Research Article
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Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.
Los avances en la comprensión de los mecanismos de control que rigen el comportamiento de las células en modelos de cultivo de tejidos de mamíferos adherentes son cada vez más dependiente de los modos de análisis de una sola célula. Métodos que entregan datos compuestos que reflejan los valores medios de los biomarcadores de las poblaciones de células se arriesgan a perder la dinámica de subpoblación que reflejan la heterogeneidad del sistema biológico estudiado. De acuerdo con esto, los enfoques tradicionales están siendo sustituidos por, o compatibles con formas más sofisticadas de ensayo celular desarrolladas para permitir la evaluación por microscopía de alto contenido. Estos ensayos potencialmente generan un gran número de imágenes de biomarcadores fluorescentes, lo que permitió al acompañar a los paquetes de software propietario, permite mediciones multi-paramétricas por célula. Sin embargo, los costos de capital relativamente altos y el exceso de especialización de muchos de estos dispositivos han impedido su acceso a muchos investigadores.
Descrito aquí es unaflujo de trabajo de aplicación universal para la cuantificación de múltiples intensidades marcador fluorescente de regiones subcelulares específicos de células individuales adecuados para su uso con imágenes de la mayoría de los microscopios de fluorescencia. La clave de este flujo de trabajo es la implementación del software Profiler célula libre disposición 1 para distinguir las células individuales en estas imágenes, segmento que en regiones definidas subcelulares y entregar intensidad marcador fluorescente valores específicos a estas regiones. La extracción de valores de intensidad de células individuales a partir de los datos de imagen es el propósito central de este flujo de trabajo y se ilustrará con el análisis de los datos de control de una pantalla de siRNA para los reguladores de punto de control G1 en células humanas adherentes. Sin embargo, el flujo de trabajo que aquí se presenta se puede aplicar al análisis de datos procedentes de otros medios de perturbación celular (por ejemplo, pantallas de compuestos) y otras formas de fluorescencia basada en marcadores celulares y por lo tanto deben ser útiles para una amplia gama de laboratorios.
El trabajo presentado aquí describe el uso de la Profiler software Cell libremente disponible para realizar desglose algoritmo de guiado de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células adherentes para identificar las células individuales y regiones subcelulares definidos. Este enfoque, conocido como segmentación de la imagen, permite el análisis multi-paramétrico posterior de las células fotografiadas mediante la cuantificación de los marcadores marcados con fluorescencia localizadas a cada célula o región subcelular (denominado como objetos segmentados). Este flujo de trabajo es la base para permitir el análisis de alto contenido y está destinado a servir como una herramienta que pueda desarrollarse y modificarse para adaptarse a multiparamétrica, célula individual analiza en laboratorios que no tienen acceso a los instrumentos de alto contenido especializado o software propietario. Los archivos suministrados con este manuscrito se compone de un conjunto de pruebas de datos de imágenes en bruto pertinentes, configuración del algoritmo y scripts de apoyo para generar el análisis descrito. La configuración del algoritmo proporcionado fo Profiler célula están optimizados para el conjunto de datos de ejemplo y los detalles de la sección Discusión qué puede ser necesario ajustar para permitir el uso de datos de imágenes de otros estudios.
Una vez que los datos cuantitativos se ha extraído usando el Perfil de la célula, los diferentes laboratorios pueden tener diferentes requisitos para el uso de la información presentada por los valores de las celdas individuales en los datos en bruto; Aquí se muestra un método por el cual las puertas se aplican a los datos en bruto para cada ensayo. El uso de estas puertas, los datos se transforman en términos binarios de respuesta, permitiendo la visualización de las tendencias enlazan diferentes tratamientos con las subpoblaciones de células que experimentan respuesta definido por las puertas. Las puertas se establecen basándose en observaciones de las distribuciones de datos obtenidos para controles positivos y negativos apropiados para cada medición relevante. El uso de puertas es sólo un ejemplo de cómo manejar las mediciones primas, basadas en células. También se muestra aquí es el uso de la intensidad del ADN nuclear míasurements en su forma cruda como un rango continuo de valores, en combinación con los datos cerrados. Se deben considerar otros enfoques para la gestión de datos de análisis de imagen, dependiendo de la naturaleza del estudio; alternativas estadísticas al uso de puertas para la asignación de las células a las subpoblaciones se han reportado 2 y sistemáticas las comparaciones de estrategias para resumir los datos de alto contenido a través de un gran número de parámetros se han reportado 3.
