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Artículo de método

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

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DOI:

10.3791/51879

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29 de enero de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Resumen

Análisis de alta resolución de la morfología y función de las neuronas de mamíferos a menudo requiere la determinación del genotipo de los animales individuales, seguido por el análisis de cultivos primarios de neuronas. Se describe un conjunto de procedimientos para: etiquetado de los ratones recién nacidos que se genotipo, genotipificación rápida, y el establecimiento de cultivos de baja densidad de las neuronas del cerebro de estos ratones. Ratones individuales están etiquetados por los tatuajes, que permite la identificación a largo plazo que dura hasta la edad adulta. Genotipado por el protocolo descrito es rápido y eficiente, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico con una buena fiabilidad. Esto es útil en circunstancias donde el tiempo suficiente para el genotipado convencional no está disponible, por ejemplo, en los ratones que sufren de letalidad neonatal. Cultivos primarios de neuronas se generan a baja densidad, que permite a los experimentos de imagen a alta resolución espacial. Este método de cultivo requiere la preparación de capas de alimentación gliales antes de chapado neuronal. El protocol se aplica en su totalidad a un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento DYT1 (AE-torsinA ratones knock-in), y cultivos neuronales se prepara a partir del hipocampo, la corteza cerebral y el estriado de estos ratones. Este protocolo se puede aplicar a los ratones con otras mutaciones genéticas, así como a animales de otras especies. Además, los componentes individuales del protocolo se pueden utilizar para los sub-proyectos aislados. Por lo tanto este protocolo tendrá amplias aplicaciones, no sólo en la neurociencia, sino también en otros campos de las ciencias biológicas y médicas.

Introducción

Modelos de roedores de enfermedades genéticas han demostrado ser útiles en el establecimiento de las funciones fisiológicas de las proteínas normales y ácidos nucleicos, así como las consecuencias fisiopatológicas de defectos en estos. Los ejemplos incluyen ratones deficientes para proteínas implicadas en funciones celulares clave, así como modelos de ratón de trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, ciertas manipulaciones genéticas pueden conducir a la letalidad neonatal poco o unos pocos días después del nacimiento. En estos casos, los cultivos celulares primarios son una herramienta importante porque las células vivas se pueden obtener de las crías de embriones o neonatales antes de la muerte, que pueden mantenerse durante al menos un par de semanas in vitro, y durante este tiempo el desarrollo neuronal temprana pueden ser seguidos por experimentos bioquímicos, morfológicos y funcionales. Para los cultivos primarios, puede ser beneficioso para la placa de las neuronas a baja densidad; esto hace que sea posible visualizar la somata individual, dendritas, árboles axonal y termi nervionales en alta resolución espacial. Sin embargo, la supervivencia y la diferenciación de las neuronas a baja densidad típicamente requiere que se colocan en una capa alimentadora glial, co-cultivadas con células gliales en la ausencia de contacto físico con ellos, o se cultivaron en medio acondicionado por células gliales 1.

El establecimiento de cultivos neuronales de baja densidad en capas alimentadoras gliales puede depender de rápido y fiable de genotipado de antemano - dentro de unas pocas horas en contraste con unos pocos días. La velocidad es especialmente importante cuando el genotipo neuronal necesita ser adaptada a la de una capa alimentadora glial preparado de antemano. Como un ejemplo más práctico, puede ser necesario decidir que las crías de que el genotipo para usar en cultivos de generación, para optimizar la eficiencia de un experimento.

Aquí demostramos el protocolo de trabajo que se ha utilizado para una rápida y simplificada y fiable de genotipado de ratón en publicaciones anteriores 2-6. Colas de ratón yse utilizó un kit disponible comercialmente. Este protocolo incluye la extracción de una sola etapa de los ácidos nucleicos a partir del tejido, y no requiere ni una etapa de purificación de ácido nucleico ni el uso de un tampón de terminación ("solución de parada '). La fiabilidad de este método de genotipificación se ilustra mediante la presentación de los resultados de una serie de pruebas cuando se introducen las diferencias con respecto a la cantidad de partida de los especímenes, la edad de los animales y la longitud de los amplicones de PCR. Este kit ofrece las ventajas de la extracción y la fiabilidad automatizado.

Por el bien de ser integral, también se demuestra el uso de los tatuajes para la identificación a largo plazo de los ratones con genotipo. El tatuaje se logra mediante la aplicación de la tinta de tatuaje en la dermis de la piel (debajo de la epidermis) 7. Se describe un procedimiento para el tatuaje las almohadillas de las patas de ratones recién nacidos o 1 día de edad, aunque los tatuajes se pueden aplicar a otras partes del cuerpo, tales como colas y dedos de los pies, y para animals, de todas las edades. Además, los procedimientos se demostrarán para el recubrimiento y el cultivo de neuronas de ratón a una densidad baja, basado en la preparación optimizada de diferentes tipos de capas de alimentación gliales 2,8.

