Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

El objetivo general de este procedimiento es medir objetivamente las respuestas de las células individuales mediante la cuantificación de intensidades específicas de marcadores fluorescentes a partir de imágenes de microscopio. Esto se logra sometiendo primero a las células de cultivo de tejidos adherentes a la descomposición de genes mediada por irna. En el segundo paso, las células se tiñen con fluorescencia y luego se obtienen imágenes para detectar varios marcadores de interés.

En el paso final, la expresión de los marcadores dentro de regiones subcelulares específicas se definen algorítmicamente, son células individuales. En última instancia, las respuestas celulares a las señales biológicas de la eliminación de genes se pueden analizar midiendo los niveles de expresión fluorescente de los marcadores de interés y su translocación subcelular. Sin embargo, este procedimiento proporciona información sobre la regulación del tránsito del ciclo de una célula G en respuesta a los siRNA.

También se puede aplicar a estudios que generan imágenes de células fluorescentes, estudiando el transporte nuclear y la homeostasis de proteínas. Daniel Wek y Car K HO, compañeros postdoctorados de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento y comenzarán dispensando 70 microlitros de irna de 200 nanomolares, diluidos con un tampón de irna en los pocillos apropiados de una placa estéril de 96 pocillos en una campana de cultivo de tejidos estéril. Luego agregue 105 microlitros de lípido de transfección diluido en 40 volúmenes de medio DMEM libre de suero en cada pocillo de sir a mezclar la placa mediante una suave vibración a temperatura ambiente, y luego, después de 10 minutos, subdivida los 175 microlitros resultantes en tres réplicas de 50 microlitros por objetivo en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido opaco con una base transparente.

A continuación, dispense 8.000 células por pocillo en 150 microlitros de DMEM con suero al 10% directamente sobre los complejos de irna lipídico de 50 microlitros sin mezclar. A continuación, selle la placa con una membrana adhesiva estéril y transpirable y colóquela en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 48 horas después, aspire los medios de las placas.

A continuación, fije las células en 100 microlitros de formaldehído tampón al 4% en una campana extractora a temperatura ambiente Después de 10 minutos, aspire el fijador y realice tres lavados de 100 microlitros con PBS después del último lavado. Retire el PBS y perfore las células con tres ciclos de incubación de solución de permeación de 100 microlitros de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente sin agitar. Después de la última incubación, retire la solución de permeación y luego agregue 100 microlitros de solución de bloque por pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, aspire la solución en bloque y pruebe las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés dentro de las dos semanas posteriores al etiquetado del microscopio confocal uc con un objetivo de 20 x para tomar imágenes TIFF separadas en escala de grises de 16 bits en tres canales correspondientes al colorante de ADN, GFP e inmunotinción. Los Flora fours capturan muchos conjuntos de imágenes o fotogramas que no se superponen para obtener imágenes de aproximadamente 1000 a 2000 células por pocillo. Nombrar el archivo de imagen sistemáticamente con la información de metadatos para que cada nombre de archivo sea una combinación única del nombre del experimento, la dirección del pozo, el número de fotograma y el identificador de canal.

A continuación, abra el software del generador de perfiles de celdas y haga clic en archivo e importación de tuberías. A continuación, en desde el archivo, seleccione el archivo de tubería CP de tubería de tres canales, que contiene las instrucciones necesarias para que el software interprete los metadatos del archivo de imagen del nombre de archivo guardado Convention Cell Profiler ahora se puede usar para relacionar las imágenes, extraer el ADN nuclear y las intensidades de anticuerpos de los archivos y usar el canal GFP para calcular la relación entre la intensidad nuclear y la del citoplasma. Para cada celda detectada, haga clic en el botón ver configuración de salida y, a continuación, haga clic en las carpetas de entrada y salida predeterminadas.