Análisis de alto contenido de datos de imagen han encontrado uso en estudios celulares de droga-respuesta, revertir la genética y el estrés ambiental señalización 4-6. El mérito de análisis de alto contenido deriva del hecho de que el análisis algorítmico de datos de microscopía de fluorescencia permite que los parámetros cuantitativos y espaciales que deben considerarse simultáneamente a través de las células individuales 7. De esta manera, los resultados celulares para múltiples ensayos pueden ser un comportamiento referencia cruzada, diferencial de ensayo-dsubpoblaciones de células efined pueden ser rastreados en condiciones experimentales y ensayos pueden incluir la consideración de las variables morfológicas. La estrategias y análisis de flujo de trabajo discutido aquí, como para otros enfoques de alto contenido, son capaces de entregar datos multiplexados que son referencias cruzadas a las células individuales. Estudios de alto contenido de métodos traje que generan imágenes de microscopio fluorescente y que son aplicables al análisis de los datos que van desde decenas de imágenes producidas en microscopía basada en fluorescencia convencional de bajo rendimiento a través de las miles de imágenes producidas utilizando plataformas de alto contenido de detección automáticos.
El flujo de trabajo se ilustra aquí con datos de ejemplo de la cual ensayos separados se miden en términos de cualquiera de las intensidades de marcadores fluorescentes nucleares o translocación citoplasmática / nuclear de una proteína fluorescente reportero, respectivamente. El flujo de trabajo es flexible en que estos ensayos se pueden considerar por separado o en combinación dependiendo de EACh dada pregunta de investigación por diferentes investigadores. Los datos de ejemplo se producen como parte de un ARN de interferencia (RNAi) experimento (Figura 1). Oligonucleótidos pequeños ARN de interferencia (siRNA) se utilizan para desmontables proteínas específicas en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 que resultan en cambios para dos reporteros fluorescentes de quinasa (CDK) la actividad dependiente de ciclina. La fosforilación CDK6 dependiente de la proteína retinoblastoma nuclear en la serina 780 (P-S780 RB1) se evaluó mediante tinción de anticuerpos. En las mismas células, un reportero de la proteína verde fluorescente marcada de la actividad CDK2 (reportero GFP-CDK2) es evaluada por su relación núcleoicitoplasma donde en ausencia de la actividad de CDK2 el periodista reside en el núcleo y en lanzaderas de activación CDK2 en el citoplasma 8. Además, el ADN nuclear de cada célula se tiñe usando un colorante intercalante de ADN, bisbenzimide, que sirve como un medio para identificar las células y definir las fronteras núcleos en las imágenes así unasa medida de la abundancia de ADN proporcionar información sobre la posición del ciclo celular de la célula (Figura 2).
Las actividades de CDK2 y CDK6 son detectables como células de tránsito de G1 a la fase S del ciclo celular 5 y suceden unos a otros 9,10 y, como tal, se espera que cerca de concordancia entre los dos reporteros en células individuales. El conjunto de datos de demostración utilizado aquí como un ejemplo analiza el efecto de siRNA dirigido a CDK6, la proteína retinoblastoma (RB1) y un control negativo no dirigido (Tabla 1). Desmontables de CDK6 debe obtener tanto una disminución de la RB1 epítopo P-S780 y una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular. La caída RB1 sirve como control reactivo para la especificidad del anticuerpo fosfo-S780. Imágenes de microscopio de fluorescencia de formalina fijos 11, las células de cultivo de tejidos teñidos con fluorescencia HCT116 se utilizan para análisis de imagen algorítmica. Los datos numéricos resultante se utiliza entonces parareferencias cruzadas a los reporteros y medir el impacto de los diferentes estados de derribo.
El tamaño potencial de los datos producidos por este tipo de análisis puede presentar un desafío para las herramientas de análisis normales. Por ejemplo, los datos de las celdas individuales pueden ser mayores que un cierto software de hoja de cálculo tendrá en cuenta. Incluido son scripts de Perl que realizan el procesamiento simple, altamente repetitivo, supervisado de los datos para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos. Los scripts de Perl están escritos específicamente para los archivos de salida producidos por la célula de perfiles, al procesar archivos de imagen con una denominación de archivos específico (Figura 3), y permiten un número variable de campos por pocillo para ser utilizados en el análisis. Con frecuencia es importante a los datos de ensayo de célula individual puerta para rastrear las tendencias en las subpoblaciones de células 5 y se muestra aquí es el uso de un script Perl para marcar cada célula sobre la base de una puerta conjunto predeterminado para cada tipo de ensayo. También se incluyen los scripts de Perl opcionalesque resumen los resultados de datos para los pozos individuales (o condiciones), la entrega de: porcentaje de células dentro de la puerta de conjunto y los valores medios de las puntuaciones de ensayo primas. La forma última, más homogénea de la visualización de los datos, es válido que las respuestas afectan a la totalidad o la mayoría de las células dentro de un pozo. Como se discutió anteriormente, dicha evaluación es menos útil que la proporcionada por el gating datos célula individual donde la respuesta se limita a un subconjunto de células dentro de una población.