Usamos un modelo genético de ratón de la enfermedad neurológica DYT1 distonía heredado - un trastorno de movimiento autosómica dominante causada por una mutación en el gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteína codificada, torsinA, pertenece a los "ATPasas asociados a diversas actividades celulares" (AAA +) familia de proteínas, cuyos miembros en general, desempeñará las funciones de tipo chaperón, la asistencia en: proteína que se desarrollan, desmontaje-proteína compleja, el tráfico de membrana, y la fusión de vesículas 10-13. La mutación en un marco de supresión de un codón para el ácido glutámico, y pueden llevar a la manifestación de "inicio temprano generalizado aislado distonía '14,15. Sin embargo, el caminomecanismos ophysiological responsables de este trastorno siguen siendo poco conocidos. En un modelo de ratón knock-in, el alelo mutante es TOR1A tm2Wtd, mencionado en lo sucesivo como TOR1A AE. Heterocigota? E-torsinA knock-en ratones son pacientes humanos viables genéticamente y mímicas con distonía DYT1, mientras homocigotos ronda en ratones mueren después del nacimiento 16,17, con la latencia a la muerte postnatal afectados por los antecedentes genéticos 18. La temprana muerte de homocigotos ratones knock-in requiere que tanto la determinación del genotipo de los animales y el establecimiento de cultivos neuronales se completan rápidamente. Como otro ejemplo de genotipado, TFAP2A (factor de transcripción AP-2α, la activación de la proteína de unión a 2α potenciador) se utilizará. La proteína codificada por este gen es importante en la regulación de múltiples procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y apoptosis 19.

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Protocolo

NOTA: Todos los animales procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Iowa.

Identificación 1. a largo plazo de ratones utilizando Tatuaje las almohadillas de las patas

  1. Inmovilizar una pata con la (superficie plantar) almohadilla plantar cara al experimentador. Sostenga la pata con el pulgar y el dedo índice. Tenga cuidado de no pellizcar la pata.
    NOTA: inmovilización estable es importante asegurarse de que el pigmento del tatuaje se coloca en la dermis de la almohadilla de la pata, y por lo tanto es permanente 7.
  2. Limpiar la almohadilla de la pata con etanol al 70% sobre una esponja de gasa o hisopo.
  3. Aplicar aceite de la piel a un aplicador con punta de algodón, y presionar suavemente la punta contra la superficie de la almohadilla de la pata varias veces. Utilice sólo una pequeña cantidad de aceite de la piel; cuando está presente en grandes cantidades, se evitará que el pigmento del tatuaje de llegar a la piel.
  4. Sumerja las puntas de las agujas de tatuaje en la tinta de tatuaje justo antesa los tatuajes. Utilice limpia, aséptica y agujas de tatuaje afilados, para disminuir el dolor y la posibilidad de infección, y también para aumentar la eficiencia de tatuaje.
  5. Mientras que la superficie de la almohadilla de la pata se cubre con el aceite de la piel, presione la punta de aguja del tatuaje vertical y ligeramente contra la piel en el centro de la almohadilla de la pata, y se inyecta la tinta en múltiples ocasiones. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para la información sobre el sistema de tatuaje eléctrica.
  6. Rocíe etanol al 70% en una esponja de gasa, presione suavemente contra la pata de eliminar pigmento del tatuaje extra en la superficie de la piel, e inspeccionar la calidad del tatuaje. Compruebe que el medio de la almohadilla de la pata tiene un punto oscuro, redondo que difiere de la pigmentación normal de la piel. Si el tatuaje no es oscuro o lo suficientemente grande como para facilitar la visualización, repita los pasos anteriores para tatuajes.

2. Los ratones recién nacidos Genotipado utilizando un kit de PCR genotipificación rápida

  1. Desinfectar el extremo distal de una cola de ratón con etanol al 70%, corte 5 mm o menos de la colala punta y la transfiere a un tubo de una tira 8 de tubo del tipo utilizado para la PCR. Use una hoja de afeitar no-utilizado para cada cachorro para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. Alternativamente, utilice un par de tijeras, pero en este caso, con cuidado y eliminar completamente el tejido restante en las palas utilizando etanol al 70%. Compruebe si hay sangrado. Si se produce sangrado, aplique presión en la parte de corte de la cola con una esponja de gasa hasta que el sangrado se ha detenido.
  2. Añadir 200 l de solución de extracción de ADN a cada tubo de PCR que contiene una muestra. Vea la Tabla de Materiales / Equipo para su composición e información sobre el kit.
  3. Coloque la tira tubo en un termociclador de PCR, y comenzar la extracción de ADN utilizando el siguiente programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 min, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y mantenimiento a 4 ° C.
    NOTA: Este es el mismo termociclador de PCR que se utiliza después para PCR.
  4. Una vez finalizada la extracción de ADN, retire la tira del tubo del termociclador unnd invertir 5 veces.
  5. Transferencia de 4 l de la solución (extracto de ADN) de cada muestra a un un-tubo utilizado de una tira de 8 tubos y mezclar con: 10 l de 2X PCR Ready Mix II, 2 l de mezclado adelante y atrás primers (se recomienda 0,5 M; véase la Tabla de Materiales / Equipo de secuencias), y 4 l de nucleasa libre de H 2 O, para cada muestra. Centrifugado brevemente (por ejemplo, 3 segundos) usando una centrífuga de mesa. Mantener los tubos en hielo en todo momento excepto durante la manipulación.
  6. Realizar ciclos térmicos. Ver Tabla de Materiales / Equipo para el programa térmico.
  7. Detectar los productos de ADN amplificados. Cargar la solución de reacción total de la PCR (20 l) directamente en un pocillo de un gel de agarosa. Cargar los marcadores de peso molecular en un pozo separado. Aplicar un campo eléctrico.
  8. Adquirir imágenes de fluorescencia de las bandas bajo la luz ultravioleta.

