Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Summary

Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.

Abstract

Los avances en la comprensión de los mecanismos de control que rigen el comportamiento de las células en modelos de cultivo de tejidos de mamíferos adherentes son cada vez más dependiente de los modos de análisis de una sola célula. Métodos que entregan datos compuestos que reflejan los valores medios de los biomarcadores de las poblaciones de células se arriesgan a perder la dinámica de subpoblación que reflejan la heterogeneidad del sistema biológico estudiado. De acuerdo con esto, los enfoques tradicionales están siendo sustituidos por, o compatibles con formas más sofisticadas de ensayo celular desarrolladas para permitir la evaluación por microscopía de alto contenido. Estos ensayos potencialmente generan un gran número de imágenes de biomarcadores fluorescentes, lo que permitió al acompañar a los paquetes de software propietario, permite mediciones multi-paramétricas por célula. Sin embargo, los costos de capital relativamente altos y el exceso de especialización de muchos de estos dispositivos han impedido su acceso a muchos investigadores.

Descrito aquí es unaflujo de trabajo de aplicación universal para la cuantificación de múltiples intensidades marcador fluorescente de regiones subcelulares específicos de células individuales adecuados para su uso con imágenes de la mayoría de los microscopios de fluorescencia. La clave de este flujo de trabajo es la implementación del software Profiler célula libre disposición ¹ para distinguir las células individuales en estas imágenes, segmento que en regiones definidas subcelulares y entregar intensidad marcador fluorescente valores específicos a estas regiones. La extracción de valores de intensidad de células individuales a partir de los datos de imagen es el propósito central de este flujo de trabajo y se ilustrará con el análisis de los datos de control de una pantalla de siRNA para los reguladores de punto de control G1 en células humanas adherentes. Sin embargo, el flujo de trabajo que aquí se presenta se puede aplicar al análisis de datos procedentes de otros medios de perturbación celular (por ejemplo, pantallas de compuestos) y otras formas de fluorescencia basada en marcadores celulares y por lo tanto deben ser útiles para una amplia gama de laboratorios.

Introduction

El trabajo presentado aquí describe el uso de la Profiler software Cell libremente disponible para realizar desglose algoritmo de guiado de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células adherentes para identificar las células individuales y regiones subcelulares definidos. Este enfoque, conocido como segmentación de la imagen, permite el análisis multi-paramétrico posterior de las células fotografiadas mediante la cuantificación de los marcadores marcados con fluorescencia localizadas a cada célula o región subcelular (denominado como objetos segmentados). Este flujo de trabajo es la base para permitir el análisis de alto contenido y está destinado a servir como una herramienta que pueda desarrollarse y modificarse para adaptarse a multiparamétrica, célula individual analiza en laboratorios que no tienen acceso a los instrumentos de alto contenido especializado o software propietario. Los archivos suministrados con este manuscrito se compone de un conjunto de pruebas de datos de imágenes en bruto pertinentes, configuración del algoritmo y scripts de apoyo para generar el análisis descrito. La configuración del algoritmo proporcionado fo Profiler célula están optimizados para el conjunto de datos de ejemplo y los detalles de la sección Discusión qué puede ser necesario ajustar para permitir el uso de datos de imágenes de otros estudios.

Una vez que los datos cuantitativos se ha extraído usando el Perfil de la célula, los diferentes laboratorios pueden tener diferentes requisitos para el uso de la información presentada por los valores de las celdas individuales en los datos en bruto; Aquí se muestra un método por el cual las puertas se aplican a los datos en bruto para cada ensayo. El uso de estas puertas, los datos se transforman en términos binarios de respuesta, permitiendo la visualización de las tendencias enlazan diferentes tratamientos con las subpoblaciones de células que experimentan respuesta definido por las puertas. Las puertas se establecen basándose en observaciones de las distribuciones de datos obtenidos para controles positivos y negativos apropiados para cada medición relevante. El uso de puertas es sólo un ejemplo de cómo manejar las mediciones primas, basadas en células. También se muestra aquí es el uso de la intensidad del ADN nuclear míasurements en su forma cruda como un rango continuo de valores, en combinación con los datos cerrados. Se deben considerar otros enfoques para la gestión de datos de análisis de imagen, dependiendo de la naturaleza del estudio; alternativas estadísticas al uso de puertas para la asignación de las células a las subpoblaciones se han reportado ² y sistemáticas las comparaciones de estrategias para resumir los datos de alto contenido a través de un gran número de parámetros se han reportado ^3.

Análisis de alto contenido de datos de imagen han encontrado uso en estudios celulares de droga-respuesta, revertir la genética y el estrés ambiental señalización ^4-6. El mérito de análisis de alto contenido deriva del hecho de que el análisis algorítmico de datos de microscopía de fluorescencia permite que los parámetros cuantitativos y espaciales que deben considerarse simultáneamente a través de las células individuales ^7. De esta manera, los resultados celulares para múltiples ensayos pueden ser un comportamiento referencia cruzada, diferencial de ensayo-dsubpoblaciones de células efined pueden ser rastreados en condiciones experimentales y ensayos pueden incluir la consideración de las variables morfológicas. La estrategias y análisis de flujo de trabajo discutido aquí, como para otros enfoques de alto contenido, son capaces de entregar datos multiplexados que son referencias cruzadas a las células individuales. Estudios de alto contenido de métodos traje que generan imágenes de microscopio fluorescente y que son aplicables al análisis de los datos que van desde decenas de imágenes producidas en microscopía basada en fluorescencia convencional de bajo rendimiento a través de las miles de imágenes producidas utilizando plataformas de alto contenido de detección automáticos.

El flujo de trabajo se ilustra aquí con datos de ejemplo de la cual ensayos separados se miden en términos de cualquiera de las intensidades de marcadores fluorescentes nucleares o translocación citoplasmática / nuclear de una proteína fluorescente reportero, respectivamente. El flujo de trabajo es flexible en que estos ensayos se pueden considerar por separado o en combinación dependiendo de EACh dada pregunta de investigación por diferentes investigadores. Los datos de ejemplo se producen como parte de un ARN de interferencia (RNAi) experimento (Figura 1). Oligonucleótidos pequeños ARN de interferencia (siRNA) se utilizan para desmontables proteínas específicas en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 que resultan en cambios para dos reporteros fluorescentes de quinasa (CDK) la actividad dependiente de ciclina. La fosforilación CDK6 dependiente de la proteína retinoblastoma nuclear en la serina 780 (P-S780 RB1) se evaluó mediante tinción de anticuerpos. En las mismas células, un reportero de la proteína verde fluorescente marcada de la actividad CDK2 (reportero GFP-CDK2) es evaluada por su relación núcleoicitoplasma donde en ausencia de la actividad de CDK2 el periodista reside en el núcleo y en lanzaderas de activación CDK2 en el citoplasma ^8. Además, el ADN nuclear de cada célula se tiñe usando un colorante intercalante de ADN, bisbenzimide, que sirve como un medio para identificar las células y definir las fronteras núcleos en las imágenes así unasa medida de la abundancia de ADN proporcionar información sobre la posición del ciclo celular de la célula (Figura 2).