La utilidad del flujo de trabajo descrito no se limita a la perturbación por siRNA o los ensayos de marcadores descritos. Los estudios han usado este enfoque para ensayar respuestas en experimentos de cultivo de tejidos que utilizan combinaciones de siRNA, inhibidores químicos y tratamiento de radiación y para la evaluación de marcadores distintos de la actividad de CDK2 y CDK6 5.
Conceptualmente, la estrategia experimental permite una variedad de regiones subcelulares biológicamente útiles que se registra automáticamenteen las células individuales presentes en las imágenes de microscopio de fluorescencia. Como tal, este enfoque puede dar datos multiplexados revelar información cuantitativa, biológicos que pueden ser ignorados a través de técnicas que se centran en las poblaciones en lugar de las células individuales. Con modificaciones menores, el enfoque y el análisis de flujo de trabajo descrito se puede producir, datos celulares individuales cuantitativos para las salidas de ensayo basado en fluorescencia y respuestas de células biológica, donde la evaluación cuantitativa del contenido de ADN, la cuantificación de la fluorescencia nuclear o citoplásmica o la shuttling de los marcadores entre estos dos compartimentos ya sea individualmente o en forma multiplexada es de interés. Como requisitos de publicación tienden cada vez más a la presentación de los datos en bruto en acceso abierto, el acceso y la familiaridad con herramientas libres para el análisis de imágenes de microscopía, como los descritos aquí también será de interés directo para los laboratorios que buscan volver a analizar los datos publicados.
1. Experimental Perturbación y Etiquetado celular para marcadores de respuesta (Reversa transfección siRNA pantalla)
2. Imágenes y segmentación de imágenes
3. Extracción de datos
El ejemplo de las imágenes generadas por el uso de la reversa de la transfección siRNA protocolo de cribado han sido preparados y analizados utilizando el software Profiler célula. Los datos en bruto numérica resultante es tal que cada célula está representado individualmente, trazable de nuevo a su imagen y así de origen y se midió para varios parámetros de intensidad de fluorescencia (Figura 6A). Para cada célula identificada la intensidad media de fluorescencia nuclear para el anticuerpo RB1 P-S780 y la intensidad de ADN integrado para las máscaras nucleares tinte definido de ADN se determinan. La media de los valores de intensidad GFP para núcleo y el citoplasma regiones de cada célula también se registran permitiendo el cálculo de la energía nuclear frente a la fluorescencia citoplasmática del reportero GFP-CDK2. Aguas abajo de estos fluorescencia algorítmica mediciones de la intensidad se hace uso de estos datos celulares individuales para definir puertas para dos ensayos, la tinción de anticuerpos nuclear y reportero GFP-CDK2. Anotación posterior de las células en el the base del resultado de ensayo y el uso de estas etiquetas para permitir subpoblaciones específicas que se caracteriza además por una tercera medición (contenido de ADN nuclear) se describe.
Parcelas histograma de los datos de intensidad de fluorescencia en bruto recogidos para cada ensayo son una manera eficaz de evaluar cómo se comportan las subpoblaciones de células en diferentes condiciones. Los histogramas en la Figura 6B muestran las distribuciones de la población de los datos individuales de células de pocillos por triplicado para cada condición caída RNAi. A la izquierda están los datos de intensidad anticuerpo nuclear y de la derecha están los datos correspondientes para el reportero GFP-CDK2. Los datos de anticuerpo RB1 P-S780 revela que existen en términos generales las células en dos poblaciones con respecto a esta modificación post-traduccional y que las poblaciones de células con pérdida de RB1 fosforilados en S780 se pueden distinguir como un pico de la izquierda de la intensidad nuclear que se enriquece cuando CDK6 es derribado por siRNA. Este mismo pico de la izquierdase ve cuando RB1 en sí es el objetivo RNAi, lo que refleja la eliminación directa de la proteína y por lo tanto la tinción RB1 P-S780. En contraste, las mismas condiciones experimentales para las mismas células, cuando se observa a través de el ensayo reportero GFP-CDK2, muestran una dinámica diferente en los datos de celda individuales. Se observa una distribución continua, con sólo un único pico, pero siRNA que perturba el ciclo celular (siCDK6) y provoca la acumulación en los resultados de la fase G1 en una extensión del hombro de la mano derecha de esa distribución (es decir, lo que indica una mayor presencia de células que muestran una aumento en la relación GFP nuclear / citoplasma, trazada en el eje X).
