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Artículo de método

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

11.8K vistas

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DOI:

10.3791/51902

⸱

6 de octubre de 2014

 , 
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

En este artículo

Resumen

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

Resumen

El uso generalizado de la Next Generation Sequencing ha abierto nuevas vías para la investigación y el diagnóstico de cáncer. NGS traerá enormes cantidades de nuevos datos sobre el cáncer, y especialmente la genética del cáncer. Los conocimientos actuales y futuros descubrimientos harán necesario estudiar un gran número de genes que podrían estar implicados en la predisposición genética al cáncer. En este sentido, hemos desarrollado un diseño Nextera para estudiar 11 genes completos implicadas en la reparación el daño del ADN. Este protocolo fue desarrollado para estudiar con seguridad 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, y TP53) del promotor de 3'-UTR en 24 pacientes simultáneamente. Este protocolo, basado en la tecnología de transposasa y enriquecimiento gDNA, da una gran ventaja en términos de tiempo para el diagnóstico genético gracias a la muestra de multiplexación. Este protocolo se puede utilizar de manera segura con gDNA sangre.

Introducción

En 2010, cerca de 1,5 millones de personas (fundamentalmente mujeres) desarrollaron cáncer de mama en todo el mundo. Se estima que del 5 al 10% de estos casos eran hereditarios. Hace casi 20 años, BRCA1 y BRCA2 fueron identificados como implicados en la mama hereditario y el cáncer de ovario 1. Desde hace unos 15 años, las regiones de codificación de BRCA1 y BRCA2 han sido secuenciados para determinar la predisposición genética al cáncer de mama y ovario. Las alteraciones en los genes BRCA1 y BRCA2 se detectan en el 10 a 20% de las familias seleccionadas 2 sugieren que el análisis de estas regiones no es suficiente para la detección eficaz. Recientemente, el análisis de las secuencias no codificantes (promotor, intrones, 3-'UTR) de BRCA1 y BRCA2 destacó que las nuevas mutaciones / variantes podrían estar relacionados con un mayor riesgo de cáncer de mama 3-6.

Proteínas BRCA1 y BRCA2 están implicados en la reparación de recombinación homóloga (HHR), que se completa con numerosos socios 7. Mientras que las alteraciones en los genes BRCA1 o BRCA2 inducen defectos en la reparación del ADN, los otros socios también pueden afectar el riesgo de cáncer de seno. Esta hipótesis parece haber sido validada desde BRIP1 8 y 9 PALB2 tener un impacto demostrado sobre el cáncer de cuello de útero y de mama, respectivamente. Además, otros dos genes de susceptibilidad al cáncer de mama "riesgo moderado", ATM y CHEK2, también pueden ser estudiados de forma rutinaria 10.

A raíz de estos estudios, decidimos desarrollar un protocolo para analizar 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 y TP53) en 24 pacientes simultáneamente usando un muy fácil y relativamente protocolo rápido basado en la tecnología de la transposasa, con el enriquecimiento y la secuenciación en un dispositivo de rendimiento medio. Graciasa esta técnica, hemos secuenciado genes completos desde el inicio del promotor hasta el final de 3'-UTR, a excepción de RAP80, para los que no estaba cubierto de una región intrónica de 2500 pb (chr5: 176,381,588-176,390,180). Esto representa un total de aproximadamente 1.000.300 pb estudiado con 2.734 sondas. Por lo general, BRCA1 y BRCA2 exonic secuencias se analizan por secuenciación de Sanger, que necesita 1,5 meses por menos de 20 pacientes. Con el presente protocolo (Figura 1), en el mismo tiempo, se pudieron analizar 11 genes completas para más de 75 pacientes.

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Protocolo

1. Evaluación de ADNg (ADN genómico) Rendimiento

  1. Cuantificar recién extraída gDNA antes de la preparación de la biblioteca. Utilice el método de evaluación del rendimiento fluorométrico cuantificar gDNA intacta (evitar el uso de un espectrofotómetro para la evaluación de rendimiento gDNA). Mida el (260/280 nm) Relación y asegúrese de que está entre 1.8 y 2 NOTA: 50 ng de gDNA se requieren para el experimento.

