Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.
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Artículo de método
Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células biológicas se observan generalmente en las superficies planas (2D). Esta condición no es fisiológico y fenotipos y formas son muy variables. Selección basada en células en estos entornos tienen limitaciones, por lo tanto graves: orgánulos celulares muestran fenotipos extremos, morfologías celulares y tamaños son orgánulos celulares heterogéneas y / o específicos no se pueden visualizar correctamente. Además, las células in vivo se encuentran en un entorno 3D; en esta situación, las células muestran diferentes fenotipos principalmente debido a su interacción con la matriz extracelular que rodea el tejido. Con el fin de estandarizar y generar orden de las celdas individuales en un entorno 3D fisiológicamente relevante para los ensayos basados en células, se presenta aquí la microfabricación y las aplicaciones de un dispositivo para el cultivo in vitro de células en 3D. Este dispositivo consiste en una matriz 2D de microcavidades (típicamente 10 5 cavidades / cm 2), cada uno lleno con células individuales o embriones. posición de la célulación, la forma, la polaridad y la organización interna de la celda se convierten entonces normalizado que muestra una arquitectura 3D. Utilizamos moldeo réplica al patrón de una serie de microcavidades, hueveras '', sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un cubreobjetos. Las cavidades se cubrieron con fibronectina para facilitar la adhesión. Las células se insertan por centrifugación. porcentaje de llenado se ha optimizado para cada sistema que permite hasta 80%. Las células y los embriones se confirmó la viabilidad. Se aplicó esta metodología para la visualización de orgánulos celulares, tales como aparato de Golgi y el núcleo, y para estudiar los procesos activos, tales como el cierre del anillo cytokinetic durante la mitosis celular. Este dispositivo permitió la identificación de nuevas características, tales como la acumulación y la falta de homogeneidad de la miosina y actina periódicas durante el cierre del anillo cytokinetic y fenotipos compactados de Golgi y la alineación núcleo. Nos caracteriza el método de células de mamífero, levadura de fisión, la levadura en ciernes, C. elegans wITH adaptación específica en cada caso. Por último, las características de este dispositivo lo hacen particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada.
Introducción
Actual en ensayos basados en células in vitro son de dos dimensiones (2D). Esta configuración no es natural para las células de mamíferos y, por tanto, no es fisiológicamente relevante 1; las células muestran una diversidad de formas, tamaños y fenotipos heterogéneos. Presentan serias limitaciones adicionales cuando se aplica a las aplicaciones de cribado, tales como una distribución desordenada dentro del plano y fenotipos extremos de los orgánulos celulares (fibras de estrés, en particular). Esto es particularmente importante en los ensayos clínicos de las pruebas de drogas, donde los presupuestos altos se gastan cada año. La mayoría ....
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Protocolo
1. La microfabricación de Eggcups ''
- La fabricación del Maestro: microcavidades matriz
- Calentar una oblea de 3 '' de silicio de hasta 200 ° C para evaporar cualquier presencia de humedad.
- Spin-abrigo de una fina capa de SU-8 fotoprotector. Ajustar el volumen de resina y de hilado de velocidad en función del espesor y fotoprotector tipo deseado. Este espesor dictará la profundidad de las hueveras '' (EC). Para una capa de espesor de 30 micras y SU-8 2025, spin-capa a 2.800 rpm.
- Pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min (paso 1 de 2) para un espesor de SU-8 2025 capa de 30 micras. Adaptar el tiempo, depe....
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Resultados
Las hueveras '' (EC) son una metodología novedosa de alto contenido de cribado que permite la visualización de las células y embriones orientadas en un entorno 3D. Además, algunos procesos celulares, que son difíciles de observar en cultivos estándar 2D (planos), pueden ser observados por este nuevo método. La figura 1a muestra un resumen del procedimiento de la microfabricación CE (ver también la Sección 1 en el protocolo anteriormente descrito ). El método es simple, rápido, eficiente y sin ningún req.......
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Discusión
moldeo de réplica se utilizó con el fin de fabricar las 'hueveras. El proceso de fabricación no necesita una habitación limpia; es fácil y simple, aunque puede ser necesario un poco de práctica. En particular, la liberación de la marca de PDMS es el paso más crítico con el fin de producir una gran área de '' hueveras de alta calidad. Por esta razón, especial cuidado tiene que ser tomado en este paso. Si este paso se abstiene repetidamente, tenga en cuenta para optimizar los parámetros del plasma más limpios .......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos L. Brino (planta de filtrado de contenido de alta IGBMC, Illkirch, Francia) para que nos proporciona el anticuerpo anti-Giantin, M. Labouesse laboratorio. para C. elegans (IGBMC) y B. Séraphin laboratorio. de levadura en ciernes (IGBMC), E. y A. Hyman Paluch para las células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresde), J. Moseley (Dartmouth Medical School) y JQ Wu (Universidad del Estado de Ohio) para células de levadura de fisión; A. Hoël y F. Evenou ayuda experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, Francia) para la ayuda técnica, y JC Jeannot (Femto-st, Francia) para ayudar en la microfabricación. Este trabajo fue apoyado por fondos del CNRS, la Univers....