También se muestran en los histogramas de la Figura 6B son los valores de compuerta (barras verticales) que se eligen sobre la base de las distribuciones de ambos conjuntos de datos de ensayo. La norma que se utiliza para los datos de anticuerpos RB1 P-S780 es definir la posición de la puerta como el medio-height: posición de anchura máxima en el hombro izquierdo de la principal(Derecha) de pico cuando se consideran los datos de la celda de control negativo (no la orientación siRNA). Datos destacó rojo son células con reducida y ausente RB1 P-S780, que se identifican con esta puerta. Una puerta similares posicionado sobre el hombro opuesto de la distribución de valor de la relación se utiliza para el reportero GFP-CDK2. Las células de la subpoblación de alta relación resultante, que carecen de función o reducción de la actividad CDK2, se muestran en verde. Para ilustrar el análisis de multiplexado de los dos ensayos de la figura 6C muestra la implementación de ambos valores puerta utilizando el script de perl 2_gate_classifier.pl para convertir los datos en bruto (Figura 6A) en el archivo de anotaciones de abajo. Este nuevo archivo incluye los datos originales, junto con una nueva columna de etiquetas de clase para cada celda y los dos valores de compuerta utilizados para distinguir ellos (en este caso las puertas de 0,004 para los datos de anticuerpos y 1,5 para el reportero GFP-CDK2 se utilizaron, respectivamente) .
Después de haber clasificado las células individuales From cada condición de caída sobre la base de los dos ensayos, ahora es posible utilizar estas etiquetas de clase para ayudar a la anotación de las parcelas de los datos de ensayo. La Figura 7 muestra gráficos de dispersión de los datos de células individuales para la P-S780 RB1 y GFP- ensayos de CDK2 de los datos de ejemplo establecidos para las tres condiciones de ARNi. Anotando el número de cuadrantes en los diagramas de dispersión muestran los porcentajes relativos de cada subpoblación cerrada a la totalidad de ese contexto desmontables y se generan en R usando las etiquetas de clase descritos anteriormente. Estas parcelas revelan que, en comparación con las células transfectadas con la orientación no-siRNA (Figura 7B), las células transfectadas con siCDK6 revela una distribución de red de datos desplazado tanto hacia abajo sobre el eje Y (indicando ausencia de fosforilación en la serina 780 RB1) y hacia la derecha en el eje X (indicando baja actividad de CDK2, Figura 7C). Ambos de estos cambios se espera que para el derribo de este objetivo. En contraste con esto, los datos de SirCélulas B1 transfectadas (Figura 7A) muestran una pérdida de la tinción de anticuerpos de acuerdo con la pérdida del epítopo, pero poco efecto en la distribución de datos para el reportero CDK2 en comparación con los controles no transfectadas con siRNA de metas, sugiere que no hay gran efecto sobre el GFP reportero -CDK2 surge de caída RB1.
Para profundizar en la utilización de datos célula individual, clasificación subpoblación y ensayo de multiplexación Figura 8 muestra el diagrama de dispersión para los datos siCDK6 de perfiles histograma Figura 7C junto emparejados para la intensidad del ADN integrado. Los pares de histogramas se refieren a mitades opuestas de toda la población, divididos sobre la base de cualquiera de intensidad de anticuerpos (derecha del diagrama de dispersión) o valores de la relación reportero GFP-CDK2 (por encima de la nube de puntos). La cuantificación de la intensidad de ADN nuclear de estas poblaciones muestra dos picos característicos de 2N y 4N contenido de ADN como picos izquierdo y derecho, respectivamente. El intentions de las puertas que se muestran en las Figuras 6, 7 y 8 son tales que las células identificadas como baja para P-S780 RB1 (con la etiqueta: P-S780-) o con un alto valor de relación de la reportero GFP-CDK2 (etiquetados: G1) se estar en fase G1 del ciclo celular. De hecho, los histogramas perfil de ADN para las subpoblaciones identificadas con cualquiera de estos ensayos contienen predominantemente células con contenido de ADN 2N. Los perfiles de ADN de la población opuesta cerrada (etiquetados: P-S780 + o no-G1) contiene células con distribuciones que van desde 2N a 4N, de acuerdo con tales células adopción de una gama de posiciones de fase del ciclo celular post-G1.