2. gDNA Enriquecimiento: Día 1, Mañana

  1. Antes de arrancar
    1. Desde el equipo de enriquecimiento de ADN (véase la Tabla de Materiales / Equipos), deshielo tampón ADN (TD) y soluciones de enzima ADN (tde1) en el hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación y detener objetivo (ST) de tampón a la temperatura ambiente (TA). Añadir 20 l de muestra gDNA en 2-2,5 ng / l directamente en una placa de 96 pocillos, 1 bien por muestra. IMPORTANTE: Utilice un control positivo para validar el protocolo (muestra con conocida variación de la secuencia).
  2. Tagmentation
    1. Mix todos los reactivos bien, invirtiendo 5x, y centrifugar brevemente. A RT, se añaden 25 l de tampón TD a cada pocillo que contenía 50 ng (20 l) de ADNg, y luego 5 l de tampón de tde1. Establecer pipeta para 50 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
    2. Cubrir la placa con una película adhesiva y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Luego, coloque la placa en un termociclador (cubierta calentada a 100 ° C) y ejecutar el siguiente programa: 55 ° C durante 5 min y 10 ° C durante un tiempo ilimitado.
    3. Durante esta incubación, preparar la muestra de hoja con el software Experimento Manager para definir los índices que se utilizarán.
  3. Tagmentation Purificación
    NOTA: Este paso es fundamental. Tenga mucho cuidado.
    1. Compruebe la ausencia de precipitado en perlas magnéticas de purificación y tampón ST. Si precipitados están presentes, calentar soluciones en las manos. Tampón de resuspensión Deshielo (RSB) en hielo.
    2. A temperatura ambiente, la solución ST vórtice y añadir15 l a cada pocillo de muestra que contiene. Establecer pipeta a 65 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 5 min a TA. Cubrir la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    3. Añadir 52 l de perlas magnéticas de purificación previamente mezcladas en cada pocillo. Establecer pipeta a 117 l, suavemente pipetear todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 10 min a TA. Cubrir la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    4. Retire la película adhesiva. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 2 minutos a RT. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro.
    5. Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 24 muestras, añadir 2 ml de agua destilada a 8 ml de etanol). Retire y deseche el sobrenadante con cuidado de no molestar a los granos.
    6. Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante al menos 30 sega temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado por segunda vez. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 10 min o hasta la completa evaporación de etanol.
    7. Retirar la placa de la base magnética y añadir 22,5 l de tampón RSB. Establezca la pipeta a 22,5 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Transferir suavemente 20 l del sobrenadante en una nueva placa de 96 pocillos.
      NOTA: Opcionalmente, determinar el tamaño de las muestras tagmented mediante el uso de un analizador de fragmento. En lugar de los pasos mencionados anteriormente, el uso de alta resolución electroforesis en gel de acrilamida. Los fragmentos deben ser entre 150 pb y 1000 pb.
  4. 1 st Amplificación por PCR
    1. Descongele la mezcla maestra de PCR que contiene la polimerasa (LP-PMM), Índice 1 imprimación, y el Índice de 2 soluciones de imprimación sobre hielo. Coincidir con la combinación oíndices f con la hoja de muestra Experiment Manager. Para multiplexación, preparar diferentes i7 de índice 1 (i7, N7xx) para cada muestra.
    2. En cada pocillo, añadir 20 l de LP-PMM, 5 l de índice 1, y 5 l de índice 2 Ajuste la pipeta de 50 l, con cuidado la pipeta todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Cubrir la placa con una película adhesiva Microseal. Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 1 (Tabla 1).
      NOTA: el procedimiento puede detenerse en este punto y las reacciones almacenó durante la noche en el termociclador o durante 2 días entre 2 y 8 ° C.

