Name: Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar marcadores fluorescentes nucleares y citoplasmáticos en células individuales mediante análisis de imágenes de microscopía. Este flujo de trabajo informático utiliza Cell Profiler y R Studio para medir respuestas celulares a silenciamiento génico.

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Este trabajo fue apoyado por becas CRUK 15.043 y 14.251 CRUK. Damos las gracias a Daniel Wetterskog y Ka Kei Ho para la asistencia técnica y la lectura crítica del manuscrito.

1. Experimental Perturbación y Etiquetado celular para marcadores de respuesta (Reversa transfección siRNA pantalla) <ol><li> En una pipeta campana de cultivo de tejido estéril 70 l de 200 nM siRNA en tampón 1x siRNA en pocillos de una placa estéril, llano de 96 pocillos. Diluir lípidos transfección en 40 volúmenes de medio DMEM libre de suero y dispensar 105 l en cada pocillo que contiene siRNA. NOTA: La dilución de 262,5 l lipídico en 10.5 ml de suero libre de DMEM produce una mezcla maestra adecuado para un plato entero de 96 pocillos de siRNA, la entrega de 2,6 l de lípidos por pocillo. El uso de 200 nM siRNA concentración de partida en este paso entregará una concentración de trabajo de 20 nM en el paso 1.3, pero los procedimientos de trabajo para las concentraciones de trabajo hasta 5 nM, con la concentración de partida ajustado en consecuencia (es decir, 50 nM). Baja concentración de trabajo puede reducir las puntuaciones positivas falsas fuera de objetivo, aunque pueden reducir la magnitud de la respuesta en el blanco, lo que lleva al aumento de la sobre-Target tasas de falsos negativos. </li><li> Mezclar la placa por la vibración suave durante diez minutos a temperatura ambiente. La división de las 175 l resultantes en tres 50 l réplicas por objetivo en una, cultivo de tejidos opacos tratada, placa de 96 pocillos con una base transparente. </li><li> Transfectar inversa mediante la supresión de 8.000 células por pocillo en 150 l DMEM que contiene 10% de suero directamente sobre los complejos lípido-siRNA 50 l. Células colorrectales humanos Uso HCT116 que expresan establemente un marcador BPA de etiquetado informar la actividad de CDK2 5,8. No es necesaria una mezcla adicional. Sellar la placa con un adhesivo membrana transpirable estéril para controlar la humedad y evitar &#39;borde efectos&#39; de placa y colocar la placa en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de tal manera que una pequeña cantidad residual de los medios de comunicación permanece en los pocillos. Fijar las células mediante la adición de 100 l de formaldehído al 4% tamponado a cada pocillo e incubar en una campana de humos durante 10 min en la sala de temperature. </li><li> Retire la solución de fijación aspirando la placa. En este punto, bien interrumpir el experimento mediante el lavado de la placa tres veces con 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego Almacenar sellada, menos de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana, o continuar con la la permeabilización de las células. NOTA: Recomendamos placas de procesamiento tan pronto como sea posible después de la fijación, y por lo general prefieren el almacenamiento de placas totalmente elaborados. Conservantes biocidas tales como timerosal, azida de sodio, o alternativas comerciales se pueden añadir para prevenir el crecimiento micoroganismal. La adición de inhibidores de la fosfatasa ayuda a preservar fosfo-epítopos, y otros medios para preservar los estados de modificación de proteínas puede ser útil en contextos de ensayo pertinentes </li><li> Retirar PBS de la placa y permeabilizar las células mediante la adición de 100 l de solución de permeabilización. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Aspirar la solución de permeabilización utilizando un Multichpipeta annel. Repita este paso tres veces. </li><li> Bloquear las células mediante la adición de solución de bloque de 100 l por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar la solución de bloqueo mediante la aspiración de la placa, a continuación, la sonda con 50 l de anticuerpo contra RB1 P-S780 diluido 500 veces en la solución de bloque durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la placa tres veces con solución de lavado placa de 100 l, dejando la solución en la placa durante 5 min cada vez. Sonda de la placa durante la noche en la oscuridad a 4 ° C con 50 l fluorescentemente marcada con anticuerpo secundario diluido 1000 veces en solución de bloqueo suplementado con 2 mM del colorante de ADN específico de la cromatina bisbenzimide. Lavar la placa tres veces antes y tienda de sellado, por debajo de 100 l de PBS en la oscuridad a 4 ° C. Imagen de la placa dentro de dos semanas. </li></ol> 2. Imágenes y segmentación de imágenes <ol><li> Utilice un microscopio confocal o girando el disco de fluorescencia con un objetivo 20X tomar separado 16-bit, imágenes TIFF en escala de grises en tres canales correspondientes a la tintura de ADN, las buenas prácticas agrarias y fluoróforos inmuno-tinción. Capture muchos conjuntos de imágenes que no se superponen, a que se refiere aquí como marcos, a imagen de aproximadamente 1.000-2.000 células por pocillo. </li><li> Nombre de los archivos de imagen de forma sistemática para que cada nombre de archivo es una combinación única de &#39;nombre del experimento &quot;,&quot; dirección bien&#39;, &#39;número de cuadro&#39; y &#39;identificador de canal&#39;, en este orden (Figura 3). El conjunto de datos de ejemplo utiliza (tinción cromatina ADN) o &quot;verde&quot; (GFP) o &quot;Red&quot; (fluoróforo inmuno-manchado) como identificadores de canal &quot;Blue&quot;. La dirección también, número de bastidor y el canal identificador están más adelante referido como los metadatos de la imagen. Utilice el símbolo de subrayado que no induzca bien y el marco de metadatos. </li><li> Nombre de los archivos con estos elementos de metadatos en el orden especificado. Esto es necesario para asegurar que los pasos de software posteriores Correagrupar conjuntos ctly de imágenes para el análisis. </li><li> Descargue e instale el software gratuito de la célula de perfiles, Active Perl Community Edition, entorno de programación estadística R y RStudio. Aceptar todas las opciones por defecto durante la instalación; Los usuarios de PC instalar Active Perl deberían permitir a todas las opciones relacionadas con PATH, asociación extensión de archivo y el mapeado de scripts donde se le indique. Activo Perl es opcional para los usuarios de Mac, pero de lo contrario tendrá que ejecutar el script de Perl en el paso 3.2 de la línea de comandos de terminal en lugar de utilizar el icono de clic. </li><li> Abra el software Profiler célula, haga clic en &quot;Archivo&quot;, &quot;Importar Pipeline&quot; entonces &quot;Desde archivo&quot; y seleccione el archivo 3_channels_pipeline.cppipe (Figuras S1A y S1B). El archivo contiene las instrucciones necesarias para el software de interpretar metadatos de imágenes de archivo en la convención de nombre de archivo se describe. Profiler célula ahora relaciona las imágenes, extractos de ADN nuclear y las intensidades de anticuerpos del XXESE y utiliza el canal de las buenas prácticas agrarias para calcular la relación de la energía nuclear frente a la intensidad citoplasma de cada célula detectados (Figuras 4 y 5). </li><li> Haga clic en el botón &quot;Ver los ajustes de salida&quot; en la esquina inferior izquierda de la ventana de perfiles Cell. En la parte superior de la nueva pantalla son cuadros de texto etiquetados &#39;carpeta predeterminada de entrada &quot;y&quot; Carpeta de salida por defecto&#39;. Uno a la vez, haga clic en la carpeta iconos a la derecha de estas cajas y seleccione la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos, respectivamente (Figura S1C). </li><li> Comienza el análisis de la imagen pulsando el botón &quot;Analizar las imágenes &#39;en la esquina inferior izquierda de Profiler célula. En la parte inferior de la pantalla observar el tiempo restante para la extracción de datos, el &#39;Análisis Stop&#39; y los botones de &quot;pausa&quot;. Si es necesario hacer una pausa en el análisis seleccionando el botón &#39;Pause&#39; en cualquier momento, lo cual es útilal ver las imágenes que se analiza (descrito en el paso 2.8). </li><li> Opcionalmente, abra las ventanas para cualquiera de las etapas de análisis de imagen haciendo clic en los iconos de ojo en el panel de la extrema izquierda de la ventana del programa (Figura S1D). Observe la ventana &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; y los de &#39;secundarias&#39; y &#39;Objetos Terciario&#39; para comprobar que la configuración actual en el Perfil de la célula para realizar la segmentación de imágenes son adecuadas (ver Figura 1 y Discusión para el asesoramiento sobre la modificación de estos parámetros). </li><li> Haga clic en &quot;Aceptar&quot; en el cuadro de mensaje que aparece cuando se completa el análisis. Ir a &#39;Default Carpeta de salida &quot;el lugar donde todos los archivos de datos con los resultados se guardan como separada por comas de valores (.csv) (Figura S2A). </li></ol> 3. Extracción de datos <ol><li> Encuentra el nuevo archivo &#39;Nuclei.csv&#39;, que se incluye entre lossalida del Profiler Cell. Este archivo contiene datos de las celdas individuales de intensidad anticuerpo nuclear fluorescente, la intensidad de ADN nuclear y valores de la relación periodista-GFP CDK2 (Figuras 6A y S2A). NOTA: Diferentes laboratorios querrán procesar este tipo de datos para adaptarse a la naturaleza de sus propios ensayos. Sugerido para el de datos actual es el gating de las células de cada condición de tratamiento de acuerdo con los datos de anticuerpos y los valores reportero GFP-CDK2 utilizando el script Perl proporcionado &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Copie el archivo de script de Perl proporcionado &#39;2_gate_classifier.pl&#39; en la misma carpeta que el archivo de datos &#39;Nuclei.csv&#39; (Figura S2A). Haga doble clic en el icono para el script de Perl y, cuando se le solicite, escriba el nombre completo del archivo de datos seguido por un &#39;.csv&#39; nombre nombre para el archivo en el que las células han de ser cerrada y finalmente los valores de compuerta para el anticuerpofluorescencia y datos reportero GFP-CDK2. NOTA: Cómo determinar principalmente ajustes de la compuerta y aplicarlos para el análisis de los datos se analizan a continuación en la sección Datos Representante y la Figura 6 (para analizar los datos proporcionado uso &#39;0.004&#39; y &#39;1.5&#39;, respectivamente). Los usuarios de Mac deben ejecutar el script de Perl desde la línea de comandos de terminal escribiendo: &#39;perl 2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Observe el archivo recién creado que combina los valores de ensayo de células individuales primas partir de los datos del analizador Cell originales con etiquetas sub-población que muestran cómo cada célula de cada pocillo realiza contra dos puertas (Figura 6C). </li><li> Grafica los datos para cada condición experimental usando las etiquetas de subpoblación de