Los métodos que producen embriones morphant son esenciales para estudiar los mecanismos de desarrollo y redes reguladoras de genes. La estrella de mar patiria miniata es un sistema modelo emergente para estos estudios. Aquí se presenta un protocolo para la obtención de gametos, la producción de cultivos de embriones, y la rápida microinyección de cigotos de esta especie.
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Artículo de método
Un método para la microinyección de Patiria minata Los cigotos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los equinodermos han sido durante mucho tiempo un sistema modelo preferido para los estudios de reproducción y el desarrollo, y más recientemente para el estudio de la regulación de genes y la evolución de los procesos de desarrollo. La estrella de mar, patiria miniata, está ganando prevalencia como un sistema modelo para este tipo de estudios que antes se realizaban casi exclusivamente en los erizos de mar, Strongylocentrotus purpuratus y Lytechinus variegatus. Una ventaja de estos sistemas de modelo es la facilidad de producir embriones modificados en los que un gen particular es hacia arriba o downregulated, el etiquetado de un grupo de células, o la introducción de un gen informador. Un único método de microinyección es capaz de crear una amplia variedad de tales embriones modificados. A continuación, presentamos un método para la obtención de gametos a partir de P. miniata, producir cigotos, y la introducción de reactivos perturbadores mediante microinyección. Posteriormente morphant embriones sanos son aislados para estudios cuantitativos y cualitativos de la gefunción ne. La disponibilidad de datos sobre el genoma y transcriptoma para este organismo ha aumentado los tipos de estudios que se realizan y la facilidad de ejecución de ellos.
Introducción
La estrella de mar, patiria miniata, (comúnmente conocido como el palo de la estrella) se perfila como una interesante y versátil sistema de modelo para una variedad de celulares del 1 al 3, de desarrollo de 4,5, evolutiva 6 8, y estudios ecológicos 9- 11. Adultos P. miniata se distribuyen a lo largo de la costa pacífica de Sitka, Alaska a Baja, California 12 y se mantienen fácilmente en acuarios marinos. Los ovocitos son durante todo el año se puede obtener y cada hembra puede arrojar decenas de miles de huevos. Los ovocitos son fácilmente madurados y fecundados externamente 13. Los ....
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Protocolo
Mantenga toda el agua de mar o agua de mar artificial (SW), los animales adultos, y culturas a 15 ° C, tanto como sea práctico. Asegurarse de huevos y cigotos se mantienen sumergidos en SW.
Sales marinas comercialmente preparados reconstituidos con agua destilada o de ósmosis sirve también como fuente de SW. Compruebe la salinidad utilizando un hidrómetro y ajustar sales o agua para lograr niveles óptimos. Mantenga los niveles de gravedad específica entre 1,020-1,025. Guarde todos los objetos de vidrio y plástico separada de todas las demás material de laboratorio para evitar cualquier contaminación con productos químicos. Clean embrión g....
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Resultados
El objetivo de este protocolo es introducir los reactivos en los embriones. Se demuestra la eficacia del protocolo mediante la inyección de un constructo reportero de ADN que conduce la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). Inyectado embriones expresan GFP en parches clonales (Figura 4A-B) como incorpora el ADN durante la escisión temprana. Muchos reactivos que son deseables para introducir en los embriones son tóxicos en cantidades elevadas y para lotes subóptimas de embriones. Manifiestos.......
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Discusión
Hay dos pasos críticos que son difíciles para los usuarios novatos de esta técnica, pero son esenciales para la creación de embriones con éxito morphant. La primera es la selección de los ovocitos sanos que madurarán y fertilizar adecuadamente. El porcentaje de desarrollo normal en una cultura depende de la temporada, la salud del animal, y el número de veces que los ovocitos han sido recolectadas de un solo individuo. Los ovocitos suelen ser de mejor calidad a partir de abril a octubre. Es importante examinar cuidadosa.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado por los autores.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia IOS 0844948 y 1024811 IOS
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-metiladenina | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| Filtro de nylon nitex de 190 micras | Piezas pequeñas (originalmente Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| Filtro de nylon nitex de 100 micras | Piezas pequeñas (originalmente Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Placas de poliestireno Petri, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Tubo capilar | FHC, Inc | 30-30-0 | Para extraer agujas de microinyección |
| Modelo P-97 Extractor de agujas | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextrano, Rodamina Green | Life Technologies | D7163 | Si se inyecta un indicador de expresión de GFP, es útil sustituirlo por dextrano rojo de Texas como trazador de inyección |
| Sal marina oceánica instantánea | Doctores Foster y Smith | CD-116528 | También disponible en muchas tiendas de mascotas |
| Puntas de microcargador | Eppendorf | 5242 956.003 |
Referencias
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L.
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Reimpresiones y permisos