3. cultivo primario de cerebro de ratón Neuronas en glial conexión de la capa

NOTA: Los procedimientos para la disección de cerebro y de disociación de células (3,1) son comunes a todos los procedimientos posteriores. Los procedimientos de culturas gliales ratón (3.2), las culturas gliales de rata (3,3), y cultivos neuronales de ratón (3.4) se describen por separado después.

  1. Cerebro Disección y Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar un ratón o una rata crías por decapitación, retire rápidamente el cerebro, y lo coloca en una solución de Hanks (ver Tabla 1 para la composición) + 20% de suero fetal bovino (SFB) en una placa de 35 mm (conservado en hielo).
    2. Cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios. Retire la región de interés (por ejemplo, la corteza cerebral, cuerpo estriado e hipocampo) de cada hemisferio del cerebro. Retire las meninges y los principales vasos sanguíneos de la superficie. Cortar la región del cerebro en 4-10 rodajas finas utilizando una cuchilla quirúrgica.
    3. Enjuague las rodajas de cerebro en un tubo de centrifugación de 15 ml, una vez que el ingenioLa solución de + 20% de FBS, y luego 3 veces con la Hanks 'h Hanks solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Para enjuagar, añadir solución de 5-10 ml, dejar que el cerebro rebanadas se depositan en el fondo del tubo, aspirar la solución desde la parte superior, y añadir una solución fresca. Finalice el procedimiento de enjuague mediante la aspiración de la solución.
    4. Filtra 2 ml de la solución de digestión que contiene tripsina (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente en el tubo que contiene las rodajas de cerebro. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a temperatura ambiente.
    5. Neutralizar la solución de tripsina primero mediante la aspiración de la mayor parte de ella y luego mediante la adición de 7-10 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
    6. Enjuagar las rodajas de cerebro, dos veces con Hanks '+ solución de FBS al 20%, y luego tres veces con la Hanks' solución (es decir, sin suero) (todos a 4 ° C). Finalice el procedimiento de enjuague aspirando el solutde iones.
    7. Filtra 2 ml de la solución de disociación (véase la Tabla 1 para la composición) usando una jeringa de 3 ml y un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente al tubo con las rodajas de cerebro.
    8. Mecánicamente disociar las células por trituración suave 10-20 veces, hasta que las piezas de tejido visibles desaparecen. Use una pipeta Pasteur pulida al fuego algodón tapado y evitar hacer burbujas durante la trituración.
    9. Espere 3 minutos para piezas pequeñas para establecerse.
    10. Transferir la mayoría de la solución (~ 1,5 ml, dejando un poco de solución en la parte inferior) a un tubo de 15 ml de centrifugación que contiene 3 ml de solución de Hanks solución de FBS + 20% (4 ° C), utilizando el algodón enchufado, fuego pulido pipeta Pasteur. No transfiera toda la solución, porque la inserción de ningún sedimento en el fondo general resulta en el deterioro de la cultura.
    11. Se centrifuga durante 13 min a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar el sobrenadante con cuidado,añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño (37 ° C) al sedimento, y resuspender que pipeteando suavemente varias veces utilizando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego.
      NOTA: Hay tres tipos diferentes de chapado medios se utilizan para diferentes propósitos cultura: chapado medio-1 para las células gliales del ratón, enchapado medio-2 para las neuronas de ratón, y enchapado medio-3 para las neuronas de rata y células gliales (ver Tabla 1 para las composiciones) .
    13. Sacar 10 l de la suspensión celular, se mezcla con 10 l de solución de azul de tripano al 0,4%, y medir la densidad de células vivas, utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  2. Culturas del ratón gliales
    1. Lavar los cubreobjetos para ayudar a establecer culturas saludables de células de ratón.
      1. Sumerja cubreobjetos de vidrio (redondo, diámetro 12 mm) en ácido nítrico al 70% en una placa de Petri de vidrio. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio y colocarlo en un orbital agitador O / N.
      2. Enjuague el vaso coverslips en la placa de Petri al menos tres veces con agua destilada. Sumergir en agua destilada. Coloque el plato en un orbital agitador O / N.
      3. Seque el cubreobjetos sobre un papel de filtro Whatman 150 mm en la cabina de seguridad biológica.
      4. Autoclave los cubreobjetos.
      5. Coloque el cubreobjetos en 24 pocillos placa de cultivo.
    2. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    3. Obtener las células cerebrales de las crías de ratón, según el paso 3.1.
      NOTA: El uso de la corteza cerebral es típico para la preparación de la capa alimentadora glial ratón. Sin embargo, otras regiones del cerebro, como el hipocampo y el cuerpo estriado, trabajarán después del ajuste adecuado de la densidad celular debido a diferentes números y los rendimientos de las células de diferentes regiones.