Las actividades de CDK2 y CDK6 son detectables como células de tránsito de G1 a la fase S del ciclo celular ⁵ y suceden unos a otros ^9,10 y, como tal, se espera que cerca de concordancia entre los dos reporteros en células individuales. El conjunto de datos de demostración utilizado aquí como un ejemplo analiza el efecto de siRNA dirigido a CDK6, la proteína retinoblastoma (RB1) y un control negativo no dirigido (Tabla 1). Desmontables de CDK6 debe obtener tanto una disminución de la RB1 epítopo P-S780 y una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular. La caída RB1 sirve como control reactivo para la especificidad del anticuerpo fosfo-S780. Imágenes de microscopio de fluorescencia de formalina fijos ^11, las células de cultivo de tejidos teñidos con fluorescencia HCT116 se utilizan para análisis de imagen algorítmica. Los datos numéricos resultante se utiliza entonces parareferencias cruzadas a los reporteros y medir el impacto de los diferentes estados de derribo.

El tamaño potencial de los datos producidos por este tipo de análisis puede presentar un desafío para las herramientas de análisis normales. Por ejemplo, los datos de las celdas individuales pueden ser mayores que un cierto software de hoja de cálculo tendrá en cuenta. Incluido son scripts de Perl que realizan el procesamiento simple, altamente repetitivo, supervisado de los datos para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos. Los scripts de Perl están escritos específicamente para los archivos de salida producidos por la célula de perfiles, al procesar archivos de imagen con una denominación de archivos específico (Figura 3), y permiten un número variable de campos por pocillo para ser utilizados en el análisis. Con frecuencia es importante a los datos de ensayo de célula individual puerta para rastrear las tendencias en las subpoblaciones de células ⁵ y se muestra aquí es el uso de un script Perl para marcar cada célula sobre la base de una puerta conjunto predeterminado para cada tipo de ensayo. También se incluyen los scripts de Perl opcionalesque resumen los resultados de datos para los pozos individuales (o condiciones), la entrega de: porcentaje de células dentro de la puerta de conjunto y los valores medios de las puntuaciones de ensayo primas. La forma última, más homogénea de la visualización de los datos, es válido que las respuestas afectan a la totalidad o la mayoría de las células dentro de un pozo. Como se discutió anteriormente, dicha evaluación es menos útil que la proporcionada por el gating datos célula individual donde la respuesta se limita a un subconjunto de células dentro de una población.

La utilidad del flujo de trabajo descrito no se limita a la perturbación por siRNA o los ensayos de marcadores descritos. Los estudios han usado este enfoque para ensayar respuestas en experimentos de cultivo de tejidos que utilizan combinaciones de siRNA, inhibidores químicos y tratamiento de radiación y para la evaluación de marcadores distintos de la actividad de CDK2 y CDK6 ^5.

Conceptualmente, la estrategia experimental permite una variedad de regiones subcelulares biológicamente útiles que se registra automáticamenteen las células individuales presentes en las imágenes de microscopio de fluorescencia. Como tal, este enfoque puede dar datos multiplexados revelar información cuantitativa, biológicos que pueden ser ignorados a través de técnicas que se centran en las poblaciones en lugar de las células individuales. Con modificaciones menores, el enfoque y el análisis de flujo de trabajo descrito se puede producir, datos celulares individuales cuantitativos para las salidas de ensayo basado en fluorescencia y respuestas de células biológica, donde la evaluación cuantitativa del contenido de ADN, la cuantificación de la fluorescencia nuclear o citoplásmica o la shuttling de los marcadores entre estos dos compartimentos ya sea individualmente o en forma multiplexada es de interés. Como requisitos de publicación tienden cada vez más a la presentación de los datos en bruto en acceso abierto, el acceso y la familiaridad con herramientas libres para el análisis de imágenes de microscopía, como los descritos aquí también será de interés directo para los laboratorios que buscan volver a analizar los datos publicados.

Protocol

1. Experimental Perturbación y Etiquetado celular para marcadores de respuesta (Reversa transfección siRNA pantalla)

1. En una pipeta campana de cultivo de tejido estéril 70 l de 200 nM siRNA en tampón 1x siRNA en pocillos de una placa estéril, llano de 96 pocillos. Diluir lípidos transfección en 40 volúmenes de medio DMEM libre de suero y dispensar 105 l en cada pocillo que contiene siRNA.
   NOTA: La dilución de 262,5 l lipídico en 10.5 ml de suero libre de DMEM produce una mezcla maestra adecuado para un plato entero de 96 pocillos de siRNA, la entrega de 2,6 l de lípidos por pocillo. El uso de 200 nM siRNA concentración de partida en este paso entregará una concentración de trabajo de 20 nM en el paso 1.3, pero los procedimientos de trabajo para las concentraciones de trabajo hasta 5 nM, con la concentración de partida ajustado en consecuencia (es decir, 50 nM). Baja concentración de trabajo puede reducir las puntuaciones positivas falsas fuera de objetivo, aunque pueden reducir la magnitud de la respuesta en el blanco, lo que lleva al aumento de la sobre-Target tasas de falsos negativos.
2. Mezclar la placa por la vibración suave durante diez minutos a temperatura ambiente. La división de las 175 l resultantes en tres 50 l réplicas por objetivo en una, cultivo de tejidos opacos tratada, placa de 96 pocillos con una base transparente.
3. Transfectar inversa mediante la supresión de 8.000 células por pocillo en 150 l DMEM que contiene 10% de suero directamente sobre los complejos lípido-siRNA 50 l. Células colorrectales humanos Uso HCT116 que expresan establemente un marcador BPA de etiquetado informar la actividad de CDK2 ^5,8. No es necesaria una mezcla adicional. Sellar la placa con un adhesivo membrana transpirable estéril para controlar la humedad y evitar 'borde efectos' de placa y colocar la placa en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 48 horas.
4. Aspirar los medios de comunicación de tal manera que una pequeña cantidad residual de los medios de comunicación permanece en los pocillos. Fijar las células mediante la adición de 100 l de formaldehído al 4% tamponado a cada pocillo e incubar en una campana de humos durante 10 min en la sala de temperature.
5. Retire la solución de fijación aspirando la placa. En este punto, bien interrumpir el experimento mediante el lavado de la placa tres veces con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego Almacenar sellada, menos de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana, o continuar con la la permeabilización de las células.
   NOTA: Recomendamos placas de procesamiento tan pronto como sea posible después de la fijación, y por lo general prefieren el almacenamiento de placas totalmente elaborados. Conservantes biocidas tales como timerosal, azida de sodio, o alternativas comerciales se pueden añadir para prevenir el crecimiento micoroganismal. La adición de inhibidores de la fosfatasa ayuda a preservar fosfo-epítopos, y otros medios para preservar los estados de modificación de proteínas puede ser útil en contextos de ensayo pertinentes
6. Retirar PBS de la placa y permeabilizar las células mediante la adición de 100 l de solución de permeabilización. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Aspirar la solución de permeabilización utilizando un Multichpipeta annel. Repita este paso tres veces.
7. Bloquear las células mediante la adición de solución de bloque de 100 l por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar la solución de bloqueo mediante la aspiración de la placa, a continuación, la sonda con 50 l de anticuerpo contra RB1 P-S780 diluido 500 veces en la solución de bloque durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
8. Lavar la placa tres veces con solución de lavado placa de 100 l, dejando la solución en la placa durante 5 min cada vez. Sonda de la placa durante la noche en la oscuridad a 4 ° C con 50 l fluorescentemente marcada con anticuerpo secundario diluido 1000 veces en solución de bloqueo suplementado con 2 mM del colorante de ADN específico de la cromatina bisbenzimide. Lavar la placa tres veces antes y tienda de sellado, por debajo de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C. Imagen de la placa dentro de dos semanas.