Aunque el enfoque aquí ha sido la generación y análisis de datos a partir de imágenes de células individuales teñidas fluorescentemente, también es útil ser capaz de tomar estos datos y resumir cada ensayo sobre una base bien por pozo para controlar la variabilidad entre repeticiones y el desempeño de todos los pocillos para un ensayo dado a través de un plato entero de datos. A) los datos RB1 P-S780 y B) los datos reportero GFP-CDK2. Los valores representados en A y B se producen por dos scripts de Perl adicionales proporcionados con este manuscrito; 'Antibody_fluorescence_summary.pl' y 'G1assay_summary.pl', respectivamente. Estos scripts utilizan los datos en bruto creados por Profiler celular (Nuclei.csv) y los datos del informe por así como i) las células totales medidos por pozo, ii) el número de células dentro de la puerta, iii) porcentaje de células dentro de la puerta y iv) la aritmética media de las medidas, los datos en bruto para que así. Se incluye como una opción adecuada para buscar a través de grandes conjuntos de datos de ensayo, antes de centrarse en los datos individuales de tratamiento utilizando la evaluación multiplexado de datos celulares individuales como se ilustra en 8. Los gráficos muestran aquí parcela 'iii) porcentaje de células dentro de la puerta' para ambos ensayos, que se adapten a las distribuciones de datos no normales visto en los datos P-S780 RB1 y GFP-CDK2 en los histogramas en la Figura 6B. Estos scripts también calculan 'iv) la media aritmética de las medidas, los datos en bruto para que así', que se adapten a un análisis de los datos de respuesta de las poblaciones homogéneas y distribución normal de los datos antes y después de la perturbación experimental.
Figura 1:. Visión general de los pasos en el flujo de trabajo para analizar cuantitativamente los datos de imágenes de microscopio marcados con fluorescencia El flujo de trabajo es representado aquí como cuatro pasos (A) En primer lugar, es necesario preparar experimentalmente células para imágenes fluorescentes.. El ejemplo descrito aquí es la de unapantalla en la que las células tumorales humanas adherentes siRNA tratados se cultivan durante 48 horas, se fijaron y se tiñeron en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Diferentes condiciones de ARNi están presentes por triplicado en pocillos separados dentro de la placa. Las células se tiñeron con un tinte de ADN, un anticuerpo específico para RB1 fosforilada en la CDK4 y 6 selectiva sitio diana Serina-780 (P-S780 RB1) y también expresan de manera estable un GFP-CDK2-reportero, información salida del ciclo celular G1. En conjunto, estas sondas fluorescentes constituyen dos ensayos evaluaron por separado dentro del flujo de trabajo. (B) imágenes de microscopio en paralelo para cada sonda fluorescente (canal) se generan y se nombran como para incluir los detalles por los que el software de análisis de imágenes puede organizar los datos. (C) El archivos de imágenes se cargan en el software Profiler célula, que identifica algorítmicamente células individuales y los pares asociados de los núcleos y citoplasma antes de ceder mediciones de la intensidad de las tres sondas fluorescentes detectaned en cada uno. (D) Por último, un script de Perl se utiliza para organizar los datos cuantitativos primas producidas. Este paso se aplica puertas a los datos de intensidad de fluorescencia para cada celda, se va a agrupar eficazmente las células en subpoblaciones, que se pueden representar, seguimiento y repreguntas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los datos experimentales que se obtiene por análisis de imagen, Las células marcadas con fluorescencia, tratados con siRNA fijos partir de los datos set de ejemplo fueron imágenes y mediciones de la intensidad correspondiente, considerados por célula.. Datos de imagen representativos se muestran para cada parámetro registrado durante el análisis de la imagen de intensidad ADN nuclear (A):. La intensidad de la tinción de tinte de ADN nuclear se utiliza para producir una medida de ADN por núcleo (B) Intensidad Nuclear de fosfo-RB1:. inmuno-tinción específica para P-S780 RB1 utilizando un (negro) anticuerpo primario y marcado con fluorescencia anticuerpo secundario (rojo) permiten a la medición de la intensidad de la fosforilación RB1 en . S780 por núcleo (C) reportero GFP-CDK2: Las células utilizadas de forma estable expresar una proteína indicadora GFP-etiquetados que se transloca entre el núcleo y el citoplasma en un patrón del sistema con el ciclo celular. Dual medición de la intensidad de GFP nuclear y citoplásmica emparejado para cada celda permite el cálculo de una relación de por célula que se puede utilizar para distinguir la fase G1 del resto del ciclo celular. Tres blancos siRNA se utilizarán para ilustrar el análisis; un no-objetivo siRNA control negativo; CDK6 siRNA como un control positivo en perturbar la fosforilación RB1 y el progreso del ciclo celular; RB1 siRNA para establecer la especificidad del anticuerpo.