células individuales mediante la apertura del software RStudio. Haga clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir archivo&quot;, a continuación, seleccione el archivo &#39;analysis.r »prevista. Observe los comandos para trazar figuras 6B, <strong&gt; 7 y 8 en la ventana superior izquierda de RStudio (Figura S2 B). En la ventana superior izquierda, entre los símbolos de comillas dobles en las líneas 5 y 6, escriba la dirección del equipo de la carpeta que contiene los datos cerrados. Incluya la letra de unidad y el nombre del archivo en sí, respectivamente (por ejemplo, &quot;C: / carpeta / análisis de los resultados del análisis&quot; y &quot;nuclei_gated.csv&quot;). NOTA: Si RStudio se utiliza por primera vez en un equipo determinado, necesitará el paquete de gráficos R &#39;ggplot2&#39; para instalarse primero. Esto es una vez único paso para una nueva instalación de RStudio, después de que este paso se vuelve redundante. Para instalar &#39;ggplot2&#39;, haga clic en la pestaña llamada &quot;paquetes&quot; por encima de la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio, haga clic en el botón &#39;Instalar paquetes&#39; que aparece debajo de esta. Aparecerá una nueva ventana. Tipo &#39;ggplot2&#39; (citas omitiendo) en el &#39;paquetes&#39; sritmo en esta nueva ventana y, finalmente, haga clic en el botón &quot;Instalar&quot; para cerrar la ventana, instale las funciones ggplot2 necesarias y volver a la ventana principal RStudio para continuar desde el paso 3.6. </li><li> Resaltar líneas 1 a la 17 en la ventana superior izquierda de RStudio, a continuación, haga clic en el botón &quot;Ejecutar&quot;. Se ingresa los datos experimentales, los valores de umbral y detalles de la ubicación así a R (Figura S2C). R ahora mantener temporalmente los datos relevantes para el trazado. </li><li> Resaltar bloques individuales del código restante debajo de la línea 17 y crear las parcelas correspondientes haciendo clic en el botón &quot;Ejecutar&quot; como antes. Observar las parcelas en la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio y guardar varios formatos haciendo clic en el botón &quot;Exportar&quot; (Figura S2D). </li><li> Mientras se cierra RStudio, haga clic en &#39;No guardar &quot;cuando se le solicite. Esto evita confusión en el siguiente uso del RStudio, que de otro modo celebrará datosde la sesión anterior. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El flujo de trabajo descrito constituye un procedimiento para la perturbación de múltiples pocillos de células utilizando siRNA, la detección de marcadores posterior y finalmente uso de una serie de pasos de software soportado para facilitar la extracción de los datos cuantitativos de las imágenes de microscopía fluorescente resultantes. El enfoque se centra en la entrega de valores de intensidad nucleares y citoplasmáticas de las células individuales, que tiene una amplia aplicación práctica en muchas aplicaciones basadas en células. Los datos de ejemplo utilizados aquí se generaron en un ajuste de la pantalla siRNA en el que dos ensayos fluorescentes para el tránsito del ciclo celular en fase G1 se prueban y se correlacionan de nuevo a una medida más directa biofísico del contenido de ADN nuclear. El uso de una mancha de ADN fluorescente de ADN nuclear imagen es un paso indispensable en el proceso de segmentación de imágenes, ya que permite la identificación de células individuales y la resultante &#39;Núcleos máscara&#39; sirve como el punto de partida para identificar correspondiente cytoplasmiregiones c. El reportero CDK2 GFP-etiquetados, que se expresa de forma estable en las células, da una variable todavía consistentemente más alta que la señal de fondo en el citoplasma por la cual este compartimiento se puede delinear. El mismo análisis de tuberías debe ser aplicable al análisis de los eventos de translocación de proteínas utilizando otros reporteros de fluorescencia ligada adecuados y su respuesta a la perturbación. Además, sustituyendo el reportero GFP-CDK2 con tintes fluorescentes-citoplasma específica permitiría el uso alternativo de este algoritmo para medir las dimensiones del citoplasma y los tamaños relativos de las células en las imágenes. Otra consideración de diseño en la estrategia de segmentación de imagen descrito aquí es el uso de la célula de perfiles para ofrecer valores de intensidad integrados para la cuantificación de ADN. Integración de la intensidad de valores para los datos de tinción de ADN nuclear permiten posibles variaciones en el tamaño núcleo, y representa una coincidencia cercana para los perfiles de cuantificación vistopara yoduro de propidio manchado FACS datos. Sin embargo, la intensidad integrada no puede proporcionar un medio adecuado para evaluar la función de la proteína donde la concentración media, ejemplificada por la intensidad media de fluorescencia antígeno, es biológicamente más relevante que la cantidad total integrado de proteína (y fluorescencia asociada) dentro de un compartimento celular. Por lo tanto significan valores de intensidad se utilizaron para la P-S780 RB1 y los datos GFP. La opción para alterar entre los dos modos (media o integrado) de la evaluación de los datos se encuentran en el panel &#39;ExportToSpreadsheet&#39; del software Profiler célula. Los ajustes de análisis en el archivo 3_channels_pipeline.cppipe están optimizados para las imágenes en el conjunto de datos de ejemplo. Análisis de nuevas imágenes conjuntos con este protocolo, será necesario que los nombres de archivo adoptan la convención de nombres descrita anteriormente (Figura 