    4. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-1 a la suspensión final de células (~ 1 ml). Para pre-calentamiento medios de cultivo, colocar la solución en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, parapermiten que los valores de temperatura y de pH se estabilice.
    5. Transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo T25 sin revestir, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo.
    6. En 1 día in vitro (DIV), enjuagar las células cultivadas en el frasco T25 dos veces con medio de baño-1 (4 ° C). Colocar el matraz de nuevo en la incubadora. Realizar aclarado por aspiración el medio interior del matraz completamente con una pipeta Pasteur, añadiendo ~ 5 ml de medio fresco y inclinando suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino.
    7. En 6-9 DIV, (es decir, un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos, en pasos 3.2.8-3.2.13), colocar 100 l de material de recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular (véase la Tabla de Materiales / Equipo para comentarios acerca de el material de revestimiento) en los cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
    8. En 7-10 DIV, cuando las células son 20-40% confluentes (espacialmente continua), trypsinize ellos.
      1. Lavar el matraz una vez, por aspiración de toda la solución en el matraz y la adición de ~ 13 ml de solución de Hanks (4 ° C), inclinar suavemente el matraz varias veces en un movimiento de torbellino, y aspirar la solución completamente.
      2. Añadir 40 l de solución de DNasa (concentración final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solución de tripsina-EDTA, pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras, y añadir el filtrado directamente a las células en el matraz.
      3. Deje que el tratamiento con tripsina proceder durante 13 minutos a 37 ° C en la incubadora.
      4. Neutralizar la solución de tripsina mediante la adición de 2 ml de 100% de SFB (4 ° C) en el matraz.
      5. Transferencia de las células tratadas con tripsina a un tubo de 15 ml utilizando una centrifugación de 5 a 10 ml pipeta, añadir ~ 4 ml de solución de Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), se centrifuga a ~ 185 g y 4 ° C durante 13 min y aspirar el sobrenadante.
    9. Resuspender el precipitado en 1 ml de pre-Warmemedio-1 d chapado.
    10. Medir la densidad de las células de acuerdo con la etapa 3.1.13.
    11. Aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio, y la placa de ~ 50 l de las células gliales se volvieron a suspender en cubreobjetos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    12. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora.
    13. 20-60 min después, añadir 1 ml de pre-calentado medio de baño-1 a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora. Nota: Mientras se añade el medio de recubrimiento, será útil usar otra pipeta para presionar hacia abajo la periferia del cubreobjetos (donde no hay células sembradas), de modo que el cubreobjetos no flotar en el medio.
    14. En DIV 1 de la capa alimentadora glial (es decir, en el cubreobjetos de vidrio), sustituir el medio con 1 ml de pre-calentado chapado medio-1, mediante la aspiración de toda la solución en un pozo y después de llenarlo con medio fresco.
    15. En 2-3 DIV de la capa alimentadora glial cuando el cells son 80-100% confluentes, añadir inhibidor mitótico (10 l de una mezcla de 5-fluoro-2 'desoxiuridina + uridina; concentraciones finales de 81,2 y 204,8 mu M, respectivamente) a cada pocillo, para inhibir la replicación del ADN y por lo tanto suprimir la proliferación de células gliales.
    16. En 7-9 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia (1-2 h antes de chapado neuronas en la capa alimentadora glial), sustituir el medio de cultivo con pre-calentado chapado medio-2 (37 ° C).
      NOTA: Las neuronas se sembraron en el mismo día, con el paso 3.4.
  3. Culturas Rata gliales
    1. Escudo un matraz de cultivo T25 con el mismo material de recubrimiento.
      NOTA: Esto es necesario para la posterior extracción de las células no adherentes en el paso 3.3.5.
      1. Añadir 2,0 ml del material de revestimiento al matraz, y colocar el matraz en el incubador de cultivo.
      2. Después de 2-3 horas, aspirar el material de recubrimiento por completo, de tal manera que el suelo del matraz se vuelve seca.
    2. Obtener las célulasde las crías de rata, según la etapa 3.1.
      NOTA: La región CA3-CA1 del hipocampo se utiliza para la preparación de la capa alimentadora glial de rata. Sin embargo, otras regiones del cerebro, tales como la corteza cerebral y el cuerpo estriado, trabajarán después de ajustar por diferencias en la densidad celular debido a diferentes números y rendimientos de células de diferentes regiones.
    3. Añadir ~ 4 ml de pre-calentado chapado medio-3 a la suspensión final de células (~ 1 ml).
