los eventos.
    2. Para una visión pictórica, agregar los datos de las pruebas para ser comparado con la parcela de control como parcelas de superposición (vaya a Archivo → Abrir Archivo → → Seleccionar archivo de superposición).
    3. Para el análisis cuantitativo, solo histograma ganardows deben ser utilizados. Puerta de la población celular utilizando la región R1 desde el paso 7.3.
    4. En el control no tratado, utilizar la función de marcador ("marcadores") para marcar el área para el análisis de partida desde el punto medio entre el mínimo y el máximo de fluorescencia del pico de control y terminando en la intensidad de fluorescencia máxima. El porcentaje de células en esta área se calcula.
    5. Recuperar los datos de la ventana de estadísticas. Repita para el resto de los ficheros de datos usando la misma zona marcada para el análisis.
  6. Análisis de la intensidad de fluorescencia (Figura 4)
    1. Abrir un gráfico de puntos con el tiempo en el eje x y la intensidad de fluorescencia en el eje y. Utilice todos los eventos.
    2. Habilitar "Modo Cinética" y "Superposición línea Cinética". Una línea azul aparecerá en el gráfico de puntos que representa la intensidad media de fluorescencia.
    3. Cuantificar la entrada de calcio en relación con la creación de varias regiones rectangulares. Cada región debe tener awAncho de la de "50", que es equivalente a "10 sec". Definir hasta 15 regiones rectangulares.
    4. Recuperar la cuantificación de la ventana de las estadísticas y de la copia en una hoja de cálculo.
    5. Utilice los datos-y media para el análisis. Calcular la media de R2 a R6, que es equivalente a 20 a 50 seg. Este es el valor de línea de base.
    6. Elija un intervalo de tiempo apropiado para el análisis del flujo de calcio (depende de inicio, duración e intensidad).
    7. Calcular las señales de calcio de cada región dentro de este intervalo de tiempo con respecto al valor basal media, es decir, la señal de fluorescencia antes de la adición del compuesto, que se establece a 100%. Determinar la media y la desviación estándar de las regiones Publicación de la adición del compuesto; esta es la señal de calcio media evocada por el compuesto.

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Resultados

Para aumentar el calcio citosólico, dos compuestos farmacológicos se aplicaron a células renales proximales tubulares (WKPT-0293 CL.2) cargadas con colorante de unión a células de calcio permeable, Fluo-3 AM. Muestras de control no tratadas se cargaron con colorante de unión a calcio en presencia de probenecid y se mezclaron, pero sin la adición de ningún compuesto. Tapsigargina (TG) es un inhibidor de la bomba clásica SERCA dando lugar a fugas fuera de la ER y resulta en aumento de calcio citosólico. Tunicamicina (TUN)...

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Discusión

El calcio es un acontecimiento clave en múltiples procesos celulares que actúan como una segunda molécula de señalización mensajero y también como un medio para comunicar entre el ER y las mitocondrias. La capacidad de medir los cambios en las concentraciones de calcio libre citosólico es una técnica útil que puede aplicarse a todas las áreas de la biología celular. Hay varios métodos para detectar señales de calcio citosólico. Clásicamente, las señales de un indicador de calcio radiométrico, como Fura-2, son monitoread...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación en los laboratorios es financiado por la Fundación Fritz-Bender, Múnich, Alemania (a TD) y de la Universidad de Witten / Herdecke beca de investigación interna (a W.-KL). Nos gustaría agradecer a Prof. Dr. Dr. Frank Thévenod (Instituto de Fisiología, Fisiopatología y Toxicología de la Universidad de Witten / Herdecke) para sugerencias útiles.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fluo-3, AMInvitrogenF-1241 Permeable a las células
ProbenecidSigma-AldrichP-8761Insoluble en agua, disuelto en 1 N NaOH
0.05% Tripsina-EDTA (1X)Invitrogen25300-062
IonomicinaSigma-AldrichI9657
ThapsigarginTocris Bioscience1138
TunicamicinaSigma-AldrichT7765
FACSCalibur Citómetro de flujo + Software CELLQuestBecton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)Joe Trotter, The Scripps InstituteTenga en cuenta que esta es una aplicación antigua de 16 bits que lee archivos compatibles con FCS 2.0 pero no reconoce los datos digitales de FCS 3.0.
WKPT-0293 Cl.2 línea celular de túbulo proximal de riñón de rata Biofísica, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)
Disponible por el Dr. Ulrich Hopfer (Departamento de Fisiología &

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