2. Imágenes y segmentación de imágenes

1. Utilice un microscopio confocal o girando el disco de fluorescencia con un objetivo 20X tomar separado 16-bit, imágenes TIFF en escala de grises en tres canales correspondientes a la tintura de ADN, las buenas prácticas agrarias y fluoróforos inmuno-tinción. Capture muchos conjuntos de imágenes que no se superponen, a que se refiere aquí como marcos, a imagen de aproximadamente 1.000-2.000 células por pocillo.
2. Nombre de los archivos de imagen de forma sistemática para que cada nombre de archivo es una combinación única de 'nombre del experimento "," dirección bien', 'número de cuadro' y 'identificador de canal', en este orden (Figura 3). El conjunto de datos de ejemplo utiliza (tinción cromatina ADN) o "verde" (GFP) o "Red" (fluoróforo inmuno-manchado) como identificadores de canal "Blue". La dirección también, número de bastidor y el canal identificador están más adelante referido como los metadatos de la imagen. Utilice el símbolo de subrayado que no induzca bien y el marco de metadatos.
3. Nombre de los archivos con estos elementos de metadatos en el orden especificado. Esto es necesario para asegurar que los pasos de software posteriores Correagrupar conjuntos ctly de imágenes para el análisis.
4. Descargue e instale el software gratuito de la célula de perfiles, Active Perl Community Edition, entorno de programación estadística R y RStudio. Aceptar todas las opciones por defecto durante la instalación; Los usuarios de PC instalar Active Perl deberían permitir a todas las opciones relacionadas con PATH, asociación extensión de archivo y el mapeado de scripts donde se le indique. Activo Perl es opcional para los usuarios de Mac, pero de lo contrario tendrá que ejecutar el script de Perl en el paso 3.2 de la línea de comandos de terminal en lugar de utilizar el icono de clic.
5. Abra el software Profiler célula, haga clic en "Archivo", "Importar Pipeline" entonces "Desde archivo" y seleccione el archivo 3_channels_pipeline.cppipe (Figuras S1A y S1B). El archivo contiene las instrucciones necesarias para el software de interpretar metadatos de imágenes de archivo en la convención de nombre de archivo se describe. Profiler célula ahora relaciona las imágenes, extractos de ADN nuclear y las intensidades de anticuerpos del XXESE y utiliza el canal de las buenas prácticas agrarias para calcular la relación de la energía nuclear frente a la intensidad citoplasma de cada célula detectados (Figuras 4 y 5).
6. Haga clic en el botón "Ver los ajustes de salida" en la esquina inferior izquierda de la ventana de perfiles Cell. En la parte superior de la nueva pantalla son cuadros de texto etiquetados 'carpeta predeterminada de entrada "y" Carpeta de salida por defecto'. Uno a la vez, haga clic en la carpeta iconos a la derecha de estas cajas y seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos, respectivamente (Figura S1C).
7. Comienza el análisis de la imagen pulsando el botón "Analizar las imágenes 'en la esquina inferior izquierda de Profiler célula. En la parte inferior de la pantalla observar el tiempo restante para la extracción de datos, el 'Análisis Stop' y los botones de "pausa". Si es necesario hacer una pausa en el análisis seleccionando el botón 'Pause' en cualquier momento, lo cual es útilal ver las imágenes que se analiza (descrito en el paso 2.8).
8. Opcionalmente, abra las ventanas para cualquiera de las etapas de análisis de imagen haciendo clic en los iconos de ojo en el panel de la extrema izquierda de la ventana del programa (Figura S1D). Observe la ventana 'IdentifyPrimaryObjects' y los de 'secundarias' y 'Objetos Terciario' para comprobar que la configuración actual en el Perfil de la célula para realizar la segmentación de imágenes son adecuadas (ver Figura 1 y Discusión para el asesoramiento sobre la modificación de estos parámetros).
9. Haga clic en "Aceptar" en el cuadro de mensaje que aparece cuando se completa el análisis. Ir a 'Default Carpeta de salida "el lugar donde todos los archivos de datos con los resultados se guardan como separada por comas de valores (.csv) (Figura S2A).

3. Extracción de datos

1. Encuentra el nuevo archivo 'Nuclei.csv', que se incluye entre lossalida del Profiler Cell. Este archivo contiene datos de las celdas individuales de intensidad anticuerpo nuclear fluorescente, la intensidad de ADN nuclear y valores de la relación periodista-GFP CDK2 (Figuras 6A y S2A).
   NOTA: Diferentes laboratorios querrán procesar este tipo de datos para adaptarse a la naturaleza de sus propios ensayos. Sugerido para el de datos actual es el gating de las células de cada condición de tratamiento de acuerdo con los datos de anticuerpos y los valores reportero GFP-CDK2 utilizando el script Perl proporcionado '2_gate_classifier.pl'.
2. Copie el archivo de script de Perl proporcionado '2_gate_classifier.pl' en la misma carpeta que el archivo de datos 'Nuclei.csv' (Figura S2A). Haga doble clic en el icono para el script de Perl y, cuando se le solicite, escriba el nombre completo del archivo de datos seguido por un '.csv' nombre nombre para el archivo en el que las células han de ser cerrada y finalmente los valores de compuerta para el anticuerpofluorescencia y datos reportero GFP-CDK2.
   NOTA: Cómo determinar principalmente ajustes de la compuerta y aplicarlos para el análisis de los datos se analizan a continuación en la sección Datos Representante y la Figura 6 (para analizar los datos proporcionado uso '0.004' y '1.5', respectivamente). Los usuarios de Mac deben ejecutar el script de Perl desde la línea de comandos de terminal escribiendo: 'perl 2_gate_classifier.pl'.
3. Observe el archivo recién creado que combina los valores de ensayo de células individuales primas partir de los datos del analizador Cell originales con etiquetas sub-población que muestran cómo cada célula de cada pocillo realiza contra dos puertas (Figura 6C).
4. Grafica los datos para cada condición experimental usando las etiquetas de subpoblación de células individuales mediante la apertura del software RStudio. Haga clic en "Archivo" y "Abrir archivo", a continuación, seleccione el archivo 'analysis.r »prevista. Observe los comandos para trazar figuras 6B, 7 y 8 en la ventana superior izquierda de RStudio (Figura S2 B). En la ventana superior izquierda, entre los símbolos de comillas dobles en las líneas 5 y 6, escriba la dirección del equipo de la carpeta que contiene los datos cerrados. Incluya la letra de unidad y el nombre del archivo en sí, respectivamente (por ejemplo, "C: / carpeta / análisis de los resultados del análisis" y "nuclei_gated.csv").
   NOTA: Si RStudio se utiliza por primera vez en un equipo determinado, necesitará el paquete de gráficos R 'ggplot2' para instalarse primero. Esto es una vez único paso para una nueva instalación de RStudio, después de que este paso se vuelve redundante. Para instalar 'ggplot2', haga clic en la pestaña llamada "paquetes" por encima de la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio, haga clic en el botón 'Instalar paquetes' que aparece debajo de esta. Aparecerá una nueva ventana. Tipo 'ggplot2' (citas omitiendo) en el 'paquetes' sritmo en esta nueva ventana y, finalmente, haga clic en el botón "Instalar" para cerrar la ventana, instale las funciones ggplot2 necesarias y volver a la ventana principal RStudio para continuar desde el paso 3.6.
5. Resaltar líneas 1 a la 17 en la ventana superior izquierda de RStudio, a continuación, haga clic en el botón "Ejecutar". Se ingresa los datos experimentales, los valores de umbral y detalles de la ubicación así a R (Figura S2C). R ahora mantener temporalmente los datos relevantes para el trazado.
6. Resaltar bloques individuales del código restante debajo de la línea 17 y crear las parcelas correspondientes haciendo clic en el botón "Ejecutar" como antes. Observar las parcelas en la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio y guardar varios formatos haciendo clic en el botón "Exportar" (Figura S2D).
7. Mientras se cierra RStudio, haga clic en 'No guardar "cuando se le solicite. Esto evita confusión en el siguiente uso del RStudio, que de otro modo celebrará datosde la sesión anterior.