3. gDNA Enriquecimiento: Día 1, Tarde

  1. Antes de arrancar
    1. Oligos Descongelar (OSC), la captura de amortiguamiento objetivo 1 (NCT1), y soluciones RSB en el hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación a RT.
  2. La purificación de PCR
    1. Centrifugar la placa de la etapa 2.4, durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    2. En RT, añadir 45 l de perlas magnéticas de purificación mixta en cada pocillo. Establezca la pipeta a 95 l, suavemente pipetear todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 10 min a TA. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 2 minutos a RT.
    3. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 24 muestras, añadir 2 ml de agua destilada a 8 ml de etanol). Desechar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.
    4. Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado por segunda vez. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Retirar la placa de la base magnética y añadir 40 l de tampón RSB. Ajuste el tubotte de 40 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
    6. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 2 min. El sobrenadante debería aparecer completamente claro. Transferir suavemente 38 l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.
    7. Determinar el rendimiento de cada muestra por un método fluorimétrico. Esta primera parte del protocolo se validará si los rendimientos evaluados son entre 30 y 50 ng / l.
  3. 1 st Hibridación
    1. La piscina en hasta 12 muestras por grupo en esta etapa mediante la mezcla de 500 ng de cada muestra en una nueva placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el volumen final de cada grupo no exceda de 40 l.
      NOTA: Si es necesario, disminuir el volumen de piscinas mediante el uso de un dispositivo concentrador de vacío a temperatura ambiente (Precaución: la concentración de ADN no puede ser modificado por calentamiento, incluso a 30 ° C como calentamiento provoca la degradación del ADN). Ajustar el volumen final a 40 l mediante la adición de solución de RSB.
    2. Mezclar bien laSolución NCT1. Para cada pocillo que contenía 40 l de muestras de ADN agrupados, añadir 50 l de NCT1, y 10 l de las OSC. Establezca la pipeta para 100 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 2 (Tabla 1).