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Organización de los archivos de imagen antes de análisis de imagen Las imágenes tomadas de la placa de cultivo tisular se nombran sistemáticamente con el fin de permitir que el software de análisis de imágenes para relacionar los datos de imagen de vuelta al contexto experimental inicial.. Esta información se coloca en el nombre de archivo para cada imagen. (A) Como cada pozo de la placa experimento puede corresponder a diferentes objetivos RNAi o tratamientos, la parte formas de dirección bien del nombre de archivo. (B) El número del bastidor es parte del nombre de archivo . como cada pocillo se forma la imagen para recoger múltiples, no superposición de marcos (C) Las sondas fluorescentes de cada cuadro se crean imágenes de forma separada; en consecuencia, los nombres de archivo también deben reflejar qué canal cada imagen se refiere a. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. El uso de perfiles celular para medir el ADN nuclear y la tinción de anticuerpos Con la configuración en el archivo proporcionado tubería (3_channels_pipeline.cppipe), los valores de intensidad de las medidas de software de análisis de imágenes de fluorescencia Profiler célula de ADN nuclear y el anticuerpo vinculante relativo a las células individuales . (A) Los núcleos se identifican en la imagen del canal 'azul' de ADN manchado. (B) < / Strong> Las posiciones de los ADN manchado núcleos se llevan a cabo temporalmente en un 'Núcleos máscara'. La máscara núcleos se superpone entonces sobre (C) las imágenes azules y rojas de canal (ADN y de fluorescencia de anticuerpos de datos, respectivamente) y los valores de fluorescencia de segmentos de imagen que se superponen con la máscara se registran contra cada célula identificada. La identificación exitosa de núcleos vecinos, separados se puede evaluar visualmente en el aspecto de la máscara núcleos. A título de ejemplo, que se muestra con un círculo en esta imagen de la máscara, son ejemplos en los ajustes seleccionados para el algoritmo tienen erróneas identificadas núcleos vecinos como un solo núcleo. Ajuste de la configuración del algoritmo para minimizar se introduce en la sección de Discusión estos eventos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: El uso de Profiler célula para medir intensidades de GFP nucleares y citoplasmáticas El reportero GFP-etiquetados CDK2 se transloca entre el núcleo y el citoplasma en relación con la posición en el ciclo celular de las células.. Al mismo tiempo que la célula calcula los perfiles de ADN y anticuerpos intensidades nucleares por célula (Figura 4), sino que también calcula la relación entre núcleo y citoplasma de las intensidades de GFP para cada celda. (A) Los datos tinte de ADN para cada imagen se utiliza para generar una máscara de núcleos. Profiler (B) Cell utiliza los Núcleos máscara en conjunto la imagen de la GFP reportero GFP-CDK2 para sembrar la posición de cada célula con y luego se expande para el perímetro de cada celda para estimar toda la huella de cada célula. Esto se convierte en un nuevo, 'máscara de teléfono'. (C) La máscara de núcleos se resta de la máscara de la célula para producir una serie rosquilla de citoplasma esquemas, que se conviertenel 'Citoplasma máscara'. (D) La máscara y el citoplasma máscara núcleos son utilizados por Profiler célula para medir pares de valores GFP nucleares y citoplasmáticos. Estos valores apareados son utilizados por la célula Profiler para calcular los coeficientes, que informan sobre la posición de cada célula en el ciclo celular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. La extracción de datos - Procesamiento de datos celulares individuales primas mediante la imposición de puertas en los valores de ensayo tendencias biológicos de los datos de las celdas individuales para la tinción de anticuerpos y ensayos de reportero GFP-CDK2 se extraen mediante los datos cerrados. Los histogramas de los datos en bruto permiten la identificación de los valores adecuados de la puerta. Estos se impusieron con un script en Perl (A) El.producto final del análisis de los archivos de imagen con los ajustes previstos para Profiler célula son separados por comas valor (.csv). Estos archivos c ontain datos de la celda de particulares relativas a cada uno de los diferentes segmentos subcelulares. El archivo 'Nuclei.csv' contiene todas las medidas seleccionadas relacionadas con el uso de la máscara de núcleos. Estas mediciones incluyen la intensidad de anticuerpo nuclear, la intensidad de ADN nuclear y la relación de GFP (núcleo / citoplasma). (B) Histogramas de la intensidad de anticuerpo nuclear (izquierda) y las proporciones de reportero GFP-CDK2 (derecha) trazada a partir de los datos individuales de células para cada condición caída siRNA . Las barras de los histogramas que aparecen muestran las posiciones de puerta deseados para estos ensayos. Datos coloreados en los histogramas indican las subpoblaciones cerradas. (C) Las puertas de los dos ensayos ilustrados en B se aplican a los datos brutos, utilizando '2_gate_classifier.pl' el script de Perl. La secuencia de comandoscrea una copia modificada del archivo de salida Profiler célula original (Nuclei.csv) para asistir a la posterior trazado. Los dos valores de compuerta se registran en el