Se describe un enfoque novedoso para la construcción de la lengua electrónica (eT), que simplifica enormemente el diseño y la producción de materiales de detección, y permite que la eT genere perfiles y paisajes de evolución continua para muestras en líquido. El eT obtenido es eficiente para el análisis de proteínas comunes, como la discriminación.
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Artículo de método
Lengua electrónica Generar Patrones reconocimiento continuo para el análisis de proteínas
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Resumen
Resumen
En el protocolo actual, se ha desarrollado un enfoque combinatorio para simplificar el diseño y la producción de materiales de detección para la construcción de lenguas electrónicas (eT) para el análisis de proteínas. Al mezclar un pequeño número de moléculas simples y de fácil acceso con diferentes propiedades fisicoquímicas, utilizadas como bloques de construcción (BB), en proporciones variables y controladas y permitiendo que las mezclas se autoensamblen en la superficie de oro de un prisma, se creó una matriz de superficies combinatorias con propiedades apropiadas para la detección de proteínas. De esta manera, se puede obtener un gran número de receptores de reacción cruzada de forma rápida y eficiente. Al combinar un conjunto de receptores combinatorios de reacción cruzada (CoCRR) con un sistema de detección óptica como la imagen de resonancia de plasmón de superficie (SPRi), el eT obtenido puede monitorear los eventos de unión en tiempo real y generar patrones de reconocimiento continuo, incluido el perfil de evolución continua (CEP) 2D y el paisaje de evolución continua (CEL) 3D para muestras en líquido. Un sistema eT de este tipo es eficiente para la discriminación de proteínas purificadas comunes.
Introducción
Métodos de detección de proteínas precisos y rápidos son muy importantes en el diagnóstico médico y la proteómica. Arrays de proteínas de detección de clásicos, como los biochips, se basan en el principio de reconocimiento "tecla de bloqueo-y-" y requieren receptores específicos como aptámeros, anticuerpos, o miméticos.
En los últimos años, la detección diferencial inspirado por el olfato humano y gustation ha surgido como una alternativa 1. Esta nariz electrónica / lengua enfoque (en / eT) se basa en la unión de analitos a una matriz de receptores de reacción cruzada (CRRS), que no necesitan ser muy específica o selectiva de las moléculas diana diferencial por que permitan superar la laboriosa proceso de desarrollo de receptores altamente selectivos. Es la respuesta combinada de todos los receptores que crea un patrón distinto para cada muestra, como una huella digital, lo que permite su identificación.
Los dos retos clave para el desarrollo de elecTronic nariz / lengua para la detección de proteína eficaz son la producción de elementos de detección que tienen la capacidad de distinguir entre los analitos estructuralmente similares y el sistema de transducción apropiado para el evento de unión. Hasta ahora, los estudios han reportado varios enfoques para el desarrollo matriz 2. Por ejemplo, en un estudio se desarrolló una identificación basada en matrices de proteínas usando CRRS preparados a partir de derivados de tetra-carboxyphenylporphyrin mediante el acoplamiento de los grupos carboxilo a varios aminoácidos o dipéptidos para proporcionar receptores diferenciales que poseen un núcleo hidrófobo de afinidad por las proteínas y las periferias cargadas para distintas impartir unión diferencial. Usando este sistema, diferentes proteínas y mezclas de proteínas se identificaron mediante la medición de la fluorescencia enfriamiento de los receptores de la interacción con los analitos 3,4. En otro estudio, una biblioteca de 29 CRRS tripéptido que contienen restos de ácido borónico y sintetizado de una manera combinatoria en un hexasubstituido andamio benceno fue desarrollado para la detección de proteínas con una detección colorimétrica-indicador de la absorción de 5,6. Con un diseño de este tipo, cada receptor mostró capacidad de unión diferencial con proteínas sobre la base de la varianza en los brazos de péptidos, y los ácidos borónicos asistidos en la diferenciación de las proteínas de glicoproteínas. Más recientemente, una matriz compuesta de diferentes nanopartículas de oro funcionalizadas catiónicos conjugados con un poli fluorescente aniónico polímero (p-phenyleneethynylene) (PPE) se ha creado para detectar e identificar proteínas 7. La unión competitiva entre analitos de proteínas y se extinguió PPE complejos de nanopartículas / oro fluorescencia regeneradas, produciendo patrones de reconocimiento para proteínas distintas. En este estudio, las interacciones proteína-nanopartículas funcionalizadas se sintonizan mediante la variación de las propiedades fisicoquímicas de grupos terminales de nanopartículas. Además, se ha demostrado que este enfoque es eficaz para el análisis de proteínas en un medio rico en proteína compleja y talescomo suero humano a concentraciones fisiológicamente relevantes, lo cual demuestra el potencial de eT en perfiles de muestras reales para el diagnóstico de enfermedades 8.