Results

El ejemplo de las imágenes generadas por el uso de la reversa de la transfección siRNA protocolo de cribado han sido preparados y analizados utilizando el software Profiler célula. Los datos en bruto numérica resultante es tal que cada célula está representado individualmente, trazable de nuevo a su imagen y así de origen y se midió para varios parámetros de intensidad de fluorescencia (Figura 6A). Para cada célula identificada la intensidad media de fluorescencia nuclear para el anticuerpo RB1 P-S780 y la intensidad de ADN integrado para las máscaras nucleares tinte definido de ADN se determinan. La media de los valores de intensidad GFP para núcleo y el citoplasma regiones de cada célula también se registran permitiendo el cálculo de la energía nuclear frente a la fluorescencia citoplasmática del reportero GFP-CDK2. Aguas abajo de estos fluorescencia algorítmica mediciones de la intensidad se hace uso de estos datos celulares individuales para definir puertas para dos ensayos, la tinción de anticuerpos nuclear y reportero GFP-CDK2. Anotación posterior de las células en el the base del resultado de ensayo y el uso de estas etiquetas para permitir subpoblaciones específicas que se caracteriza además por una tercera medición (contenido de ADN nuclear) se describe.

Parcelas histograma de los datos de intensidad de fluorescencia en bruto recogidos para cada ensayo son una manera eficaz de evaluar cómo se comportan las subpoblaciones de células en diferentes condiciones. Los histogramas en la Figura 6B muestran las distribuciones de la población de los datos individuales de células de pocillos por triplicado para cada condición caída RNAi. A la izquierda están los datos de intensidad anticuerpo nuclear y de la derecha están los datos correspondientes para el reportero GFP-CDK2. Los datos de anticuerpo RB1 P-S780 revela que existen en términos generales las células en dos poblaciones con respecto a esta modificación post-traduccional y que las poblaciones de células con pérdida de RB1 fosforilados en S780 se pueden distinguir como un pico de la izquierda de la intensidad nuclear que se enriquece cuando CDK6 es derribado por siRNA. Este mismo pico de la izquierdase ve cuando RB1 en sí es el objetivo RNAi, lo que refleja la eliminación directa de la proteína y por lo tanto la tinción RB1 P-S780. En contraste, las mismas condiciones experimentales para las mismas células, cuando se observa a través de el ensayo reportero GFP-CDK2, muestran una dinámica diferente en los datos de celda individuales. Se observa una distribución continua, con sólo un único pico, pero siRNA que perturba el ciclo celular (siCDK6) y provoca la acumulación en los resultados de la fase G1 en una extensión del hombro de la mano derecha de esa distribución (es decir, lo que indica una mayor presencia de células que muestran una aumento en la relación GFP nuclear / citoplasma, trazada en el eje X).

También se muestran en los histogramas de la Figura 6B son los valores de compuerta (barras verticales) que se eligen sobre la base de las distribuciones de ambos conjuntos de datos de ensayo. La norma que se utiliza para los datos de anticuerpos RB1 P-S780 es definir la posición de la puerta como el medio-height: posición de anchura máxima en el hombro izquierdo de la principal(Derecha) de pico cuando se consideran los datos de la celda de control negativo (no la orientación siRNA). Datos destacó rojo son células con reducida y ausente RB1 P-S780, que se identifican con esta puerta. Una puerta similares posicionado sobre el hombro opuesto de la distribución de valor de la relación se utiliza para el reportero GFP-CDK2. Las células de la subpoblación de alta relación resultante, que carecen de función o reducción de la actividad CDK2, se muestran en verde. Para ilustrar el análisis de multiplexado de los dos ensayos de la figura 6C muestra la implementación de ambos valores puerta utilizando el script de perl 2_gate_classifier.pl para convertir los datos en bruto (Figura 6A) en el archivo de anotaciones de abajo. Este nuevo archivo incluye los datos originales, junto con una nueva columna de etiquetas de clase para cada celda y los dos valores de compuerta utilizados para distinguir ellos (en este caso las puertas de 0,004 para los datos de anticuerpos y 1,5 para el reportero GFP-CDK2 se utilizaron, respectivamente) .

Después de haber clasificado las células individuales From cada condición de caída sobre la base de los dos ensayos, ahora es posible utilizar estas etiquetas de clase para ayudar a la anotación de las parcelas de los datos de ensayo. La Figura 7 muestra gráficos de dispersión de los datos de células individuales para la P-S780 RB1 y GFP- ensayos de CDK2 de los datos de ejemplo establecidos para las tres condiciones de ARNi. Anotando el número de cuadrantes en los diagramas de dispersión muestran los porcentajes relativos de cada subpoblación cerrada a la totalidad de ese contexto desmontables y se generan en R usando las etiquetas de clase descritos anteriormente. Estas parcelas revelan que, en comparación con las células transfectadas con la orientación no-siRNA (Figura 7B), las células transfectadas con siCDK6 revela una distribución de red de datos desplazado tanto hacia abajo sobre el eje Y (indicando ausencia de fosforilación en la serina 780 RB1) y hacia la derecha en el eje X (indicando baja actividad de CDK2, Figura 7C). Ambos de estos cambios se espera que para el derribo de este objetivo. En contraste con esto, los datos de SirCélulas B1 transfectadas (Figura 7A) muestran una pérdida de la tinción de anticuerpos de acuerdo con la pérdida del epítopo, pero poco efecto en la distribución de datos para el reportero CDK2 en comparación con los controles no transfectadas con siRNA de metas, sugiere que no hay gran efecto sobre el GFP reportero -CDK2 surge de caída RB1.