3). Además, la sensibilidad valora adecuada a la luminosidad de la tinción de ADN nuclear y umbrales para el fondointensidades en los nuevos conjuntos de imágenes pueden necesitar ser ajustado dentro de la configuración del analizador Cell. Dado el papel clave de la tinción de ADN se mantiene para la construcción de las diversas máscaras de segmentación de imágenes, la aplicación de ajustes de sensibilidad correctos para este canal es clave para el análisis exitoso de nuevos datos de la imagen con el software Profiler Cell. El archivo de configuración proporcionado Profiler celular (3_channels_pipeline.cppipe) contiene notas sobre los parámetros más útiles para adaptar el análisis de nuevos datos. Estas notas están en el cuadro de texto en la parte superior de la pantalla en la ventana principal de Profiler celular e incluyen una guía sobre cómo cambiar los ajustes de sensibilidad y ajustar el número de canales a analizar. Como acusado en la sección Protocolo 2.8, para probar la configuración de los nuevos datos de la imagen puede ser necesario para observar la segmentación de imágenes durante el análisis de la imagen haciendo clic en Abrir los iconos de &quot;ojo&quot; para cada uno de los &#39;Identificar ... Objetos&#39; pasos del protocolo (Figura S1D </strong&gt;). En particular, la visualización de los datos de imagen a través de &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; mostrará si la máscara núcleos se identifica correctamente a partir de imágenes de la tinción de ADN. En la página de software Profiler célula para módulo de los &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; es el factor de corrección umbral. Ensayo y error de ajuste de este valor se solucionará la mayoría de los errores de reconocimiento nucleares. Los valores de balance del canal de ADN contra la intensidad de fondo para cada imagen. Los valores del factor de corrección Umbral giran en torno a 1, donde mayor que este es más riguroso (bueno para imágenes claras) y menos de 1 El indulgente (adecuado para imágenes con menos contraste entre las manchas y fondo). La salida de los datos en bruto de células individuales de Profiler célula puede ser analizado en diferentes maneras para adaptarse a las necesidades de los otros estudios. Aquí se muestra el uso de un script Perl para aplicar puertas a dos de los parámetros medidos por célula con el fin de ayudar a la extracción de las tendencias biológicas de la una de datosd permiso de referencias cruzadas de las subpoblaciones identificadas con medidas adicionales. Aunque también es posible incluir elementos de compuerta en el marco de Profiler célula, la ruta alternativa utilizada aquí proporciona una mayor flexibilidad y rapidez, especialmente si grandes conjuntos de datos deben ser evaluados. La etapa más lenta en las fases de adquisición posterior de las imágenes del protocolo actual es la ejecución del software Profiler célula. Perfilador Cell aquí se ejecuta sin imponer puertas para producir un conjunto de datos en bruto no-cerrada que puede ser reanalyzed con el script Perl posterior más rápida y, si es necesario, de forma iterativa con valores diferentes de puerta. No todos los estudios sabrán de antemano los valores de compuerta adecuados como esto puede variar con los reactivos en cualquier conjunto dado de datos, y potencialmente con el tiempo. Es, por tanto, se recomienda para generar histogramas que representan la distribución de los datos en bruto obtenido a partir de perfiles de la célula para los controles positivos y células maqueta perturbados con el fin de identificar Valu puerta adecuadaes para los parámetros de interés. Los scripts de Perl se escriben a aceptar una estructura de columnas definidas rígidamente de datos de perfiles de la célula y puede dejar de funcionar si un usuario modifica el número de parámetros de salida por Profiler célula usando las configuraciones del &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Para ayudar a implementar la modificación de la configuración de las notas se incluyen dentro de los archivos de script de Perl. Para ver estos ver la secuencia de comandos en un editor de texto, preferiblemente editor de texto para programadores de Perl establece en elementos de código de color (por ejemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indican dónde ajustar la secuencia de comandos para adaptarse a los cambios de formato de datos. De manera similar a los scripts de Perl, el archivo de código R proporcionado (analysis.r), que contiene las instrucciones para el trazado de las cifras de los datos de análisis de imagen, se puede leer en un editor de texto o software RStudio ver notas adicionales sobre el uso y la adaptación. Estas notas pueden ser complementados con información detallada sobre expresiones regulares y Perl &lt;sup&gt; 12 y el paquete ggplot2 13 para R, los cuales forman la base de cómo se leen los datos, anotado y se representa, respectivamente. Nuevos estudios utilizando microscopía de fluorescencia, así como datos brutos depositados en las publicaciones de código abierto son susceptibles a métodos de análisis tales como los descritos aquí. La propia naturaleza de los datos de alta contenido se presta para el análisis recursivo con diferentes énfasis analíticos en función de los intereses de investigación de cualquier observador dado. Aunque las preguntas que se pueden hacer de los datos están limitados por las sondas utilizadas originalmente, los datos de imagen a menudo pueden ser significativamente volvieron a analizar más allá del ámbito de los estudios que los generaron.