nuevo archivo (resaltado en color aquí) y se añade una nueva columna 'Label'. La bandeja de etiquetas de cada célula en una de cuatro posibles subgrupos basados en los dos valores de ensayo cerrado para cada célula. Estas etiquetas se utilizan en parcelas posteriores que cuentan con los cálculos de las contribuciones de cada subpoblación, así como las referencias cruzadas de los parámetros adicionales que se generan en el Perfil de la célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. Gráficos de dispersión para cada condición siRNA que representa los datos en bruto para las células individuales y posiciones de la puerta Esparza parcelas de individatos de la celda doble de todas las imágenes de las condiciones siRNA indicaron: (A) siRB1; (B) control negativo sinon de metas; (C) siCDK6. Representan frente a los ejes Y son valores de fluorescencia nuclear de tinción RB1 anti-P-S780. Representada frente a los ejes X son los valores de las relaciones correspondientes calculados a partir del reportero GFP-CDK2. Las barras rojas y verdes indican las posiciones de las puertas de la puerta RB1 P-S780 y las puertas reportero GFP-CDK2, respectivamente. Las dos puertas se dividen las células en cuatro subpoblaciones y los números en los cuadrantes resultantes son el número ciento de las células de cada uno de estos. Anotaciones en torno a los ejes de A indican los cuatro posibles etiqueta-elementos aplicados a cada célula por el 2_gate_classifier.pl script de Perl. Estas etiquetas se muestran en relación con su respectiva puerta de ensayo y se utilizan en el R-script (analysis.r) para generar las parcelas en las Figuras 6, 7 y Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Teléfonos subpoblaciones definidas por los dos ensayos de tránsito G1 muestran perfiles de ADN 2N y 4N de acuerdo con el resultado del ensayo El gráfico de dispersión de los datos para las células siCDK6 se repite en la figura 7C.. Rodeando el gráfico de dispersión son histogramas de intensidad ADN nuclear integradas en relación con grupos de la población. Aquellos por encima de la nube de puntos se relacionan con el reportero de ensayo-GFP CDK2. Aquellos a la derecha del diagrama de dispersión se refieren a medidas de anticuerpos fosfo-RB1 nuclear por sí sola. Las líneas de puerta de color se extienden a mostrar su relación con los histogramas. Etiquetas de puertas por las cuales se seleccionaron los datos de la celda para estas parcelas adicionales también se muestran. Las células con pérdida de RB1 fosforilados en serina 780 (P-S780-) o aquellos con un alto reportero nuclear GFP-CDK2 al citoplasma (que indican una baja actividad de CDK2) muestran perfiles de ADN predominantemente 2N-como, mientras que sus contrapartes opuestas para cada ensayo respectivo mostrar una distribución de 2N y 4N, característica de una población de fase mixta, post-G1 de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Resumen parcelas de valores de ensayo cerrado para cada siRNA condición gráficos de datos Resumen de barrios cerrados (A) datos RB1 P-S780 y datos (B) GFP-CDK2 de pocillos por triplicado para cada condición siRNA desmontables.. Los valores se calculan a partir de la salida de la célula de perfiles en bruto (Nuclei.csv) utilizando laScripts de Perl, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) o 'G1assay_summary.pl' (B). Los valores representados son la media de las células por ciento dentro de la puerta se aplica a cada ensayo. Las barras indican los errores estándar calculados a partir de pocillos por triplicado. Valores no apareados, homoscedastic T-Test P para cada condición caída en comparación con los no-siRNA dirigidos se muestran por encima de los datos representados en la que P <0,001 (**) y P <0,05 (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1. Configuración de software Profiler celular para el análisis de imágenes. (A) Captura de pantalla de Profiler célula antes se introducen los ajustes de análisis de imagen. (B) Captura de pantalla de Profiler célula después de que se han cargado los datos de algoritmos contenidos en '3_channels_pipeline.cppipe'. El alto pestaña iluminado en la esquina superior izquierda indica que esta pantalla se muestran los parámetros para la etapa de 'LoadImages' del análisis. Al hacer clic en las otras partes de la lista de abajo esto revelará los detalles de los pasos siguientes en el análisis. (C) Captura de pantalla de Profiler célula con los detalles para la carpeta de entrada y salida de carpetas entró. (D) Captura de pantalla de Profiler célula después de la 'Analizar botón de imágenes 'se ha hecho click para comenzar el análisis. Superpuesto unas tres ventanas nuevas que ilustran las máscaras producidas algorítmicamente-generadas por el software de las imágenes analizadas. Estas ventanas se accede haciendo clic en los iconos de "ojo" a la posición abierta al lado de los pasos relevantes en el análisis, en la esquina superior izquierda de la ventana principal de Profiler célula. Estas visitas ayudan al usuario verificar si los ajustes que generan las máscaras de color confeti están de acuerdo con los datos de escala de grises,, originales adjuntos.