Para profundizar en la utilización de datos célula individual, clasificación subpoblación y ensayo de multiplexación Figura 8 muestra el diagrama de dispersión para los datos siCDK6 de perfiles histograma Figura 7C junto emparejados para la intensidad del ADN integrado. Los pares de histogramas se refieren a mitades opuestas de toda la población, divididos sobre la base de cualquiera de intensidad de anticuerpos (derecha del diagrama de dispersión) o valores de la relación reportero GFP-CDK2 (por encima de la nube de puntos). La cuantificación de la intensidad de ADN nuclear de estas poblaciones muestra dos picos característicos de 2N y 4N contenido de ADN como picos izquierdo y derecho, respectivamente. El intentions de las puertas que se muestran en las Figuras 6, 7 y 8 son tales que las células identificadas como baja para P-S780 RB1 (con la etiqueta: P-S780-) o con un alto valor de relación de la reportero GFP-CDK2 (etiquetados: G1) se estar en fase G1 del ciclo celular. De hecho, los histogramas perfil de ADN para las subpoblaciones identificadas con cualquiera de estos ensayos contienen predominantemente células con contenido de ADN 2N. Los perfiles de ADN de la población opuesta cerrada (etiquetados: P-S780 + o no-G1) contiene células con distribuciones que van desde 2N a 4N, de acuerdo con tales células adopción de una gama de posiciones de fase del ciclo celular post-G1.

Aunque el enfoque aquí ha sido la generación y análisis de datos a partir de imágenes de células individuales teñidas fluorescentemente, también es útil ser capaz de tomar estos datos y resumir cada ensayo sobre una base bien por pozo para controlar la variabilidad entre repeticiones y el desempeño de todos los pocillos para un ensayo dado a través de un plato entero de datos. A) los datos RB1 P-S780 y B) los datos reportero GFP-CDK2. Los valores representados en A y B se producen por dos scripts de Perl adicionales proporcionados con este manuscrito; 'Antibody_fluorescence_summary.pl' y 'G1assay_summary.pl', respectivamente. Estos scripts utilizan los datos en bruto creados por Profiler celular (Nuclei.csv) y los datos del informe por así como i) las células totales medidos por pozo, ii) el número de células dentro de la puerta, iii) porcentaje de células dentro de la puerta y iv) la aritmética media de las medidas, los datos en bruto para que así. Se incluye como una opción adecuada para buscar a través de grandes conjuntos de datos de ensayo, antes de centrarse en los datos individuales de tratamiento utilizando la evaluación multiplexado de datos celulares individuales como se ilustra en 8. Los gráficos muestran aquí parcela 'iii) porcentaje de células dentro de la puerta' para ambos ensayos, que se adapten a las distribuciones de datos no normales visto en los datos P-S780 RB1 y GFP-CDK2 en los histogramas en la Figura 6B. Estos scripts también calculan 'iv) la media aritmética de las medidas, los datos en bruto para que así', que se adapten a un análisis de los datos de respuesta de las poblaciones homogéneas y distribución normal de los datos antes y después de la perturbación experimental.