    4. Transferir la suspensión celular en el matraz de cultivo T25 recubiertos, usando el algodón enchufado, pipeta Pasteur pulida al fuego. Colocar el frasco en la incubadora de cultivo (5% de CO 2 -95% de O 2, 37 ° C).
    5. En 2-3 DIV, cuando las células son 20-40% de confluencia, retire no adherente o débilmente células adherentes, mediante el cierre de la tapa con fuerza, agitando el matraz vigorosamente ~ 10 veces, aspirando la solución, y la adición de 4-5 ml de chapado medio-3 (a 4 ° C). Repita este procedimiento una vez. Examinar las células cultivadas a través de toda la planta matraz (por ejemplo,usando microscopio de contraste de fase) para confirmar que los que aparecen neuronal (es decir, aquellos para los que el borde exterior del cuerpo celular aparece en fase brillante) se elimina por completo. Repita el procedimiento con la frecuencia necesaria para eliminar estas células y, a continuación, devolver el frasco a la incubadora.
      NOTA: La fuerza y ​​el número total de 'sacudidas' requeridas pueden variar entre los experimentadores individuales. Lo importante no es mantener el número total de batidos a un número determinado, pero para confirmar que las células tipo neuronas son eliminados.
    6. En 6-8 DIV, cuando las células son 90-100% de confluencia, el paso de las células gliales por tripsinización como en el paso 3.2.8.
    7. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de baño-3 (4 ° C), añadir 10 ml de medio de baño-3 (4 ° C), la transferencia de las células tratadas con tripsina a un matraz T75-un recubiertos, y la cultura en la incubadora.
      NOTA: Las células gliales de rata se pasaron dos veces; en contraste las células gliales del ratón are pases sólo una vez porque se vuelven poco saludable después de varios pasajes. Las células gliales de rata se pasaron en matraces T75 que no están recubiertos con cualquier material de recubrimiento. El recubrimiento permite que las células gliales de rata crezcan demasiado rápido y producen muchas células ciliadas (células ependimarias putativos), que se deterioran las condiciones de cultivo neuronal después.
    8. En 17-19 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 11 días después de pases y un día antes de la tripsinización y enchapado en cubreobjetos por pasos 3.3.9-3.3.14), 100 l de colocar el material de revestimiento en cubreobjetos de vidrio sin lavar ( redonda, 12 mm de diámetro) en una placa de cultivo, y coloque la placa de cultivo en el incubador de cultivo.
      NOTA: Para los cultivos gliales de rata, una diferencia no se observó en los resultados de los cultivos con o sin lavarse los cubreobjetos.
    9. En 18-20 DIV de la cultura glial en un matraz (es decir, 12 días después de los pases), preparar la capa alimentadora glial por trypsinizing las células cultivadas, según step 3.2.8.
    10. Durante la centrifugación, aspirar el material de revestimiento completamente de los cubreobjetos de vidrio.
    11. Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C), y medir la densidad celular, según la etapa 3.1.13.
    12. Ajuste la densidad glial a 10 4 células / ml en vivo, y la placa 100 l de la suspensión de células gliales en los cubreobjetos de vidrio recubiertos.
      NOTA: Estas células establecerán la capa alimentadora glial.
    13. Coloque la placa de cultivo con cubreobjetos en la incubadora durante 20-60 min.
    14. Añadir 1 ml de medio de chapado-3 (4 ° C) a cada pocillo, y colocar el plato de nuevo en la incubadora.
    15. En 3-4 DIV de la capa alimentadora glial, cuando las células sobre cubreobjetos son 40-80% de confluencia, añadir 1 ml del medio de crecimiento pre-calentado (véase la Tabla 1 para la composición) que contiene citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentración final de 4 mM) para detener la proliferación de células gliales. Neurona Plates a 7-9 DIV de la capa alimentadora glial cuando las células son 60-80% de confluencia, con el paso 3.4.
  4. Culturas del ratón neuronales
    1. Etiqueta y genotipo ratones recién nacidos de acuerdo con los pasos 1 y 2.
    2. Utilice las crías de ratón para el paso 3.1.
    3. Ajuste la densidad de la suspensión de células vivas a ~ 2,0 x 10 5 células / ml utilizando pre-calentado chapado medio-2 para el recubrimiento sobre las células gliales del ratón, o el uso de chapado medio-3 para el recubrimiento sobre las células gliales de rata.
    4. Placa de las células en la capa alimentadora glial, añadiendo suavemente la suspensión celular al medio de cultivo de cada pocillo. Nota: El volumen de la suspensión celular que se añade será determinado por el número de destino de las células en un pocillo de cultivo. Por ejemplo, la placa de ~ 60 l de suspensión de células para alcanzar 12.000 células / pocillo.
    5. Tenga en cuenta que no hay solución cambios son necesarios después de que las neuronas se sembraron. Tenga cuidado para evitar la evaporación de la solución de los pozos en el transcurso de la cultura, por humidificar el interior of la incubadora de cultivo.