El trabajo presentado aquí describe el uso de la Profiler software Cell libremente disponible para realizar desglose algoritmo de guiado de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células adherentes para identificar las células individuales y regiones subcelulares definidos. Este enfoque, conocido como segmentación de la imagen, permite el análisis multi-paramétrico posterior de las células fotografiadas mediante la cuantificación de los marcadores marcados con fluorescencia localizadas a cada célula o región subcelular (denominado como objetos segmentados). Este flujo de trabajo es la base para permitir el análisis de alto contenido y está destinado a servir como una herramienta que pueda desarrollarse y modificarse para adaptarse a multiparamétrica, célula individual analiza en laboratorios que no tienen acceso a los instrumentos de alto contenido especializado o software propietario. Los archivos suministrados con este manuscrito se compone de un conjunto de pruebas de datos de imágenes en bruto pertinentes, configuración del algoritmo y scripts de apoyo para generar el análisis descrito. La configuración del algoritmo proporcionado fo Profiler célula están optimizados para el conjunto de datos de ejemplo y los detalles de la sección Discusión qué puede ser necesario ajustar para permitir el uso de datos de imágenes de otros estudios. Una vez que los datos cuantitativos se ha extraído usando el Perfil de la célula, los diferentes laboratorios pueden tener diferentes requisitos para el uso de la información presentada por los valores de las celdas individuales en los datos en bruto; Aquí se muestra un método por el cual las puertas se aplican a los datos en bruto para cada ensayo. El uso de estas puertas, los datos se transforman en términos binarios de respuesta, permitiendo la visualización de las tendencias enlazan diferentes tratamientos con las subpoblaciones de células que experimentan respuesta definido por las puertas. Las puertas se establecen basándose en observaciones de las distribuciones de datos obtenidos para controles positivos y negativos apropiados para cada medición relevante. El uso de puertas es sólo un ejemplo de cómo manejar las mediciones primas, basadas en células. También se muestra aquí es el uso de la intensidad del ADN nuclear míasurements en su forma cruda como un rango continuo de valores, en combinación con los datos cerrados. Se deben considerar otros enfoques para la gestión de datos de análisis de imagen, dependiendo de la naturaleza del estudio; alternativas estadísticas al uso de puertas para la asignación de las células a las subpoblaciones se han reportado 2 y sistemáticas las comparaciones de estrategias para resumir los datos de alto contenido a través de un gran número de parámetros se han reportado 3. Análisis de alto contenido de datos de imagen han encontrado uso en estudios celulares de droga-respuesta, revertir la genética y el estrés ambiental señalización 4-6. El mérito de análisis de alto contenido deriva del hecho de que el análisis algorítmico de datos de microscopía de fluorescencia permite que los parámetros cuantitativos y espaciales que deben considerarse simultáneamente a través de las células individuales 7. De esta manera, los resultados celulares para múltiples ensayos pueden ser un comportamiento referencia cruzada, diferencial de ensayo-dsubpoblaciones de células efined pueden ser rastreados en condiciones experimentales y ensayos pueden incluir la consideración de las variables morfológicas. La estrategias y análisis de flujo de trabajo discutido aquí, como para otros enfoques de alto contenido, son capaces de entregar datos multiplexados que son referencias cruzadas a las células individuales. Estudios de alto contenido de métodos traje que generan imágenes de microscopio fluorescente y que son aplicables al análisis de los datos que van desde decenas de imágenes producidas en microscopía basada en fluorescencia convencional de bajo rendimiento a través de las miles de imágenes producidas utilizando plataformas de alto contenido de detección automáticos. El flujo de trabajo se ilustra aquí con datos de ejemplo de la cual ensayos separados se miden en términos de cualquiera de las intensidades de marcadores fluorescentes nucleares o translocación citoplasmática / nuclear de una proteína fluorescente reportero, respectivamente. El flujo de trabajo es flexible en que estos ensayos se pueden considerar por separado o en combinación dependiendo de EACh dada pregunta de investigación por diferentes investigadores. Los datos de ejemplo se producen como parte de un ARN de interferencia (RNAi) experimento (Figura 1). Oligonucleótidos pequeños ARN de interferencia (siRNA) se utilizan para desmontables proteínas específicas en células de carcinoma colorrectal humano HCT116 que resultan en cambios para dos reporteros fluorescentes de quinasa (CDK) la actividad dependiente de ciclina. La fosforilación CDK6 dependiente de la proteína retinoblastoma nuclear en la serina 780 (P-S780 RB1) se evaluó mediante tinción de anticuerpos. En las mismas células, un reportero de la proteína verde fluorescente marcada de la actividad CDK2 (reportero GFP-CDK2) es evaluada por su relación núcleoicitoplasma donde en ausencia de la actividad de CDK2 el periodista reside en el núcleo y en lanzaderas de activación CDK2 en el citoplasma 8. Además, el ADN nuclear de cada célula se tiñe usando un colorante intercalante de ADN, bisbenzimide, que sirve como un medio para identificar las células y definir las fronteras núcleos en las imágenes así unasa medida de la abundancia de ADN proporcionar información sobre la posición del ciclo celular de la célula (Figura 2). Las actividades de CDK2 y CDK6 son detectables como células de tránsito de G1 a la fase S del ciclo celular 5 y suceden unos a otros 9,10 y, como tal, se espera que cerca de concordancia entre los dos reporteros en células individuales. El conjunto de datos de demostración utilizado aquí como un ejemplo analiza el efecto de siRNA dirigido a CDK6, la proteína retinoblastoma (RB1) y un control negativo no dirigido (Tabla 1). Desmontables de CDK6 debe obtener tanto una disminución de la RB1 epítopo P-S780 y una acumulación de células en