Figura 1:. Visión general de los pasos en el flujo de trabajo para analizar cuantitativamente los datos de imágenes de microscopio marcados con fluorescencia El flujo de trabajo es representado aquí como cuatro pasos (A) En primer lugar, es necesario preparar experimentalmente células para imágenes fluorescentes.. El ejemplo descrito aquí es la de unapantalla en la que las células tumorales humanas adherentes siRNA tratados se cultivan durante 48 horas, se fijaron y se tiñeron en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Diferentes condiciones de ARNi están presentes por triplicado en pocillos separados dentro de la placa. Las células se tiñeron con un tinte de ADN, un anticuerpo específico para RB1 fosforilada en la CDK4 y 6 selectiva sitio diana Serina-780 (P-S780 RB1) y también expresan de manera estable un GFP-CDK2-reportero, información salida del ciclo celular G1. En conjunto, estas sondas fluorescentes constituyen dos ensayos evaluaron por separado dentro del flujo de trabajo. (B) imágenes de microscopio en paralelo para cada sonda fluorescente (canal) se generan y se nombran como para incluir los detalles por los que el software de análisis de imágenes puede organizar los datos. (C) El archivos de imágenes se cargan en el software Profiler célula, que identifica algorítmicamente células individuales y los pares asociados de los núcleos y citoplasma antes de ceder mediciones de la intensidad de las tres sondas fluorescentes detectaned en cada uno. (D) Por último, un script de Perl se utiliza para organizar los datos cuantitativos primas producidas. Este paso se aplica puertas a los datos de intensidad de fluorescencia para cada celda, se va a agrupar eficazmente las células en subpoblaciones, que se pueden representar, seguimiento y repreguntas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Los datos experimentales que se obtiene por análisis de imagen, Las células marcadas con fluorescencia, tratados con siRNA fijos partir de los datos set de ejemplo fueron imágenes y mediciones de la intensidad correspondiente, considerados por célula.. Datos de imagen representativos se muestran para cada parámetro registrado durante el análisis de la imagen de intensidad ADN nuclear (A):. La intensidad de la tinción de tinte de ADN nuclear se utiliza para producir una medida de ADN por núcleo (B) Intensidad Nuclear de fosfo-RB1:. inmuno-tinción específica para P-S780 RB1 utilizando un (negro) anticuerpo primario y marcado con fluorescencia anticuerpo secundario (rojo) permiten a la medición de la intensidad de la fosforilación RB1 en . S780 por núcleo (C) reportero GFP-CDK2: Las células utilizadas de forma estable expresar una proteína indicadora GFP-etiquetados que se transloca entre el núcleo y el citoplasma en un patrón del sistema con el ciclo celular. Dual medición de la intensidad de GFP nuclear y citoplásmica emparejado para cada celda permite el cálculo de una relación de por célula que se puede utilizar para distinguir la fase G1 del resto del ciclo celular. Tres blancos siRNA se utilizarán para ilustrar el análisis; un no-objetivo siRNA control negativo; CDK6 siRNA como un control positivo en perturbar la fosforilación RB1 y el progreso del ciclo celular; RB1 siRNA para establecer la especificidad del anticuerpo.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Organización de los archivos de imagen antes de análisis de imagen Las imágenes tomadas de la placa de cultivo tisular se nombran sistemáticamente con el fin de permitir que el software de análisis de imágenes para relacionar los datos de imagen de vuelta al contexto experimental inicial.. Esta información se coloca en el nombre de archivo para cada imagen. (A) Como cada pozo de la placa experimento puede corresponder a diferentes objetivos RNAi o tratamientos, la parte formas de dirección bien del nombre de archivo. (B) El número del bastidor es parte del nombre de archivo . como cada pocillo se forma la imagen para recoger múltiples, no superposición de marcos (C) Las sondas fluorescentes de cada cuadro se crean imágenes de forma separada; en consecuencia, los nombres de archivo también deben reflejar qué canal cada imagen se refiere a. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:. El uso de perfiles celular para medir el ADN nuclear y la tinción de anticuerpos Con la configuración en el archivo proporcionado tubería (3_channels_pipeline.cppipe), los valores de intensidad de las medidas de software de análisis de imágenes de fluorescencia Profiler célula de ADN nuclear y el anticuerpo vinculante relativo a las células individuales . (A) Los núcleos se identifican en la imagen del canal 'azul' de ADN manchado. (B) < / Strong> Las posiciones de los ADN manchado núcleos se llevan a cabo temporalmente en un 'Núcleos máscara'. La máscara núcleos se superpone entonces sobre (C) las imágenes azules y rojas de canal (ADN y de fluorescencia de anticuerpos de datos, respectivamente) y los valores de fluorescencia de segmentos de imagen que se superponen con la máscara se registran contra cada célula identificada. La identificación exitosa de núcleos vecinos, separados se puede evaluar visualmente en el aspecto de la máscara núcleos. A título de ejemplo, que se muestra con un círculo en esta imagen de la máscara, son ejemplos en los ajustes seleccionados para el algoritmo tienen erróneas identificadas núcleos vecinos como un solo núcleo. Ajuste de la configuración del algoritmo para minimizar se introduce en la sección de Discusión estos eventos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: El uso de Profiler célula para medir intensidades de GFP nucleares y citoplasmáticas El reportero GFP-etiquetados CDK2 se transloca entre el núcleo y el citoplasma en relación con la posición en el ciclo celular de las células.. Al mismo tiempo que la célula calcula los perfiles de ADN y anticuerpos intensidades nucleares por célula (Figura 4), ​​sino que también calcula la relación entre núcleo y citoplasma de las intensidades de GFP para cada celda. (A) Los datos tinte de ADN para cada imagen se utiliza para generar una máscara de núcleos. Profiler (B) Cell utiliza los Núcleos máscara en conjunto la imagen de la GFP reportero GFP-CDK2 para sembrar la posición de cada célula con y luego se expande para el perímetro de cada celda para estimar toda la huella de cada célula. Esto se convierte en un nuevo, 'máscara de teléfono'. (C) La máscara de núcleos se resta de la máscara de la célula para producir una serie rosquilla de citoplasma esquemas, que se conviertenel 'Citoplasma máscara'. (D) La máscara y el citoplasma máscara núcleos son utilizados por Profiler célula para medir pares de valores GFP nucleares y citoplasmáticos. Estos valores apareados son utilizados por la célula Profiler para calcular los coeficientes, que informan sobre la posición de cada célula en el ciclo celular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6:. La extracción de datos - Procesamiento de datos celulares individuales primas mediante la imposición de puertas en los valores de ensayo tendencias biológicos de los datos de las celdas individuales para la tinción de anticuerpos y ensayos de reportero GFP-CDK2 se extraen mediante los datos cerrados. Los histogramas de los datos en bruto permiten la identificación de los valores adecuados de la puerta. Estos se impusieron con un script en Perl (A) El.producto final del análisis de los archivos de imagen con los ajustes previstos para Profiler célula son separados por comas valor (.csv). Estos archivos c ontain datos de la celda de particulares relativas a cada uno de los diferentes segmentos subcelulares. El archivo 'Nuclei.csv' contiene todas las medidas seleccionadas relacionadas con el uso de la máscara de núcleos. Estas mediciones incluyen la intensidad de anticuerpo nuclear, la intensidad de ADN nuclear y la relación de GFP (núcleo / citoplasma). (B) Histogramas de la intensidad de anticuerpo nuclear (izquierda) y las proporciones de reportero GFP-CDK2 (derecha) trazada a partir de los datos individuales de células para cada condición caída siRNA . Las barras de los histogramas que aparecen muestran las posiciones de puerta deseados para estos ensayos. Datos coloreados en los histogramas indican las subpoblaciones cerradas. (C) Las puertas de los dos ensayos ilustrados en B se aplican a los datos brutos, utilizando '2_gate_classifier.pl' el script de Perl. La secuencia de comandoscrea una copia modificada del archivo de salida Profiler célula original (Nuclei.csv) para asistir a la posterior trazado. Los dos valores de compuerta se registran en el nuevo archivo (resaltado en color aquí) y se añade una nueva columna 'Label'. La bandeja de etiquetas de cada célula en una de cuatro posibles subgrupos basados ​​en los dos valores de ensayo cerrado para cada célula. Estas etiquetas se utilizan en parcelas posteriores que cuentan con los cálculos de las contribuciones de cada subpoblación, así como las referencias cruzadas de los parámetros adicionales que se generan en el Perfil de la célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7:. Gráficos de dispersión para cada condición siRNA que representa los datos en bruto para las células individuales y posiciones de la puerta Esparza parcelas de individatos de la celda doble de todas las imágenes de las condiciones siRNA indicaron: (A) siRB1; (B) control negativo sinon de metas; (C) siCDK6. Representan frente a los ejes Y son valores de fluorescencia nuclear de tinción RB1 anti-P-S780. Representada frente a los ejes X son los valores de las relaciones correspondientes calculados a partir del reportero GFP-CDK2. Las barras rojas y verdes indican las posiciones de las puertas de la puerta RB1 P-S780 y las puertas reportero GFP-CDK2, respectivamente. Las dos puertas se dividen las células en cuatro subpoblaciones y los números en los cuadrantes resultantes son el número ciento de las células de cada uno de estos. Anotaciones en torno a los ejes de A indican los cuatro posibles etiqueta-elementos aplicados a cada célula por el 2_gate_classifier.pl script de Perl. Estas etiquetas se muestran en relación con su respectiva puerta de ensayo y se utilizan en el R-script (analysis.r) para generar las parcelas en las Figuras 6, 7 y Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Teléfonos subpoblaciones definidas por los dos ensayos de tránsito G1 muestran perfiles de ADN 2N y 4N de acuerdo con el resultado del ensayo El gráfico de dispersión de los datos para las células siCDK6 se repite en la figura 7C.. Rodeando el gráfico de dispersión son histogramas de intensidad ADN nuclear integradas en relación con grupos de la población. Aquellos por encima de la nube de puntos se relacionan con el reportero de ensayo-GFP CDK2. Aquellos a la derecha del diagrama de dispersión se refieren a medidas de anticuerpos fosfo-RB1 nuclear por sí sola. Las líneas de puerta de color se extienden a mostrar su relación con los histogramas. Etiquetas de puertas por las cuales se seleccionaron los datos de la celda para estas parcelas adicionales también se muestran. Las células con pérdida de RB1 fosforilados en serina 780 (P-S780-) o aquellos con un alto reportero nuclear GFP-CDK2 al citoplasma (que indican una baja actividad de CDK2) muestran perfiles de ADN predominantemente 2N-como, mientras que sus contrapartes opuestas para cada ensayo respectivo mostrar una distribución de 2N y 4N, característica de una población de fase mixta, post-G1 de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Resumen parcelas de valores de ensayo cerrado para cada siRNA condición gráficos de datos Resumen de barrios cerrados (A) datos RB1 P-S780 y datos (B) GFP-CDK2 de pocillos por triplicado para cada condición siRNA desmontables.. Los valores se calculan a partir de la salida de la célula de perfiles en bruto (Nuclei.csv) utilizando laScripts de Perl, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) o 'G1assay_summary.pl' (B). Los valores representados son la media de las células por ciento dentro de la puerta se aplica a cada ensayo. Las barras indican los errores estándar calculados a partir de pocillos por triplicado. Valores no apareados, homoscedastic T-Test P para cada condición caída en comparación con los no-siRNA dirigidos se muestran por encima de los datos representados en la que P <0,001 (**) y P <0,05 (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura S1. Configuración de software Profiler celular para el análisis de imágenes. (A) Captura de pantalla de Profiler célula antes se introducen los ajustes de análisis de imagen. (B) Captura de pantalla de Profiler célula después de que se han cargado los datos de algoritmos contenidos en '3_channels_pipeline.cppipe'. El alto pestaña iluminado en la esquina superior izquierda indica que esta pantalla se muestran los parámetros para la etapa de 'LoadImages' del análisis. Al hacer clic en las otras partes de la lista de abajo esto revelará los detalles de los pasos siguientes en el análisis. (C) Captura de pantalla de Profiler célula con los detalles para la carpeta de entrada y salida de carpetas entró. (D) Captura de pantalla de Profiler célula después de la 'Analizar botón de imágenes 'se ha hecho click para comenzar el análisis. Superpuesto unas tres ventanas nuevas que ilustran las máscaras producidas algorítmicamente-generadas por el software de las imágenes analizadas. Estas ventanas se accede haciendo clic en los iconos de "ojo" a la posición abierta al lado de los pasos relevantes en el análisis, en la esquina superior izquierda de la ventana principal de Profiler célula. Estas visitas ayudan al usuario verificar si los ajustes que generan las máscaras de color confeti están de acuerdo con los datos de escala de grises,, originales adjuntos.