Aunque muy prometedores, estos sistemas tienen algunas limitaciones inherentes. Requieren el diseño y la síntesis de de 5 a 29 CRRS con estructuras muy complicadas. Además, a diferencia del sistema olfativo que se restablece después de cada medición, detección de proteínas requiere la preparación de una matriz por muestra. Finalmente, vigilancia de los eventos de unión en tiempo real son extremadamente difícil.
En este contexto, un enfoque combinatorio se propuso mediante el uso de un pequeño número de moléculas simples y de fácil acceso con diferentes propiedades fisicoquímicas (hidrófilas, hidrófobas, cargado positivamente, cargado negativamente, neutral, etc.) Como bloques de construcción (BBS) 9. Mediante la mezcla de los BB en variables y proporciones controladas y permitiendo que las mezclas que se auto-ensamblan en la superficie de oro de unprisma, se ha creado una serie de superficies combinatorias que ofrece propiedades adecuadas para la unión a proteínas. En particular, las monocapas auto-ensambladas en este sistema permiten una fácil puesta a punto de una gama de propiedades de la superficie de una manera muy divergentes, lo que permite diversos receptores de reacción cruzada combinatorias (CoCRRs) para ser producido con rapidez y eficacia. Detección de proteínas se realizó utilizando un sistema de detección óptica, la superficie de formación de imágenes por resonancia de plasmón (SPRI). En pocas palabras, un amplio haz monocromático de luz polarizada a partir de un LED se ilumina toda la zona CoCRR matriz en la superficie del prisma. Una cámara de video CCD de alta resolución proporciona imágenes de diferencia en tiempo real a través de todos los puntos de la matriz CoCRR. Captura todos los cambios locales en la superficie de la matriz CoCRR proporcionar información detallada sobre los eventos de unión y procesos cinéticos 10. Mientras tanto, con la ayuda de software de imágenes, imágenes SPR correspondientes a los puntos se convierten automáticamente a las variaciones de reflectividad versus tiempo, generando una serie de curvas de unión cinéticos llamados sensogramas. Por lo tanto, SPRI permite una observación libre de etiquetas, síncrono, paralelo y en tiempo real de los eventos de unión. Además, la matriz CoCRR obtenido es regenerable y reutilizable para el análisis de proteínas.
Este protocolo describe la construcción de la lengua electrónica mediante el uso de sólo dos moléculas pequeñas como bloques de construcción e ilustra su aplicación para el análisis de proteínas comunes basados en patrones de reconocimiento continuas obtenidas con SPRI.
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Protocolo
1 Preparación de diferentes soluciones y muestras de proteínas
- Preparar 100 ml de solución tampón de fosfato (PBS-T) que contiene 50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 50 mM, y 10% de glicerol a pH 6,8.
- Preparar 250 ml de solución tampón HEPES que contiene HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de Tween 20 a pH 7,4.
- Preparar la solución madre de bloque de construcción 1 (BB1) bloque de la lactosa y la construcción de 2 (BB2) sulfatado lactosa (Figura 1) en el 0,2 mM en PBS-T.
- Preparar 1 ml de las soluciones de proteína en HEPES: una lectina hypogaea raquis (AHL) a 500 nm, la mioglobina en 1 m, y lisozima a 500 nM.
- Preparar 20 ml de SDS al 1% en agua ultrapura.
2 Preparación de la matriz CoCRR
- Limpie la superficie de oro del prisma de 48 horas antes de su uso con un limpiador de plasma durante 3 minutos bajo estas condiciones: 75% de oxígeno, 25% de argón, 0,6 mbar, potencia de 40 W.
- Preparar once solutio puros y mixtosns de BB1 y BB2 con [BB1] / ([BB1] + [BB2]) proporciones entre 0 y 100% en incrementos de 10% a una concentración total de BB 0,1 mM en PBS-T.
- Depósito 8 gotas nl de estas soluciones puras y mixtas sobre la superficie del prisma utilizando un observador sin contacto por cuadruplicado para cada relación con 44 puntos en total (Figura 2).
NOTA: 10% de glicerol agregado en PBS-T es muy importante para reducir la evaporación del disolvente y el cambio de concentración BB después de la deposición. - Coloque el prisma interior de una placa de Petri que contiene 1 ml de agua ultrapura y dejarlo O / N a temperatura ambiente durante autoensamblaje de BB1 y BB2 en la superficie de oro. Aquí, se supone que la composición media de la superficie en el SAM mixta refleja la composición de la solución mixta de deposición (Figura 3) 11.
- Lavar a fondo el prisma con agua ultrapura y luego secarlo bajo un flujo de argón.
3. Proteína Sensing por SPRI
- Ajuste el incubator en la que el aparato de SPRI se coloca a 25 ° C para evitar los cambios del índice de refracción inducidos por la variación de la temperatura durante la detección de proteínas.
- Insertar un prisma no funcionalizado de enjuague en el 10 l poliéter éter cetona (PEEK) celular conectado a una bomba de jeringa controlada por ordenador, un desgasificador y una válvula de inyección de presión media de 6 puertos de flujo (Figura 4). Rellene el sistema de flujo de recién filtrada y desgasificada corriendo HEPES tampón.