ent "> Figura S2. El uso de Perl y RStudio a puerta datos de la celda individual y trazar las subpoblaciones de células resultantes. (A) El panel derecho muestra la carpeta elegida para recibir los archivos de la salida .csv (iconos verdes) a partir del análisis de perfiles de la célula. Los scripts de Perl se proporcionan con el manuscrito (iconos azules) se copian en esta carpeta. destacado es el script de Perl 2_gate_classifier.pl ', que ha sido hecho doble clic con el ratón para producir el cuadro de diálogo en el panel de la izquierda. Se muestran la indicaciones y correspondientes escrito respuestas necesarias a la puerta de los datos individuales de células desde el archivo 'Nuclei.csv'. (B) Captura de pantalla de RStudio inmediatamente después de cargar el script 'analysis.R'. Se destacan los comandos para cargar los datos cerrados de A en el software antes de trazado (detalles de la nota en las líneas 5 y 6 tendrá que ser ajustado de acuerdo a donde se encuentran los datos cerrada en la computaciónr utilizada para el análisis). (C) Captura de pantalla de RStudio vez que los datos se ha cargado. (D) Captura de pantalla de RStudio muestra resaltado el bloque de código necesario para producir la gráfica se muestra en la ventana inferior derecha. Los códigos para cada parcela están separados por líneas en blanco y se agrupan por tipo de trama.| objetivo siRNA | Direcciones y Placa |
| No focalización (NT) | E5, F5, G5 |
| El retinoblastoma (RB) | E7, F7, G7 |
| Quinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6) | B2, C2, D2 |
Tabla 1: Las direcciones de pozos y las correspondientes condiciones siRNA utilizados en el ejemplo de datos establecidos.
Los autores no tienen nada que revelar
Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.
Este trabajo fue apoyado por becas CRUK 15.043 y 14.251 CRUK.
Damos las gracias a Daniel Wetterskog y Ka Kei Ho para la asistencia técnica y la lectura crítica del manuscrito.
| AllStars siRNA de control negativo | Qiagen 1027280 | siRNA de control negativo. | |
| CDK6 siRNA | Dharmacon/ Síntesis personalizada | NA | Secuencia antisentido: 5' CUCUAGGCCAGUUCUUCUU |
| RB1 siRNA | Dharmacon/ Síntesis personalizada | NA | Secuencia antisentido: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
| 5x tampón siRNA | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | Para diluir con agua tratada sin nucleasas, sin DEPC. |
| Agua sin interrupciones (no DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | Para la dilución de tampón siRNA. |
| Lípido de transfección | Hiperfect | Qiagen | 301705 | .
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | medios de cultivo de tejidos suplementados con piruvato y alto contenido de glucosa. |
| Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Falcon | 3072 | Plain, placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la mezcla paralela y compartimentada de complejos de transfección. |
| Placa Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS 6005182 | placa TC de 96 pocillos con base óptica en la que se transfectan, crecen, fijan y finalmente se obtienen imágenes de las células. Se suministra con sellos de placa adhesivos opacos, que se utilizan durante el almacenamiento de placas usadas. | |
| Membrana transpirable | Alpha Labs | LW2783 | Membrana adhesiva estéril y permeable al gas. |
| Formalina tamponada neutra, fijador de 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% de formalina (4% formaldehído) utilizado solo en el protocolo. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Detergente |
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| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hidroximetil)aminometano) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Para solución de lavado de placas. |
| Anticuerpo anti-P-S780 RB1 | Abcam | ab32513 | Monoclonal de conejo |
| AlexaFluor647 | Antivitrogen | anti-conejo A21245 | Anticuerpo secundario altamente adsorbido y marcado con fluorescencia. |
| Hoechst 33342 (Bisbenzimida) | Sigma-Aldrich | B2261 | Colorante fluorescente, intercalante de cromatina, ADN. |
| Solución de permeabilización | NA | NA | 0,1% Triton X-100 en solución salina tamponada con Tris de 50 mM, pH 8,0. |
| Solución de lavado de placas | NA | NA | Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20. |
| Solución en bloque | NA | NA 5 | % de leche en polvo en solución salina tamponada Tris y 0,1% Tween-20. Para bloquear la placa antes de la inmunotinción y la dilución de anticuerpos. |
| Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
| Active Perl Edición de la comunidad | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
| R Entorno de programación | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
| Rstudio Rstudio | http://www.rstudio.com/ | ||