ent "> Figura S2. El uso de Perl y RStudio a puerta datos de la celda individual y trazar las subpoblaciones de células resultantes. (A) El panel derecho muestra la carpeta elegida para recibir los archivos de la salida .csv (iconos verdes) a partir del análisis de perfiles de la célula. Los scripts de Perl se proporcionan con el manuscrito (iconos azules) se copian en esta carpeta. destacado es el script de Perl 2_gate_classifier.pl ', que ha sido hecho doble clic con el ratón para producir el cuadro de diálogo en el panel de la izquierda. Se muestran la indicaciones y correspondientes escrito respuestas necesarias a la puerta de los datos individuales de células desde el archivo 'Nuclei.csv'. (B) Captura de pantalla de RStudio inmediatamente después de cargar el script 'analysis.R'. Se destacan los comandos para cargar los datos cerrados de A en el software antes de trazado (detalles de la nota en las líneas 5 y 6 tendrá que ser ajustado de acuerdo a donde se encuentran los datos cerrada en la computaciónr utilizada para el análisis). (C) Captura de pantalla de RStudio vez que los datos se ha cargado. (D) Captura de pantalla de RStudio muestra resaltado el bloque de código necesario para producir la gráfica se muestra en la ventana inferior derecha. Los códigos para cada parcela están separados por líneas en blanco y se agrupan por tipo de trama.

objetivo siRNA	Direcciones y Placa
No focalización (NT)	E5, F5, G5
El retinoblastoma (RB)	E7, F7, G7
Quinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabla 1: Las direcciones de pozos y las correspondientes condiciones siRNA utilizados en el ejemplo de datos establecidos.

Discussion

El flujo de trabajo descrito constituye un procedimiento para la perturbación de múltiples pocillos de células utilizando siRNA, la detección de marcadores posterior y finalmente uso de una serie de pasos de software soportado para facilitar la extracción de los datos cuantitativos de las imágenes de microscopía fluorescente resultantes. El enfoque se centra en la entrega de valores de intensidad nucleares y citoplasmáticas de las células individuales, que tiene una amplia aplicación práctica en muchas aplicaciones basadas en células. Los datos de ejemplo utilizados aquí se generaron en un ajuste de la pantalla siRNA en el que dos ensayos fluorescentes para el tránsito del ciclo celular en fase G1 se prueban y se correlacionan de nuevo a una medida más directa biofísico del contenido de ADN nuclear.

El uso de una mancha de ADN fluorescente de ADN nuclear imagen es un paso indispensable en el proceso de segmentación de imágenes, ya que permite la identificación de células individuales y la resultante 'Núcleos máscara' sirve como el punto de partida para identificar correspondiente cytoplasmiregiones c. El reportero CDK2 GFP-etiquetados, que se expresa de forma estable en las células, da una variable todavía consistentemente más alta que la señal de fondo en el citoplasma por la cual este compartimiento se puede delinear. El mismo análisis de tuberías debe ser aplicable al análisis de los eventos de translocación de proteínas utilizando otros reporteros de fluorescencia ligada adecuados y su respuesta a la perturbación. Además, sustituyendo el reportero GFP-CDK2 con tintes fluorescentes-citoplasma específica permitiría el uso alternativo de este algoritmo para medir las dimensiones del citoplasma y los tamaños relativos de las células en las imágenes.

Otra consideración de diseño en la estrategia de segmentación de imagen descrito aquí es el uso de la célula de perfiles para ofrecer valores de intensidad integrados para la cuantificación de ADN. Integración de la intensidad de valores para los datos de tinción de ADN nuclear permiten posibles variaciones en el tamaño núcleo, y representa una coincidencia cercana para los perfiles de cuantificación vistopara yoduro de propidio manchado FACS datos. Sin embargo, la intensidad integrada no puede proporcionar un medio adecuado para evaluar la función de la proteína donde la concentración media, ejemplificada por la intensidad media de fluorescencia antígeno, es biológicamente más relevante que la cantidad total integrado de proteína (y fluorescencia asociada) dentro de un compartimento celular. Por lo tanto significan valores de intensidad se utilizaron para la P-S780 RB1 y los datos GFP. La opción para alterar entre los dos modos (media o integrado) de la evaluación de los datos se encuentran en el panel 'ExportToSpreadsheet' del software Profiler célula.