4. gDNA Enriquecimiento: Día 2, por la mañana

  1. Antes de arrancar
    1. Desde el equipo de enriquecimiento de ADN (véase la Tabla de Materiales / Equipos) deshielo 2 N NaOH (HP3), objetivo tampón de elución 1 (ET1), meta tampón de elución 1 ET2, perlas magnéticas de estreptavidina (SMB), solución de lavado 1 (WS1), lavado solución 2 (WS2), solución de lavado 3 (WS3), soluciones de las OSC, y NCT1 a TA.
  2. 1 st Hibridación Wash
    1. Retire la placa de 96 pocillos del termociclador y centrifugar 1 min a 280 xg a 20 ° C. Quite la cubierta adhesiva muy carefully.
    2. Transferir la mezcla de reacción de 100 l de la placa a una nueva placa de 96 pocillos MIDI y añadir 250 l de solución de SMB bien agitada vorticialmente. Establezca la pipeta para 350 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa e incubar a TA durante 30 min.
    3. Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C, retire el sello adhesivo y coloque la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
    4. Añadir 200 l de solución de WS1 bien mezclada en las perlas, así que contienen. Establecer la pipeta para 200 l y suavemente pipetear el volumen entero arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma.
    5. Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
    6. Añadir 200 l de solución de WS2 bien mezclada en pozos contaperlas inación. Establezca la pipeta para 200 l pipeta y suavemente todo el volumen arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma.
    7. Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Descartar el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
    8. Añadir 200 l de solución WS2 bien mezclado en los pozos que contienen los granos. Establezca la pipeta para 200 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x.
    9. Transferir todo el volumen en una nueva placa de 96 pocillos. Sellar la placa y colocar la placa en un termociclador (cubierta calienta a 100 ° C). Inicie el termociclador a 42 ° C durante 30 min.
    10. Colocar imediately la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retire el sello y deseche inmediatamente todas las sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético.
    11. Añadir 200 l de WS2 en los pozos que contienen los granos. Establezca la pipeta para 200l pipeta y suavemente todo el volumen arriba y abajo 15x evitando la formación de burbujas / espuma. Sellar la placa y colocar la placa en un termociclador (cubierta calienta a 100 ° C). Inicie el termociclador a 42 ° C durante 30 min.
    12. Inmediatamente colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retire el sello y deseche inmediatamente todas las sobrenadante. A continuación, retire la placa del soporte magnético.
    13. Añadir 200 l de solución de WS3 bien mezclada en los pocillos que contenían perlas. Establezca la pipeta para 200 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x.
    14. Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Deseche todo el sobrenadante y retire la placa del soporte magnético.
    15. Repita el WS3 lavar por segunda vez.
    16. Después de retirar el sobrenadante, sellar la placa y centrifugar brevemente para derribar sobrenadante residual. Colocar la placa enel soporte magnético durante 2 min. Descartar el sobrenadante residual.
    17. En un tubo de 0,2 ml, mezclar 28,5 l de ET1 y 1,5 l de soluciones HP3. Esta mezcla es de 1 piscina, si se preparan más piscinas, multiplicar estos volúmenes por el número de piscinas preparadas.
    18. Retire la placa del soporte magnético. Añadir 23 l de la mezcla preparada anteriormente. Establezca la pipeta a 23 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 15x. Sellar la placa y dejar durante 5 min a TA. Centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    19. Colocar la placa en el soporte magnético durante 2 min. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro. Retirar la película adhesiva y la transferencia de 21 l de sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.
    20. Añadir 4 l de solución de ET2 a cada pocillo. Establezca la pipeta a 25 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo de 10x y sellar la placa.
      NOTA: el procedimiento puede detenerse en este punto y las reacciones almacenar durante un máximo de 7 días a -15 ° C. Si la placa está congelado, descongelar completamente antes de iniciar la hibridación 2 nd.
  3. 2 º La hibridación
    1. Se centrifuga la placa durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Retire la película adhesiva y añadir 50 l de NCT1, 10 l de las OSC, y 15 l de agua de grado PCR a los 25 l de biblioteca. Establezca la pipeta para 100 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces.
    2. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    3. Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 2 (Tabla 1).

5. gDNA Enriquecimiento: Día 2, por la tarde

  1. Antes de arrancar
    1. Descongele ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 y soluciones HP3 a TA para lavado de hibridación. Desde el kit de enriquecimiento de ADN, PCR descongelar mezcla maestra que contiene la polimerasa (TC-PMM), cóctel de PCR de cebador (PPC), y soluciones RSB en hielo durante la amplificación por PCR.
  2. 2 º La hibridación de lavado
    1. Siga exactamente el mismo protocolo que el 4,2 - 1 er lavado de hibridación.
  3. Amplificación por PCR
    1. En una nueva placa de 96 pocillos, mezclar 20 l de elución de la etapa 5.2, 25 l de TC-PMM y 5 l de PPC. Establezca la pipeta a 50 l y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C.
    2. Colocar la placa en un termociclador (cubierta se calienta a 100 ° C) y el programa de ejecución 3 (Tabla 1).