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Resultados

Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, los resultados representativos se muestran para el etiquetado de los ratones por los tatuajes, genotipificación fiable en diversas condiciones experimentales, y el establecimiento de cultivos primarios de neuronas en capas de alimentación gliales.

El tatuaje

Los cachorros recién nacidos fueron marcadas en las almohadillas de las patas utilizando un sistema de tatuajes ('recién nacido' en la...

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Discusión

El protocolo que aquí se presenta incluye procedimientos para tatuar etiquetar / identificar los ratones, para el genotipado de los ratones de cola consejos, y para el cultivo de neuronas del cerebro del ratón en baja densidad. En una ronda de experimentos utilizando 6-8 crías, estos procedimientos requieren típicamente ~ 0,5 h, ~ 4 horas y ~ 2 h, respectivamente, en un total de 07.06 h. Esto hace que sea práctico para un solo experimentador para completar todos los trámites necesarios desde el momento del nacimiento de...

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Divulgaciones

El autor (Zhengmin Huang) es el presidente de EZ BioResearch LLC que produce los reactivos descritos en este artículo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los investigadores de la Universidad de Iowa, los Dres. Luis Tecedor, Ines Martins y Beverly Davidson por sus instrucciones y comentarios útiles sobre los cultivos estriatales, y a los Dres. Kara Gordon, Nicole Bode y Pedro Gonzalez-Alegre por la asistencia y las discusiones sobre el genotipado. También agradecemos al Dr. Eric Weyand (Sistemas de Identificación y Marcado de Animales) por sus útiles comentarios sobre el tatuaje, y al Dr. Shutaro Katsurabayashi (Universidad de Fukuoka) por sus útiles comentarios sobre la cultura del ratón. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón, el Departamento de Defensa (premio del Programa de Investigación Médica Revisada por Pares W81XWH-14-1-0301), la Fundación de Investigación Médica de la Distonía, la Fundación Edward Mallinckrodt, Jr., la Fundación Nacional de Ciencias y la Fundación Whitehall (N.C.H.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
REACTIVOS - Limpiador de Máquinas de Tatuar Sistemas de
Identificación y Marcaje de Animales, Inc.NMCR3Se utiliza para limpiar las agujas y el soporte después de tatuar.
Agente de secado a máquinaSistemas de identificación y marcaje de animales, Inc.NDAR4Se utiliza para secar las agujas y el soporte después de la limpieza.
Tatuaje neonato pigmento negrosistemas de identificación y marcado de animales, inc.NBP01
Aplicador de Preparación dela Piel Sistemas de Identificación y Marcado de Animales, Inc.NSPA1Q-tip.
Solución de preparación de la pielSistemas de identificación y marcaje de animales, Inc.NSP01Este reactivo proporciona una fina capa de aceite que mejora la eficiencia del tatuaje y evita la decoloración del tatuaje, al (información del proveedor): 1) evita que la piel no tatuada se manche temporalmente, lo que permite evaluar fácilmente la calidad de un tatuaje de la almohadilla de la pata antes de que el cachorro regrese a su jaula de origen. La superficie de la piel manchada se puede confundir con la piel tatuada, 2) reducir el daño de la piel durante el tatuaje – Suavizar la piel y lubricar la aguja ayudará a que la aguja penetre en la piel sin causar daño a la piel, y 3) evitará que el oxígeno molecular ingrese a la piel, reduciendo así las respuestas inflamatorias a las especies reactivas de oxígeno que se pueden generar.
REACTIVOS - genotipado
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Formato de tubo de tira)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Se incluye un colorante rojo de carga para electroforesis en la solución 2X PCR Ready Mix.
Solución de lisis de tejidos AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare la solución de extracción de ADN mezclando 20 y micro; l de la solución de lisis tisular A y 180 µ l de solución de lisis tisular B por muestra.
Solución de lisis de tejidos BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare la solución de extracción de ADN mezclando 20 y micro; l de la solución de lisis tisular A y 180 µ l de solución de lisis tisular B por muestra.
Ácido acético, glacialVWRBDH 3092
Grado optimizado de agarosa, grado de biología molecularrpiA20090-500 Utilizamos geles de agarosa al 2% en tampón TAE que contienen la tinción de gel SYBR Safe DNA (diluida 10.000 veces) o bromuro de etidio (0,5 y micro; g/ml de volumen de gel).
Bromuro de etidioSigma-AldrichE7637-1G
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (EDTA)FisherBP120-500
Puntas de pipeta filtradas, sin aerosoles, 0.1-10 µ lPunto Científico IncUG104-96RS Utilice puntas de pipeta estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.
Puntas de pipeta filtradas, puntas de filtro Premium Fit, 0,5-20 y micro; lDot Scientific IncUG2020-RSUtilice puntas de pipeta que sean estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.
Puntas de pipeta filtradas, puntas de filtro Premium Fit, 1-200 y micro; lDot Scientific IncUG2812-RSUtilice puntas de pipeta que sean estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa. Para todos los pasos relacionados con el ADN, utilice puntas de pipeta filtradas para evitar la contaminación cruzada.
Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Utilizamos cualquiera de estos tres marcadores de peso molecular.
Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Marcador de peso molecular, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
Tubos de PCR, tiras de 8 tubos con tapas superiores de cúpula acopladas individualmente, natural, 0,2 ml USA Scientific1402-2900Utilice tubos estériles y libres de ADN, ARNasa y DNasa. Una tira de 8 tubos es más fácil de manejar y agrupar las muestras que los tubos individuales.
Tubos de PCR, Ultraflux Individual rpi145660Utilice tubos estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa.
Tubo de microcentrífuga Seal-Rite de 0,5 ml, naturalUSA Scientific1605-0000Utilice tubos estériles y libres de ADN, RNasa y DNasa.
SYBR Tinción de gel de ADN seguro * concentración de 10,000x en DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers para amplificar el gen Tor1a en Δ E-torsinA, ratones5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3' (adelante) y 5'-CCT CAG, GCT, GCT, CAC, AAC CAC-3' (reverso) (referencia 18). Estos cebadores se utilizaron a una concentración final de 1,0 ng/µ l (~0.16 µ M) (referencia 2).
Cebadores para amplificar el gen Tfap2a en ratones5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (adelante), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverso) para el amplicón de 498 bp, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (adelante), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverso) para el amplicón de 983 pb, y 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (adelante), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverso) para el amplicón de 1990-bp. Estos cebadores se utilizan a 0,5 µM.
REACTIVOS - cultivo
5-Fluoro-2′-deoxyuridinaSigma-AldrichF0503-100MGConsulte la sección de comentarios de uridina para obtener más información.
Suplemento B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
Placas de cultivo celular 35 x 10 mm Placas, BD falcon tratado con cultivo de tejidos353001
Matraces de cultivo celular, T25, tratamiento con cultivo de tejidos, cuello inclinado, tapón de sellado, 25 cm2 Área de crecimiento, 70 mlBD halcón353082
Matraces de cultivo celular, T75, tratados con cultivo de tejidos, cuello inclinado, tapón ventilado, 75 cm2 Área de crecimiento, 250 mlBD falcon353136
Tubo cónico, polipropileno, 15 mlBD falcon352095
Countess (contador de números de células) portaobjetos de cámaraGIBCO-InvitrogenC10312
Clorhidrato de citosina β-D-arabinofuranósido (clorhidrato de Ara-C)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucosa (Dextrosa) anhidro, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Plato, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Agua destiladaGIBCO-Invitrogen15230-147
DNasa Tipo IISigma-AldrichD4527-200KULa solución madre se prepara a 1.500 unidades/20 μ l = 75.000 unidades/ml en agua destilada.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido en glucosa, GlutaMAX, piruvatoGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Unidad de filtro rápido de PES, 250 ml, membrana de 50 mm de diámetro, 0,2 y micro; m Tamaño de poroNalgene568-0020
Unidad de filtro PES rápido, 500 ml, membrana de 90 mm de diámetro, 0,2 y micro; m Tamaño de poroNalgene569-0020
Suero fetal bovino (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Cubreobjetos de vidrio, 12 mm Redondo, espesor 0,09– 0,12 mm, Nº 0Carolina 633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Sales equilibradas de HanksSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99,5% (titulación)Sigma-AldrichH3375-250G
Ácido clorhídrico, 37%, reactivo A.C.S.Sigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinaSigma-AldrichI5500-250 mg
Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Solución de Matriz de Membrana Basal, Libre de Rojo de FenolBD Biosciences356237Este es el material de recubrimiento para cubreobjetos y matraces. 1) Para prepararlo, descongele la solución Matrigel Basement Membrane Matrix en hielo, lo que generalmente toma ~ 1 día. Con una pipeta preenfriada, alícuota la solución descongelada en matraces T25 preenfriados en hielo y almacene los matraces a -20 °C. Para preparar la solución de trabajo de Matrigel, descongele el Matrigel alícuota en un matraz con hielo, diluya 50 veces agregando una solución MEM preenfriada y mantenga la solución diluida a 4 °C. Es importante enfriar previamente todos los materiales y materiales que entren en contacto con Matrigel, excepto durante y después del recubrimiento de los cubreobjetos, para evitar que se forme un gel prematuramente. 2) Para recubrir los cubreobjetos de vidrio o matraces de cultivo con Matrigel, aplique la solución Matrigel sobre la superficie. Antes de enchapar las celdas, es importante secar completamente la superficie. Para este propósito, podría ser útil aspirar Matrigel durante la centrifugación celular inmediatamente antes de colocar las células y dejar suficiente tiempo para el secado.
Medio esencial mínimo (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Diluyente de suero, 5 mlBD Biosciences355006
Placas Multipocillo, Tratamiento con Cultivo de Tejidos Placa de 24 pocillosBD falcon353047