la fase G1 del ciclo celular. La caída RB1 sirve como control reactivo para la especificidad del anticuerpo fosfo-S780. Imágenes de microscopio de fluorescencia de formalina fijos 11, las células de cultivo de tejidos teñidos con fluorescencia HCT116 se utilizan para análisis de imagen algorítmica. Los datos numéricos resultante se utiliza entonces parareferencias cruzadas a los reporteros y medir el impacto de los diferentes estados de derribo. El tamaño potencial de los datos producidos por este tipo de análisis puede presentar un desafío para las herramientas de análisis normales. Por ejemplo, los datos de las celdas individuales pueden ser mayores que un cierto software de hoja de cálculo tendrá en cuenta. Incluido son scripts de Perl que realizan el procesamiento simple, altamente repetitivo, supervisado de los datos para facilitar el análisis de grandes conjuntos de datos. Los scripts de Perl están escritos específicamente para los archivos de salida producidos por la célula de perfiles, al procesar archivos de imagen con una denominación de archivos específico (Figura 3), y permiten un número variable de campos por pocillo para ser utilizados en el análisis. Con frecuencia es importante a los datos de ensayo de célula individual puerta para rastrear las tendencias en las subpoblaciones de células 5 y se muestra aquí es el uso de un script Perl para marcar cada célula sobre la base de una puerta conjunto predeterminado para cada tipo de ensayo. También se incluyen los scripts de Perl opcionalesque resumen los resultados de datos para los pozos individuales (o condiciones), la entrega de: porcentaje de células dentro de la puerta de conjunto y los valores medios de las puntuaciones de ensayo primas. La forma última, más homogénea de la visualización de los datos, es válido que las respuestas afectan a la totalidad o la mayoría de las células dentro de un pozo. Como se discutió anteriormente, dicha evaluación es menos útil que la proporcionada por el gating datos célula individual donde la respuesta se limita a un subconjunto de células dentro de una población. La utilidad del flujo de trabajo descrito no se limita a la perturbación por siRNA o los ensayos de marcadores descritos. Los estudios han usado este enfoque para ensayar respuestas en experimentos de cultivo de tejidos que utilizan combinaciones de siRNA, inhibidores químicos y tratamiento de radiación y para la evaluación de marcadores distintos de la actividad de CDK2 y CDK6 5. Conceptualmente, la estrategia experimental permite una variedad de regiones subcelulares biológicamente útiles que se registra automáticamenteen las células individuales presentes en las imágenes de microscopio de fluorescencia. Como tal, este enfoque puede dar datos multiplexados revelar información cuantitativa, biológicos que pueden ser ignorados a través de técnicas que se centran en las poblaciones en lugar de las células individuales. Con modificaciones menores, el enfoque y el análisis de flujo de trabajo descrito se puede producir, datos celulares individuales cuantitativos para las salidas de ensayo basado en fluorescencia y respuestas de células biológica, donde la evaluación cuantitativa del contenido de ADN, la cuantificación de la fluorescencia nuclear o citoplásmica o la shuttling de los marcadores entre estos dos compartimentos ya sea individualmente o en forma multiplexada es de interés. Como requisitos de publicación tienden cada vez más a la presentación de los datos en bruto en acceso abierto, el acceso y la familiaridad con herramientas libres para el análisis de imágenes de microscopía, como los descritos aquí también será de interés directo para los laboratorios que buscan volver a analizar los datos publicados.

<table><tbody><tr><td>AllStars siRNA de control negativo</td><td>Qiagen 1027280</td><td></td><td>siRNA de control negativo.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Síntesis personalizada</td><td>NA</td><td>Secuencia antisentido: 5' CUCUAGGCCAGUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Síntesis personalizada</td><td>NA</td><td>Secuencia antisentido: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x tampón siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Para diluir con agua tratada sin nucleasas, sin DEPC.</td></tr><tr><td>Agua sin interrupciones (no DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>Para la dilución de tampón siRNA.</td></tr><tr><td>Lípido de transfección</td> <td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td>.</tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>medios de cultivo de tejidos suplementados con piruvato y alto contenido de glucosa.</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la mezcla paralela y compartimentada de complejos de transfección.</td></tr><tr><td>Placa Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS 6005182</td><td></td><td>placa TC de 96 pocillos con base óptica en la que se transfectan, crecen, fijan y finalmente se obtienen imágenes de las células. Se suministra con sellos de placa adhesivos opacos, que se utilizan durante el almacenamiento de placas usadas.</td></tr><tr><td>Membrana transpirable</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Membrana adhesiva estéril y permeable al gas.</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra, fijador de 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% de formalina (4% formaldehído) utilizado solo en el protocolo.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Detergente</td></tr><tr> no iónico<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma base (tris(hidroximetil)aminometano)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Para solución de lavado de placas.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-P-S780 RB1</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Monoclonal de conejo</td></tr><tr><td>AlexaFluor647</td><td>Antivitrogen</td><td>anti-conejo A21245</td><td>Anticuerpo secundario altamente adsorbido y marcado con fluorescencia.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimida)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Colorante fluorescente, intercalante de cromatina, ADN.