Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Resumen

Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son fundamentales para la mayoría, si no todos, los procesos fisiológicos, y la comprensión de la naturaleza de tales interacciones es un paso central en la investigación biológica. La resonancia de plasmón de superficie (SPR) es una técnica de detección sensible para el estudio sin marcadores de interacciones biomoleculares en tiempo real. En un experimento SPR típico, un componente (generalmente una proteína, denominada "ligando") se inmoviliza en la superficie de un chip sensor, mientras que el otro (el "analito") está libre en solución y se inyecta sobre la superficie. La asociación y disociación del analito del ligando se miden y trazan en tiempo real en un gráfico llamado senograma, a partir del cual se derivan los datos de preequilibrio y equilibrio. Al estar libre de etiquetas, consumir bajas cantidades de material y proporcionar datos cinéticos de preequilibrio, a menudo hace que SPR sea el método de elección cuando se estudia la dinámica de las interacciones de las proteínas. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, debido a la alta sensibilidad del método, los datos obtenidos deben analizarse cuidadosamente y respaldarse con otros métodos bioquímicos.

SPR es particularmente adecuado para el estudio de proteínas de membrana, ya que consume pequeñas cantidades de material purificado y es compatible con lípidos y detergentes. Este protocolo describe un experimento SPR que caracteriza las propiedades cinéticas de la interacción entre una proteína de membrana (un transportador ABC) y una proteína soluble (la proteína de unión al sustrato afín del transportador).

Introducción

Interacciones proteína-proteína (PPI); la formación y disociación de complejos de proteínas, son acontecimientos clave en muchos procesos biológicos (por ejemplo, replicación, transcripción, traducción, señalización, comunicación célula-célula). Estudios semi-cuantitativos de PPI se realizan a menudo utilizando desplegable o experimentos de inmuno-precipitación. Sin embargo, estas técnicas (y similares) están limitados en la gama de afinidades que se puede medir (micromolar bajo y mayor afinidad) debido a las etapas de lavado que son inherentes a tales técnicas. Tales técnicas de "punto final" no pueden identificar interacciones transitorias o de baja afinidad que a menudo son de grandes consecuencias biológicas. Además, la resolución temporal de estos enfoques es extremadamente limitado, generalmente órdenes de magnitud más lento que las tarifas de la reacción. SPR superar estas críticas debido a su mayor sensibilidad y resolución temporal superior ^1,2. SPR es un método libre de etiquetas, y como talinteracción molecular se puede medir (siempre y cuando los cambios de masa pueden detectarse). Además de PPI, se ha utilizado ampliamente para caracterizar la proteína-ligando, la proteína-fármaco (o una molécula pequeña), la proteína de ADN, y las interacciones proteína-ARN ^3-5. Los resultados se registran y se representan en tiempo real, que permite la modificación rápida de las condiciones experimentales y diseño experimental flexible.

El principio físico detrás instrumentos basados ​​en SPR es la utilización de un sistema óptico que mide un cambio del índice de refracción en la superficie del sensor a los cambios de masa ^2. Uno de los socios que interactúan (ligando de aquí en adelante) está inmovilizado en un chip de matriz de polímero y la segunda molécula (analito en lo sucesivo) se hace fluir sobre la superficie. El analito se une al ligando altera la masa sobre la superficie del chip. Este cambio de masa está directamente relacionado y proporcional a los cambios en el índice de refracción de la superficie. Los resultados se representan en tiempo real ypresentarse como unidades de respuesta (RU) como una función del tiempo. Tal trama se denomina una Sensograma (por ejemplo, Figura 1). Desde SPR sigue el transcurso de tiempo completo de la interacción, pre-equilibrio constantes de velocidad cinética se derivan, además de equilibrio afinidades. Como se detalla a continuación, el comportamiento de pre-equilibrio de un sistema dado tiene mucha información, y proporciona una perspectiva muy diferente de equilibrio solo. Una vez que el sistema se calibra, los experimentos son muy rápidos y requieren sólo pequeñas cantidades de material de proteína (microgramos a nanogramos cantidades). Recogida de la información cinética completa de un sistema dado se puede lograr en día. La alta sensibilidad del SPR proporciona mediciones que no son posibles de utilizar cualquier otra técnica ^6. Sin embargo, esta alta sensibilidad es un "arma de doble filo", ya que puede ser una fuente importante de datos falsos positivos. Cualquier factor que afecta el índice de reflexión se registra y se representa en el Sensograma. Como tal, apcontroles apro- deben utilizarse para eliminar los falsos positivos, y el apoyo de enfoques complementarios, es muy recomendable.