Seleccionar la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos, respectivamente. A continuación, en la ventana de módulos de análisis, haga clic en los iconos de ojo apropiados para observar las ventanas de identificación de objetos primarios y terciarios durante el análisis y haga clic en analizar imágenes cuando se complete el análisis. Haga clic en Aceptar en el cuadro de mensaje y vaya a la carpeta de salida predeterminada Ubicación, donde todos los archivos de datos se guardan como archivos de valores separados por comas.

Para realizar la extracción de datos, busque el nuevo archivo CSV de núcleos incluido entre la salida del perfilador de células, que contiene los datos de células individuales para la intensidad del anticuerpo nuclear fluorescente, la intensidad del ADN nuclear y los dos valores de la relación reportera GFP CDK. Copie el archivo de script de pulso proporcionado al clasificador de marcha PL en la misma carpeta que el archivo de datos CSV de los núcleos. A continuación, haga doble clic en el icono de Pearl Script.

Y cuando se le solicite, escriba el nombre completo del archivo de datos seguido de un nombre de archivo CSV DOT para el archivo en el que se van a controlar las células y los valores de puerta para la fluorescencia de anticuerpos y G FP CDK dos datos reporteros. Confirme que el archivo recién creado combina los valores brutos del ensayo de celda individual sin procesar del perfil de celda original de los datos con las etiquetas de subpoblación que muestran cómo se comporta cada celda de cada pocillo con respecto a ambas puertas. Ahora abra el software R Studio para trazar los datos de cada condición experimental utilizando las etiquetas de subpoblación de celdas individuales haciendo clic en archivo y abrir archivo, y luego seleccionando el archivo de análisis punto r proporcionado.

Escriba la dirección del equipo de la carpeta que contiene los datos controlados, incluida la letra de la unidad y el nombre del archivo en sí. Luego resalte las líneas del uno al 17 en la ventana superior izquierda de nuestro estudio, y haga clic en el botón de ejecución para ingresar los valores del umbral de datos experimentales y los detalles de la ubicación del pozo. Finalmente, resalte los bloques individuales del código restante debajo de la línea 17 y haga clic en el botón ejecutar para crear los gráficos correspondientes.

Observe los gráficos en la ventana en la esquina inferior derecha de nuestro estudio, y luego haga clic en el botón exportar para guardarlos en una variedad de formatos. El flujo de trabajo descrito aquí analiza las imágenes del microscopio fluorescente para producir datos sin procesar en forma de una lista que detalla cada célula identificada y sus valores de ensayo correspondientes. Existen muchas opciones para el análisis de estos datos.

Por ejemplo, en estos gráficos de histograma, los valores de ensayo para las células tratadas con ARN de control permiten la identificación de las puertas apropiadas para umbral de cada ensayo. A continuación, los umbrales de compuerta se aplican mediante un script de pulso para etiquetar cada celda en los datos brutos según el resultado del ensayo. Este enfoque de etiquetado ayuda a la evaluación visual preliminar, así como a la evaluación automatizada de las relaciones entre los tratamientos y la distribución de la subpoblación, incluso de conjuntos muy grandes de datos de células individuales.

Por ejemplo, en este experimento representativo, las condiciones de derribo de tres irna dieron como resultado distribuciones contrastantes de las células en relación con las puertas de los dos ensayos. Los gráficos R utilizan las etiquetas para calcular las distribuciones porcentuales de las celdas de cada cuadrante. Las etiquetas también permiten cruzar mediciones fluorescentes adicionales con los datos del ensayo.

En este experimento, las subpoblaciones de células tratadas con SI CDK six se agruparon de acuerdo con sus respectivas etiquetas de ensayo y se trazaron como histogramas de tinción de ADN nuclear. Este uso de las etiquetas de datos celulares revela la relación entre los dos ensayos celulares y el contenido de ADN en las células. Al realizar este procedimiento, siempre es importante recordar probar y ajustar los parámetros de segmentación de la imagen cuando se utiliza el generador de perfiles de celdas.

Esto es especialmente importante cuando se utilizan archivos de imagen nuevos o no probados por primera vez. Bien.