</td></tr><tr><td>Solución de permeabilización</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1% Triton X-100 en solución salina tamponada con Tris de 50 mM, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Solución de lavado de placas</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20.</td></tr><tr><td>Solución en bloque</td><td>NA</td><td>NA 5</td><td>% de leche en polvo en solución salina tamponada Tris y 0,1% Tween-20. Para bloquear la placa antes de la inmunotinción y la dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Edición de la comunidad</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R Entorno de programación</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio Rstudio</td><td></td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de universal microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Los avances en la comprensión de los mecanismos de control que rigen el comportamiento de las células en modelos de cultivo de tejidos de mamíferos adherentes son cada vez más dependiente de los modos de análisis de una sola célula. Métodos que entregan datos compuestos que reflejan los valores medios de los biomarcadores de las poblaciones de células se arriesgan a perder la dinámica de subpoblación que reflejan la heterogeneidad del sistema biológico estudiado. De acuerdo con esto, los enfoques tradicionales están siendo sustituidos por, o compatibles con formas más sofisticadas de ensayo celular desarrolladas para permitir la evaluación por microscopía de alto contenido. Estos ensayos potencialmente generan un gran número de imágenes de biomarcadores fluorescentes, lo que permitió al acompañar a los paquetes de software propietario, permite mediciones multi-paramétricas por célula. Sin embargo, los costos de capital relativamente altos y el exceso de especialización de muchos de estos dispositivos han impedido su acceso a muchos investigadores. Descrito aquí es unaflujo de trabajo de aplicación universal para la cuantificación de múltiples intensidades marcador fluorescente de regiones subcelulares específicos de células individuales adecuados para su uso con imágenes de la mayoría de los microscopios de fluorescencia. La clave de este flujo de trabajo es la implementación del software Profiler célula libre disposición 1 para distinguir las células individuales en estas imágenes, segmento que en regiones definidas subcelulares y entregar intensidad marcador fluorescente valores específicos a estas regiones. La extracción de valores de intensidad de células individuales a partir de los datos de imagen es el propósito central de este flujo de trabajo y se ilustrará con el análisis de los datos de control de una pantalla de siRNA para los reguladores de punto de control G1 en células humanas adherentes. Sin embargo, el flujo de trabajo que aquí se presenta se puede aplicar al análisis de datos procedentes de otros medios de perturbación celular (por ejemplo, pantallas de compuestos) y otras formas de fluorescencia basada en marcadores celulares y por lo tanto deben ser útiles para una amplia gama de laboratorios.

Se presenta una informática flujo de trabajo flexible que permite un análisis basado en imágenes multiplexado de las células marcadas con fluorescencia. El flujo de trabajo cuantifica marcadores nucleares y citoplasmáticos y calcula translocación marcador entre estos compartimentos. Se proporcionan procedimientos para la perturbación de las células utilizando siRNA y metodología fiable para la detección de marcadores por inmunofluorescencia indirecta en formatos de 96 pocillos.

Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

El objetivo general de este procedimiento es medir objetivamente las respuestas de las células individuales mediante la cuantificación de intensidades específicas de marcadores fluorescentes a partir de imágenes de microscopio. Esto se logra sometiendo primero a las células de cultivo de tejidos adherentes a la descomposición de genes mediada por irna. En el segundo paso, las células se tiñen con fluorescencia y luego se obtienen imágenes para detectar varios marcadores de interés.En el paso final, la expresión de los marcadores dentro de regiones subcelulares específicas se definen algorítmicamente, son células individuales. En última instancia, las respuestas celulares a las señales biológicas de la eliminación de genes se pueden analizar midiendo los niveles de expresión fluorescente de los marcadores de interés y su translocación subcelular. Sin embargo, este procedimiento proporciona información sobre la regulación del tránsito del ciclo de una célula G en respuesta a los siRNA.También se puede aplicar a estudios que generan imágenes de células fluorescentes, estudiando el transporte nuclear y la homeostasis de proteínas. Daniel Wek y Car K HO, compañeros postdoctorados de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento y comenzarán dispensando 70 microlitros de irna de 200 nanomolares, diluidos con un tampón de irna en los pocillos apropiados de una placa estéril de 96 pocillos en una campana de cultivo de tejidos estéril. Luego agregue 105 microlitros de lípido de transfección diluido en 40 volúmenes de medio DMEM libre de suero en cada pocillo de sir a mezclar la placa mediante una suave vibración a temperatura ambiente, y luego, después de 10 minutos, subdivida los 175 microlitros resultantes en tres réplicas de 50 microlitros por objetivo en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido opaco con una base transparente.A continuación, dispense 8.000 células por pocillo en 150 microlitros de DMEM con suero al 10% directamente sobre los complejos de irna lipídico de 50 microlitros sin mezclar. A continuación, selle la placa con una membrana adhesiva estéril y transpirable y colóquela en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 48 horas después, aspire los medios de las placas.A continuación, fije las células en 100 microlitros de formaldehído tampón al 4% en una campana extractora a temperatura ambiente Después de 10 minutos, aspire el fijador y realice tres lavados de 100 microlitros con PBS después del último lavado. Retire el PBS y perfore las células con tres ciclos de incubación de solución de permeación de 100 microlitros de 10 minutos cada uno a temperatura ambiente sin