- Retire el prisma de enjuague e inserte el prisma que contiene la matriz CoCRR en la celda de flujo. Ejecutar HEPES a un / caudal min 100 l. Con la ayuda de la cámara CCD eliminar las burbujas de aire presentes en la superficie del prisma pasando tampón en funcionamiento rápidamente.
- Definir área de estudio para cada terreno dibujando un círculo con el mismo diámetro de la zona de interés sobre la base de una imagen bien contrastada-de la matriz y con la ayuda de software integrado en el sistema de SPRI.
- Trazar las curvas de plasmones, que representan reflejarIVITY curvas en función del ángulo de incidencia, para todos los puntos.
- Elija el ángulo (posición en la que se registrarán las curvas cinéticas) trabajando al más alto pendiente de las curvas de reflectividad. Gire el espejo de exploración para fijar el ángulo de trabajo seleccionado para mediciones cinéticas.
- Continuar para ejecutar HEPES a través del sistema de flujo hasta que la señal de reflectividad para todos los puntos es estable y constante.
- Inyectar 1 ml solución AHL con una jeringa en el bucle de la muestra (500 l) con la válvula de inyección en posición de "carga". A continuación, poner la válvula de inyección a la posición "inyección". La tasa de flujo utilizado para toda la inyección de proteína fue de 100 l / min.
- Iniciar mediciones cinéticas por vigilar las variaciones de reflectividad en función del tiempo de forma simultánea en todos los lugares.
- Al final de la inyección de la proteína, enjuagar la matriz con tampón de corrida durante 8 min. Por último, se inyecta 1 ml de SDS al 1% para regenerarla.
- Repita el mismo procedimiento para el otro proteins.
4. Procesamiento y Análisis de Datos
- Después de la entrada de la solución de proteína en la célula de flujo, de unión molecular se produce e induce un desplazamiento de las curvas de plasmones y una variación de la reflectividad. El software de adquisición de imágenes convierte los valores de intensidad de luz medidos a gris niveles de escala, dando imágenes SPR Figura 5A, y genera la variación de la reflectividad en función del tiempo, dando sensogramas (Figura 5B).
- Utilice un software de cálculo matemático para representar la reflectividad (R%) al final de cada inyección de proteínas en comparación con el [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Relación de generar el perfil 2D continua evolución (CEP) para cada muestra (Figura 5C).
- Añadir el [BB1] / ([BB1] + [BB2]) en relación sensogramas (Figura 5B) para generar 3D paisaje continua evolución (CEL) para cada proteína (Figura 5D).
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Resultados
Para probar la capacidad de la lengua electrónica para el análisis de proteínas común, se utilizaron tres proteínas: AHL, mioglobina y lisozima. Para cada proteína, un perfil continuo 2D distinta evolución, CEP, fue generada por el ET, como se muestra en la Figura 6.
Además, gracias a SPRI, que es capaz de controlar el tiempo real de adsorción y desorción cinética, para cada proteína un tiempo patrón de reconocimiento continuo dependientes, llamados 3D paisaje continua evolu...
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Discusión
Los pasos más críticos para la construcción de este eT están dedicados a asegurar una buena reproducibilidad del sistema. Por ejemplo, la limpieza de la superficie de oro del prisma con un procedimiento estandarizado antes de su uso, la adición de 10% de glicerol en los once soluciones puras y mixtas de BB1 y BB2 para eliminar la evaporación del disolvente durante BBs auto-montaje en la superficie de oro del prisma, depositar múltiples repeticiones para cada [BB1] / ([BB1] + [BB2]) relación, etc. Como p...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la beca de doctorado de LANEF en Grenoble por su apoyo a Laurie-Amandine Garçon. Este trabajo fue financiado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (beca ANR 06-NANO-045).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aparato SPRi | de Horiba Scientific-GenOptics | se coloca en una incubadora con temperatura regulada a 25 °C. | |
| Incubadora | Memmert | ||
| Bomba de jeringa | Instrumentos científicos | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| válvula de inyección de presión media de 6 puertos | Upchurch Scientific | El volumen de bucle de inyección utilizado es de 500 µl. | |
| Limpiador de plasma Femto (versión 7) | Diener Sistema electrónico | de desgasificación en línea con 2 canales. | |
| Spotter | Siliflow | es un observador piezoeléctrico sin contacto. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | El prisma está hecho de un prisma de vidrio de alto índice de refracción recubierto con una fina película de oro (45 nm) y especialmente desarrollado para fines de imagen. |
| Erythrina cristagalli lectina | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Mioglobina | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Proporcionado por el Dr. Hugues Lortat-Jacob; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9 | ||
| CXCL12γ | Proporcionado por el Dr. Hugues Lortat-Jacob; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9 | ||
| Lactosa | Proporcionada por el Prof. David Bonnaff; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9 | ||
| Lactosa | Proporcionada por el Prof. David Bonnaff; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9 | ||
| Glicerol | SDS Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Sigma-Aldrich | L4509 | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S3014 |
Referencias
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
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Reimpresiones y permisos