6. gDNA Enriquecimiento: Día 3

  1. Antes de arrancar
    1. RSB solución de descongelación en hielo. Por lo menos 30 minutos antes de su uso, llevar cuentas magnéticas de purificación a RT.
  2. La purificación de PCR
    1. Se centrifuga la placa del paso 5.3 por 1 min a 280 xg a 20 ° C, y retire la cubierta adhesiva.
    2. A temperatura ambiente, añadir 90 l de pestaba viendo anteriormente mezclado perlas magnéticas de purificación en cada pocillo. Establezca la pipeta a 140 l, una pipeta suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. Incubar durante 15 min a TA. Coloque la placa de 96 pocillos en un soporte magnético durante 5 min a RT. Asegúrese de que el sobrenadante aparece completamente claro.
    3. Preparar una solución fresca de etanol 80% (para 2 muestras, añadir 200 l de agua destilada a 800 l de etanol). Desechar el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento.
    4. Mientras se mantiene la placa en el soporte magnético, añadir 200 l de etanol 80% recién preparada a cada pocillo sin perturbar las perlas y se incuba la placa durante 30 segundos a TA. Descartar el sobrenadante y repetir este lavado una vez más. Asegúrese de que el etanol se ha eliminado. Dejar secar a temperatura ambiente durante 15 min o hasta la completa evaporación de etanol mientras que la placa está en el soporte magnético.
    5. Retirar la placa de la base magnética y añadir 30 l de tampón RSB. Establezca la pipeta para 30 l, y suavemente la pipeta ttodo él de volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar la placa durante 2 min a TA.
    6. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte magnético y se incuba durante 5 min o hasta que el sobrenadante aparece completamente claro. Transferir suavemente 28 l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos (tipo de placa: TCY).
      NOTA: El procedimiento puede interrumpirse en esta fase y las reacciones se almacena a -15 ° C durante un máximo de 7 días.
  3. Biblioteca de Validación y Cuantificación
    1. Determinar la calidad de la biblioteca mediante el uso de un analizador de fragmento. Alta resolución de electroforesis en gel de acrilamida puede ser usado para reemplazar los pasos mencionados anteriormente, pero no se recomienda. Los fragmentos deben ser entre 150 pb y 1000 pb.
      NOTA: Recomendado: Cuantificar la biblioteca por qPCR para obtener el mejor número de racimos durante la secuenciación.
    2. Como referencia, utilizar una biblioteca validado (2 nM). Si se prepara la primera biblioteca, utilizar el fago PhiX ADN (10 nM) proporcionado para la calibración del sequencing dispositivo.
    3. Preparar diluciones seriadas del control positivo de obtener 7 puntos a 20, 16, 8, 6, 4, 2, y 13:00 en EBT (EB elución buffer de + 0,1% Tween 20). Diluir la biblioteca de interés en 1/1000 y 1/2000. Cada punto debe ser analizado por triplicado.
    4. Preparar la siguiente mezcla (volúmenes se multiplican por el número de pozos se utiliza): para 1 pocillo, añadir 10 l de SYBR Green contienen mezcla maestra qPCR (2x), 0,2 l de cebador directo (10 micras, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0,2 l de cebador inverso (10 M, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), y 7,6 l de agua de grado PCR.
    5. Después de mezclar, deponer en una placa de 96 pocillos, 18 l de mezcla en cada pocillo y 2 l de diluciones de control y de biblioteca positivos. Sellar la placa y centrifugar durante 1 min a 280 xg a 20 ° C. Luego, coloque la placa en un termociclador de PCR cuantitativa programa y ejecutar 4 (Tabla 1).
    6. Analizar los resultados como la cuantificación absoluta convencional para obtener el rendimiento de cada library. La ventaja de qPCR es que sólo se cuantifica de ADN que van a interactuar con la célula de flujo.
      NOTA: No utilice la cuantificación fluorimétrica de ADN debido a la presencia de moléculas miméticas de ADN en uno de los reactivos. Este método de cuantificación sería sobreestimar el rendimiento de la biblioteca y, en consecuencia subestimar la puntuación agrupación.
  4. Lanzamiento de Secuenciación
    1. Diluir cada biblioteca a 4 nM en un volumen final de 30 l de tampón de elución (EB), y poner en común todas las bibliotecas y mezclar bien.
    2. Prepare una nueva solución 0,2 N de NaOH en tampón EB y mezclar 10 l de esta solución de NaOH con 10 l de bibliotecas agrupadas. Mezclar bien e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Después de la 5 min, añadir inmediatamente 980 l de tampón de hibridación (de cartucho de secuenciación) y mezclar bien. Entonces, la mezcla 400 l de esta mezcla con 600 l de tampón de hibridación. Mezclar bien y transferir 600 l en un cartucho 300 de ciclo (2 x 150) para una inyección de 8pM. Secuenciación lanzamiento.