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Materiales
2
<<de CO<<disolver < fuertes> las células
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ddH20 (ultrapuro) | Millipore-Utilice | siempre agua dulce. | |
| Parafilm (película de plástico) | Bemis | PM-999 | Adherir Parafilm a la mesa de laboratorio con unas gotas de agua y garantizar una planitud perfecta de la superficie. |
| Foto-máscara | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Oblea de silicio | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 fotorresistente | MicroChem 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm | |
| requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información. | |||
| Revelador de SU-8 | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA |
| Disponible en varias empresas. | |||
| Sigmacote (reactivo siliconizante) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR |
| es necesario trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información. | |||
| Clorotrimetilsilano (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produce inhalación aguda y toxicidad dérmica, y es altamente inflamable (con retroceso de ignición capaz de ocurrir a distancias considerables), por lo tanto, debe usarse en una vitrina de gases lejos de las fuentes de ignición | |||
| Guantes de nitrilo | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Disponible en varias empresas. | |||
| Cubreobjetos de vidrio #0 | Vidrio de punto | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Muy frágil. Manipula suavemente. | |||
| Pinzas rectas afiladas | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| tubo de 50 ml | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Disponible en varias empresas. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN |
| El paquete contiene tanto la base de PDMS como el agente de curado. Elastómeros similares están disponibles en varias compañías. | |||
| Portaobjetos de vidrio para microscopio | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Disponible en varias empresas. | |||
| Medio de alta glucosa DMEM | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Suero para terneros bovinos | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA |
| 0.25% Tripsina-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS está en 10x y debe diluirse a 1x usando el medio ddH2O | |||
| L-15 | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Medio para atmósferas sin control | |||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Penicilina & Estreptomicina | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Científico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM |
| Placa de Petri P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/Placa de |
| Petri P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Placa de Petri P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehído 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& region=FR |
| Dañino en particular para los ojos, se requiere trabajar en una campana extractora; consulte la hoja de datos del fabricante para obtener más información. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término=93443-100ML& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término=93443-100ML& lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=buscar-a12379 |
| polvo en 1,5 ml de metanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | dilución 1:200 en PBS 1x |
| conejo policlonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | dilución 1:500 en PBS 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| conejo anti-anillina | Cortesía de M. Glotzer, Publicado en Piekny, A. J. & Glotzer, M. La anillina es una proteína de andamiaje que une RhoA, actina y miosina durante la citocinesis. Biología actual 18, 30– 6 (2008). | Dilución 1:500 en PBS 1x | |
| Laboratorio de transducción | antifosfotirosina | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 anti-conejo de cabra | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp Dilución |
| 1:1.000 en PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& region=FR |
| 1 mg/ml durante 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término = G2025 & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& término = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=producto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | - | - | Las células de mamíferos están disponibles en muchas compañías. Ver también Tabla 1 |
| NIH3T3 | ATCC3T3 | están disponibles en muchas compañías. Véase también Tabla 1 | |
| fisión fuerte | - | - | Para más detalles sobre las cepas, contactar al autor correspondiente. Véase también Tabla 1 |
| C. elegans gusanos | - | - | Para más detalles, póngase en contacto con el autor correspondiente. Ver también Tabla 1 |
| YES (Agar) + 5 Suplementos incluidos | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Buscar |
| Para la preparación: siga las instrucciones que figuran en la caja | |||
| SÍ (Medios) + 5 Suplementos incluidos | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Buscar |
| Para la preparación: siga las instrucciones que se dan en la caja | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Buscar |
| Para la preparación: siga las instrucciones que se indican en la caja | |||
| Filtro EMM esterilizado (Medios) - Solo para imágenes | MP Biomedicals | 4110-012 | Para la preparación: siga las instrucciones que se indican en la caja. Filtre y esterilice los medios con un 0.22 µ M en lugar de esterilizar en autoclave. Esto da transparencia al medio y reduce la autofluorescencia. |
| Suplementos (para EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Buscar |
| ( Añadir 225 mg/L en el medio EMM antes de esterilizar en autoclave o filtrar) | |||
| Filtros estériles accionados por vacío Stericup y Steritop | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referencias
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....
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