agitar. Después de la última incubación, retire la solución de permeación y luego agregue 100 microlitros de solución de bloque por pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, aspire la solución en bloque y pruebe las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés dentro de las dos semanas posteriores al etiquetado del microscopio confocal uc con un objetivo de 20 x para tomar imágenes TIFF separadas en escala de grises de 16 bits en tres canales correspondientes al colorante de ADN, GFP e inmunotinción. Los Flora fours capturan muchos conjuntos de imágenes o fotogramas que no se superponen para obtener imágenes de aproximadamente 1000 a 2000 células por pocillo. Nombrar el archivo de imagen sistemáticamente con la información de metadatos para que cada nombre de archivo sea una combinación única del nombre del experimento, la dirección del pozo, el número de fotograma y el identificador de canal.A continuación, abra el software del generador de perfiles de celdas y haga clic en archivo e importación de tuberías. A continuación, en desde el archivo, seleccione el archivo de tubería CP de tubería de tres canales, que contiene las instrucciones necesarias para que el software interprete los metadatos del archivo de imagen del nombre de archivo guardado Convention Cell Profiler ahora se puede usar para relacionar las imágenes, extraer el ADN nuclear y las intensidades de anticuerpos de los archivos y usar el canal GFP para calcular la relación entre la intensidad nuclear y la del citoplasma. Para cada celda detectada, haga clic en el botón ver configuración de salida y, a continuación, haga clic en las carpetas de entrada y salida predeterminadas.Seleccionar la ubicación de los archivos de imagen para el análisis y el destino de los datos extraídos, respectivamente. A continuación, en la ventana de módulos de análisis, haga clic en los iconos de ojo apropiados para observar las ventanas de identificación de objetos primarios y terciarios durante el análisis y haga clic en analizar imágenes cuando se complete el análisis. Haga clic en Aceptar en el cuadro de mensaje y vaya a la carpeta de salida predeterminada Ubicación, donde todos los archivos de datos se guardan como archivos de valores separados por comas.Para realizar la extracción de datos, busque el nuevo archivo CSV de núcleos incluido entre la salida del perfilador de células, que contiene los datos de células individuales para la intensidad del anticuerpo nuclear fluorescente, la intensidad del ADN nuclear y los dos valores de la relación reportera GFP CDK. Copie el archivo de script de pulso proporcionado al clasificador de marcha PL en la misma carpeta que el archivo de datos CSV de los núcleos. A continuación, haga doble clic en el icono de Pearl Script.Y cuando se le solicite, escriba el nombre completo del archivo de datos seguido de un nombre de archivo CSV DOT para el archivo en el que se van a controlar las células y los valores de puerta para la fluorescencia de anticuerpos y G FP CDK dos datos reporteros. Confirme que el archivo recién creado combina los valores brutos del ensayo de celda individual sin procesar del perfil de celda original de los datos con las etiquetas de subpoblación que muestran cómo se comporta cada celda de cada pocillo con respecto a ambas puertas. Ahora abra el software R Studio para trazar los datos de cada condición experimental utilizando las etiquetas de subpoblación de celdas individuales haciendo clic en archivo y abrir archivo, y luego seleccionando el archivo de análisis punto r proporcionado.Escriba la dirección del equipo de la carpeta que contiene los datos controlados, incluida la letra de la unidad y el nombre del archivo en sí. Luego resalte las líneas del uno al 17 en la ventana superior izquierda de nuestro estudio, y haga clic en el botón de ejecución para ingresar los valores del umbral de datos experimentales y los detalles de la ubicación del pozo. Finalmente, resalte los bloques individuales del código restante debajo de la línea 17 y haga clic en el botón ejecutar para crear los gráficos correspondientes.Observe los gráficos en la ventana en la esquina inferior derecha de nuestro estudio, y luego haga clic en el botón exportar para guardarlos en una variedad de formatos. El flujo de trabajo descrito aquí analiza las imágenes del microscopio fluorescente para producir datos sin procesar en forma de una lista que detalla cada célula identificada y sus valores de ensayo correspondientes. Existen muchas opciones para el análisis de estos datos.Por ejemplo, en estos gráficos de histograma, los valores de ensayo para las células tratadas con ARN de control permiten la identificación de las puertas apropiadas para umbral de cada ensayo. A continuación, los umbrales de compuerta se aplican mediante un script de pulso para etiquetar cada celda en los datos brutos según el resultado del ensayo. Este enfoque de etiquetado ayuda a la evaluación visual preliminar, así como a la evaluación automatizada de las relaciones entre los tratamientos y la distribución de la subpoblación, incluso de conjuntos muy grandes de datos de células individuales.Por ejemplo, en este experimento representativo, las condiciones de derribo de tres irna dieron como resultado distribuciones contrastantes de las células en relación con las puertas de los dos ensayos. Los gráficos R utilizan las etiquetas para calcular las distribuciones porcentuales de las celdas de cada cuadrante. Las etiquetas también permiten cruzar mediciones fluorescentes adicionales con los datos del ensayo.En este experimento, las subpoblaciones de células tratadas con SI CDK six se agruparon de acuerdo con sus respectivas etiquetas de ensayo y se trazaron como histogramas de tinción de ADN nuclear. Este uso de las etiquetas de datos celulares revela la relación entre los dos ensayos celulares y el contenido de ADN en las células. Al realizar este procedimiento, siempre es importante recordar probar y ajustar los parámetros de segmentación de la imagen cuando se utiliza el generador de perfiles de celdas.Esto es especialmente importante cuando se utilizan archivos de imagen nuevos o no probados por primera vez. Bien.

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