Lengua electrónica Generar Patrones reconocimiento continuo para el análisis de proteínas

Summary

Se describe un enfoque novedoso para la construcción de la lengua electrónica (eT), que simplifica enormemente el diseño y la producción de materiales de detección, y permite que la eT genere perfiles y paisajes de evolución continua para muestras en líquido. El eT obtenido es eficiente para el análisis de proteínas comunes, como la discriminación.

Abstract

En el protocolo actual, se ha desarrollado un enfoque combinatorio para simplificar el diseño y la producción de materiales de detección para la construcción de lenguas electrónicas (eT) para el análisis de proteínas. Al mezclar un pequeño número de moléculas simples y de fácil acceso con diferentes propiedades fisicoquímicas, utilizadas como bloques de construcción (BB), en proporciones variables y controladas y permitiendo que las mezclas se autoensamblen en la superficie de oro de un prisma, se creó una matriz de superficies combinatorias con propiedades apropiadas para la detección de proteínas. De esta manera, se puede obtener un gran número de receptores de reacción cruzada de forma rápida y eficiente. Al combinar un conjunto de receptores combinatorios de reacción cruzada (CoCRR) con un sistema de detección óptica como la imagen de resonancia de plasmón de superficie (SPRi), el eT obtenido puede monitorear los eventos de unión en tiempo real y generar patrones de reconocimiento continuo, incluido el perfil de evolución continua (CEP) 2D y el paisaje de evolución continua (CEL) 3D para muestras en líquido. Un sistema eT de este tipo es eficiente para la discriminación de proteínas purificadas comunes.

Introduction

Métodos de detección de proteínas precisos y rápidos son muy importantes en el diagnóstico médico y la proteómica. Arrays de proteínas de detección de clásicos, como los biochips, se basan en el principio de reconocimiento "tecla de bloqueo-y-" y requieren receptores específicos como aptámeros, anticuerpos, o miméticos.

En los últimos años, la detección diferencial inspirado por el olfato humano y gustation ha surgido como una alternativa ^1. Esta nariz electrónica / lengua enfoque (en / eT) se basa en la unión de analitos a una matriz de receptores de reacción cruzada (CRRS), que no necesitan ser muy específica o selectiva de l....

Protocol

1 Preparación de diferentes soluciones y muestras de proteínas

1. Preparar 100 ml de solución tampón de fosfato (PBS-T) que contiene 50 mM NaH ₂ PO _4, NaCl 50 mM, y 10% de glicerol a pH 6,8.
2. Preparar 250 ml de solución tampón HEPES que contiene HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% de Tween 20 a pH 7,4.
3. Preparar la solución madre de bloque de construcción 1 (BB1) bloque de la lactosa y la construcción de 2 (BB2) sulfatado lactosa (Figura 1) en el 0,2 mM en PBS-T.
4. Preparar 1 ml de las soluciones de proteína en HEPES: una lectina hypogaea raquis (AHL) a 500 nm, la mioglobina en 1 m, y liso....

Results

Para probar la capacidad de la lengua electrónica para el análisis de proteínas común, se utilizaron tres proteínas: AHL, mioglobina y lisozima. Para cada proteína, un perfil continuo 2D distinta evolución, CEP, fue generada por el ET, como se muestra en la Figura 6.

Además, gracias a SPRI, que es capaz de controlar el tiempo real de adsorción y desorción cinética, para cada proteína un tiempo patrón de reconocimiento continuo dependientes, llamados 3D paisaje continua evolu.......

Discussion

Los pasos más críticos para la construcción de este eT están dedicados a asegurar una buena reproducibilidad del sistema. Por ejemplo, la limpieza de la superficie de oro del prisma con un procedimiento estandarizado antes de su uso, la adición de 10% de glicerol en los once soluciones puras y mixtas de BB1 ​​y BB2 para eliminar la evaporación del disolvente durante BBs auto-montaje en la superficie de oro del prisma, depositar múltiples repeticiones para cada [BB1] / ([BB1] + [BB2]) relación, etc. Como p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aparato SPRi	de Horiba Scientific-GenOptics		se coloca en una incubadora con temperatura regulada a 25 °C.
Incubadora	Memmert
Bomba de jeringa	Instrumentos científicos	Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser	Alltech	AT590507
válvula de inyección de presión media de 6 puertos	Upchurch Scientific		El volumen de bucle de inyección utilizado es de 500 µl.
Limpiador de plasma Femto (versión 7)	Diener Sistema electrónico		de desgasificación en línea con 2 canales.
Spotter	Siliflow		es un observador piezoeléctrico sin contacto.
SPRi-Biochip	Horiba Scientific-GenOptics	36000067	El prisma está hecho de un prisma de vidrio de alto índice de refracción recubierto con una fina película de oro (45 nm) y especialmente desarrollado para fines de imagen.
Erythrina cristagalli lectina	Sigma-Aldrich	L5390
Arachis hypogaea lectin	Sigma-Aldrich	L0881
Mioglobina	Sigma-Aldrich	M1882
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876
CXCL12α			Proporcionado por el Dr. Hugues Lortat-Jacob; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9
CXCL12γ			Proporcionado por el Dr. Hugues Lortat-Jacob; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9
Lactosa			Proporcionada por el Prof. David Bonnaff; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9
Lactosa			Proporcionada por el Prof. David Bonnaff; para detalles de preparación, consulte la información de apoyo en la referencia 9
Glicerol	SDS Sigma-Aldrich	G5150
	Sigma-Aldrich	L4509
Tween 20	Sigma-Aldrich	274348
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Fosfato de sodio monobásico	Sigma-Aldrich	S0751
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S3014