Análisis 7. Datos

  1. Una vez que el dispositivo ha procesado los datos, transferir el .bam y archivos .vcf a un equipo nuevo.
    NOTA: la fragmentación transposasa incorpora huellas. En consecuencia, el software recorta automáticamente estos datos.
  2. Recoge las variaciones genéticas obtenidas con el análisis del dispositivo.
  3. Analizar archivos exportados (.bam, .vcf) con otro software (Alamut) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, comparar las variaciones genéticas obtenidas con ambos análisis. Sólo dos veces variaciones detectadas se consideran presentes.

Tabla 1. condiciones de PCR

Programa Temperatura Tiempo Num. de repeticiones
1 72 ° C 3 min 1
98 ° C 30 seg 1
98 ° C 10 seg 10
60 ° C 30 seg
72 ° C 30 seg
72 ° C 5 min 1
10 ° C ilimitada
2 95 ° C 10 min 1
93 ° C 1 min 1
91 ° C 1 min 1
89 ° C 1 min 1
87 ° C 1 min 1
85 ° C 1 min 1
83 ° C 1 min 1
81 ° C 1 min 1
79 ° C 1 min 1
77 ° C 1 min 1
75 ° C 1 min 1
71 ° C 1 min 1
69 ° C 1 min 1
67 ° C 1 min 1
65 ° C 1 min 1
63 ° C 1 min 1
61 ° C 1 min 1
59 ° C 1 min 1
58 ° C 1 min 16-18 h
3 98 ° C 30 seg 1
98 ° C 10 seg 10
60 ° C 30 seg
72 ° C 30 seg
72 ° C 5 min 1
10 ° C ilimitada
4 95 ° C 10 min 1
95 ° C 15 seg 40
60 ° C 1 min

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Resultados

Resultados del control de calidad de la muestra

La capacidad de este método para determinar secuencias de genes diana se basa en la calidad de la ADNg (Figura 2A) y la calidad de la etapa de tagmentation. Si el tagmentation no es suficiente (Figura 2B, panel superior), la secuenciación no será satisfactoria. Como se mencionó anteriormente, después de la purificación tagmentation, el gDNA debe tagmented en fragmentos de 150 pb a 1000 pb con la mayoría de los fra...

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Discusión

El uso generalizado de dispositivos y tecnologías NGS ha proporcionado nuevas oportunidades en el estudio del cáncer y los trastornos genéticos. Además de la secuenciación del genoma entero o secuenciación de ARN, el análisis de una gran cantidad de secuencias de gDNA seleccionados en numerosos pacientes simultáneamente ofrece grandes perspectivas en el diagnóstico. Aquí, hemos desarrollado un diseño específico (disponible bajo demanda) utilizando la tecnología Nextera para estudiar 11 genes completos en 24 pacientes si...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Liga contra el Cáncer de Côte d'Or y al Centro Georges-François Leclerc por su apoyo financiero. Agradecemos a Philip Bastable por la edición del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MiSeqIlluminaSY-410-1001 Dispositivo desecuenciación/rendimiento medio
Nextera Kit de enriquecimientoIlluminaFC-123-1208Tecnología basada en la transposasa
Cartucho de 300 ciclosIllumina15033624
Perlas de AMPureBeckman CoulterA63881Perlas de purificación magnéticas
Soporte magnéticoAlpaquaA32782
Placas de 96 pocillosLife Technologies 4306737
MIDI Placas de 96 pocillosBioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001Este sello solo es necesario para la amplificación por PCR. Se pueden utilizar otros sellos estándar durante todo el experimento
MiSeqIlluminaProvisto con el dispositivo de secuenciación
software Experiment Manager
Dirección de Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Herramienta del sitio web del fabricante

Referencias

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