Los ajustes de análisis en el archivo 3_channels_pipeline.cppipe están optimizados para las imágenes en el conjunto de datos de ejemplo. Análisis de nuevas imágenes conjuntos con este protocolo, será necesario que los nombres de archivo adoptan la convención de nombres descrita anteriormente (Figura 3). Además, la sensibilidad valora adecuada a la luminosidad de la tinción de ADN nuclear y umbrales para el fondointensidades en los nuevos conjuntos de imágenes pueden necesitar ser ajustado dentro de la configuración del analizador Cell. Dado el papel clave de la tinción de ADN se mantiene para la construcción de las diversas máscaras de segmentación de imágenes, la aplicación de ajustes de sensibilidad correctos para este canal es clave para el análisis exitoso de nuevos datos de la imagen con el software Profiler Cell. El archivo de configuración proporcionado Profiler celular (3_channels_pipeline.cppipe) contiene notas sobre los parámetros más útiles para adaptar el análisis de nuevos datos. Estas notas están en el cuadro de texto en la parte superior de la pantalla en la ventana principal de Profiler celular e incluyen una guía sobre cómo cambiar los ajustes de sensibilidad y ajustar el número de canales a analizar. Como acusado en la sección Protocolo 2.8, para probar la configuración de los nuevos datos de la imagen puede ser necesario para observar la segmentación de imágenes durante el análisis de la imagen haciendo clic en Abrir los iconos de "ojo" para cada uno de los 'Identificar ... Objetos' pasos del protocolo (Figura S1D ). En particular, la visualización de los datos de imagen a través de 'IdentifyPrimaryOjects' mostrará si la máscara núcleos se identifica correctamente a partir de imágenes de la tinción de ADN. En la página de software Profiler célula para módulo de los 'IdentifyPrimaryOjects' es el factor de corrección umbral. Ensayo y error de ajuste de este valor se solucionará la mayoría de los errores de reconocimiento nucleares. Los valores de balance del canal de ADN contra la intensidad de fondo para cada imagen. Los valores del factor de corrección Umbral giran en torno a 1, donde mayor que este es más riguroso (bueno para imágenes claras) y menos de 1 El indulgente (adecuado para imágenes con menos contraste entre las manchas y fondo).

La salida de los datos en bruto de células individuales de Profiler célula puede ser analizado en diferentes maneras para adaptarse a las necesidades de los otros estudios. Aquí se muestra el uso de un script Perl para aplicar puertas a dos de los parámetros medidos por célula con el fin de ayudar a la extracción de las tendencias biológicas de la una de datosd permiso de referencias cruzadas de las subpoblaciones identificadas con medidas adicionales. Aunque también es posible incluir elementos de compuerta en el marco de Profiler célula, la ruta alternativa utilizada aquí proporciona una mayor flexibilidad y rapidez, especialmente si grandes conjuntos de datos deben ser evaluados. La etapa más lenta en las fases de adquisición posterior de las imágenes del protocolo actual es la ejecución del software Profiler célula. Perfilador Cell aquí se ejecuta sin imponer puertas para producir un conjunto de datos en bruto no-cerrada que puede ser reanalyzed con el script Perl posterior más rápida y, si es necesario, de forma iterativa con valores diferentes de puerta. No todos los estudios sabrán de antemano los valores de compuerta adecuados como esto puede variar con los reactivos en cualquier conjunto dado de datos, y potencialmente con el tiempo. Es, por tanto, se recomienda para generar histogramas que representan la distribución de los datos en bruto obtenido a partir de perfiles de la célula para los controles positivos y células maqueta perturbados con el fin de identificar Valu puerta adecuadaes para los parámetros de interés.

Los scripts de Perl se escriben a aceptar una estructura de columnas definidas rígidamente de datos de perfiles de la célula y puede dejar de funcionar si un usuario modifica el número de parámetros de salida por Profiler célula usando las configuraciones del 'ExportToSpreadsheet'. Para ayudar a implementar la modificación de la configuración de las notas se incluyen dentro de los archivos de script de Perl. Para ver estos ver la secuencia de comandos en un editor de texto, preferiblemente editor de texto para programadores de Perl establece en elementos de código de color (por ejemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indican dónde ajustar la secuencia de comandos para adaptarse a los cambios de formato de datos. De manera similar a los scripts de Perl, el archivo de código R proporcionado (analysis.r), que contiene las instrucciones para el trazado de las cifras de los datos de análisis de imagen, se puede leer en un editor de texto o software RStudio ver notas adicionales sobre el uso y la adaptación. Estas notas pueden ser complementados con información detallada sobre expresiones regulares y Perl ^{12 y el paquete ggplot2 13 para R, los cuales forman la base de cómo se leen los datos, anotado y se representa, respectivamente.}

Nuevos estudios utilizando microscopía de fluorescencia, así como datos brutos depositados en las publicaciones de código abierto son susceptibles a métodos de análisis tales como los descritos aquí. La propia naturaleza de los datos de alta contenido se presta para el análisis recursivo con diferentes énfasis analíticos en función de los intereses de investigación de cualquier observador dado. Aunque las preguntas que se pueden hacer de los datos están limitados por las sondas utilizadas originalmente, los datos de imagen a menudo pueden ser significativamente volvieron a analizar más allá del ámbito de los estudios que los generaron.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars siRNA de control negativo	Qiagen 1027280		siRNA de control negativo.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Síntesis personalizada	NA	Secuencia antisentido: 5' CUCUAGGCCAGUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Síntesis personalizada	NA	Secuencia antisentido: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x tampón siRNA	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Para diluir con agua tratada sin nucleasas, sin DEPC.
Agua sin interrupciones (no DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Para la dilución de tampón siRNA.
Lípido de transfección	Hiperfect	Qiagen	301705
DMEM	Life Technologies	41966052	medios de cultivo de tejidos suplementados con piruvato y alto contenido de glucosa.
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Falcon	3072	Plain, placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la mezcla paralela y compartimentada de complejos de transfección.
Placa Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS 6005182		placa TC de 96 pocillos con base óptica en la que se transfectan, crecen, fijan y finalmente se obtienen imágenes de las células. Se suministra con sellos de placa adhesivos opacos, que se utilizan durante el almacenamiento de placas usadas.
Membrana transpirable	Alpha Labs	LW2783	Membrana adhesiva estéril y permeable al gas.
Formalina tamponada neutra, fijador de 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% de formalina (4% formaldehído) utilizado solo en el protocolo.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Detergente
[header]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hidroximetil)aminometano)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Para solución de lavado de placas.
Anticuerpo anti-P-S780 RB1	Abcam	ab32513	Monoclonal de conejo
AlexaFluor647	Antivitrogen	anti-conejo A21245	Anticuerpo secundario altamente adsorbido y marcado con fluorescencia.
Hoechst 33342 (Bisbenzimida)	Sigma-Aldrich	B2261	Colorante fluorescente, intercalante de cromatina, ADN.
Solución de permeabilización	NA	NA	0,1% Triton X-100 en solución salina tamponada con Tris de 50 mM, pH 8,0.
Solución de lavado de placas	NA	NA	Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20.
Solución en bloque	NA	NA 5	% de leche en polvo en solución salina tamponada Tris y 0,1% Tween-20. Para bloquear la placa antes de la inmunotinción y la dilución de anticuerpos.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Edición de la comunidad	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R Entorno de programación	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio Rstudio			http://www.rstudio.com/