Placas Multiwell, Placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidosBD falcon353046
Medio Neurobasal-A (1X), líquidoGIBCO-Invitrogen10888-022
Ácido nítricoVWRbdh 3044
NS (Suplemento neuronal) 21 preparado en el laboratorioFuente: referencia 69
pipetas Pasteur, 5 y frac34; ”  Fisher13-678-6AUtilice este 5 ¾ tapón de algodón; ” Pipeta Pasteur para trituración celular. Pula la punta al fuego de antemano para alisar la superficie de corte y reducir el diámetro interno al 50-80% del original. Una punta demasiado pequeña romperá las células y reducirá la viabilidad de la célula, pero una punta demasiado grande disminuirá la eficiencia de la trituración.
Pipetas Pasteur, 9"  Fisher13-678-6B
Cloruro de potasio (KCl), SigmaUltra, ≥ 99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Pipeta serológica, 2 mlBD falcon357507
Pipeta serológica, 5 ml BD falcon357543
Pipeta serológica, 10 mlBD falcon357551
Pipeta serológica, 25 mlBD falcon357525
Pipeta serológica, 50 ml BD falcon357550
Bicarbonato de sodio (NaHCO3, Hidrogenocarbonato de sodio), SigmaUltra, ≥ 99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Cloruro de sodio (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS7653-250G
Hidróxido de sodio (NaOH), pellets, base de metales traza al 99,998%Sigma-Aldrich480878-250G
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sacarosa, SigmaUltra, ≥ 99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Filtro de jeringa, estéril, 0.2 y micro; mCorning431219
Jeringa, 3 mlBD halcón309585
Transferrina, Holo, plasma bovinoCalbiochem616420
Tinción de azul de tripán, 0,4%GIBCO-InvitrogenT10282Se utiliza para contar células vivas/muertas. Renueve una solución vieja de azul de tripano si se reutiliza muchas veces (por ejemplo varias veces a la semana durante varias semanas), porque formará precipitados y dará lugar a lecturas erróneas de la densidad celular.
Tripsina, tipo XISigma-AldrichT1005-5G
Solución de tripsina-EDTA, 0,25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridinaSigma-AldrichU3003-5GLa solución madre se prepara a 50 mg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina y 125 mg de uridina en 25 ml de DMEM (8,12 y 20,48 mM, respectivamente).
REACTIVOS - inmunocitoquímica
Anticuerpo policlonal de conejo anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Anticuerpo, cóctel monoclonal anti-GFAP de ratónMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tatuaje
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO– 9Este sistema de tatuaje de roedores neonatos es un sistema eléctrico que funciona moviendo rápidamente agujas de tatuaje de 1 o 3 puntos verticalmente en la piel. Activa la máquina de tatuar una vez durante aproximadamente 0,5 segundos, mientras las puntas de las agujas de tatuar se mantienen perpendiculares a la superficie de la piel. Preferimos el tatuaje de tres agujas para maximizar el área tatuada, pero el tatuaje de una aguja es efectivo en áreas más estrechas, por ejemplo los dedos de los pies, o si es necesario un control mecánico fino, por ejemplo cuando se tatúan números. Dos rondas de tatuaje a la velocidad más lenta (configurando "1" de 3 pasos) suelen ser suficientes para producir un tatuaje visible y duradero de las almohadillas de las patas.
de genotipado
, horizontal, Wide Mini– Sub Célula GTBIO– RAD170– 4405Los parámetros típicos de electroforesis son la intensidad del campo eléctrico a 6 V/cm y la duración de 25 min para un gel de 10 cm.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini termocicladorBIO-RADPTC-1148EDUNuestras reacciones de PCR para el gen Tor1a en Δ Los ratones knock-in E-torsinA son los siguientes: 1 ciclo de desnaturalización a los 94 ° C durante 3 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, recocido a 58 ° C durante 30 segundos, extensión en 72 ° C durante 2 min. A esto le sigue la extensión final en 72 ° C durante 10 min, y manteniéndolo a 4 °C.
Fuente de alimentación, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPO - cultivo
Contador de células automatizado, CountessGIBCO-InvitrogenC10310Este contador de células automatizado mide por separado las densidades de las células vivas y muertas (no teñidas y teñidas con azul de tripano, respectivamente). Es importante conocer el rango óptimo de mediciones de densidad: el contador que utilizamos tiene la mayor precisión en el rango de 1 x 105 a 4 x 106 células/ml. Si los valores de densidad celular medidos se encuentran fuera del rango recomendado, ajuste el volumen de resuspensión de manera adecuada.
Cabina de Seguridad Biológica, Clase II, Tipo A2NUAIRENU-425-400Esta campana se utiliza para todos los procedimientos de cultivo celular, excepto para la disección cerebral.
CO2 Incubadora, AutoFlow, control de humedad Camisa de aguaNUAIRENU-4850
Banco de limpieza horizontalNUAIRENU-201-330Este banco de limpieza se utiliza para la disección del cerebro (pasos 3.1.1 y 3.1.2 de "Disección del cerebro y disociación celular)".
Orbit LS Agitador de baja velocidadLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Centrífuga de supervelocidadFisher46910 (centrífuga)/46922 (rotor)
knock-in, de tipo salvaje celularEQUIPO - sistema de electroforesis celular

Referencias

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

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