La Figura 1 ilustra la progresión de un experimento SPR usando un chip sensor recubierto-NTA. El Sensograma en el panel A muestra la inyección de los iones de níquel más de la matriz de NTA (datos sin sustraer), y los paneles BD mostrar los datos después de restar la señal derivada de la célula control negativo. Flechas rojas y azules muestran inicio de la inyección y final, respectivamente. La inmovilización del ligando en el chip altera gradualmente la masa hasta que se termine la inyección. La meseta estable observada después de la terminación de la inyección del ligando refleja la asociación estable del ligando a la superficie (Figura 1B, ciclo 2). Una vez que se consigue una línea de base estable un tampón se inyecta sobre el ligando y la célula de referencia (Figura 1B, el ciclo 3) .Este inyección sirve como un "blanco de control", y serásustraído durante el análisis. Tras la inyección, se registran cambios menores, lo que refleja un flujo de masa a través del chip. Luego, en un ciclo separado (Figura 1B, ciclo de 4), se inyecta el analito; el aumento gradual de RU representa la asociación de analito al ligando. Los sitios de unión ocupados se vuelven gradualmente hasta que se alcanza el equilibrio. Tan pronto como termina la inyección, la disminución de las EEFF refleja la disociación del complejo. De tales sensograms pre-equilibrio de equilibrio y constantes de velocidad se pueden derivar (ver más adelante). La Figura 1 representa una interacción transitoria entre el ligando y el analito. Cuando la interacción es más estable, el descenso en el nivel de RU es más lento, lo que refleja un menor k _d.

Aquí se describe un experimento SPR objetivo de caracterizar la interacción entre un transportador de membrana (detergente solubiliza) y su socio funcional, su sustrato cognado proteína de unión ^6,7. El mod elegidosistema el es un casete de unión a ATP (ABC) transportador, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Este sistema fue seleccionada por sus resultados altamente reproducibles, alta relación señal-ruido, y clásico 'on / off' tarifas. Además, los transportadores ABC homólogos están disponibles para servir como importantes controles negativos. El transportador, ModBC (ligando A) se extrae de la membrana utilizando detergente, purificada e inmovilizada en el chip. Su interacción socio soluble, Moda, es el analito. Como un ligando de control negativo, un RbsBC transportador ABC diferente se utiliza ("ligando B").

Protocolo

1. proteína de la muestra y la Preparación Buffer

1. Preparación de la muestra: purificar las proteínas de interés y asegurarse de que se eliminan todos los agregados, mediante la inyección de la proteína antes del experimento en una columna de filtración en gel o por ultracentrifugación (por lo general 10 minutos a 100.000 xg es suficiente).
   NOTA: Aunque los preparados de proteínas deseables, altamente puros no son una necesidad. SPR ha sido utilizado con éxito con menos-que-perfecta purificaciones y hasta con ^8,9 total del extracto.
2. Preparación Buffer:
   1. Preparar el tampón del experimento (denominado "tampón", o RB). Para el protocolo descrito aquí, utilizar Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenga en cuenta que la elección de la composición del tampón se puede modificar fácilmente de acuerdo con el sistema estudiado.
   2. Filtra todos los tampones y muestras de proteínas utilizando 0,22 micras filtros. Asegúrese de antemano que los filtros están en proteínascompatible. En general, las plataformas SPR recientemente comercializados contienen un filtro en línea de-Gasser; Si este no es el caso, de-gas los tampones antes de su uso.
   3. Dializar noche o diluir las muestras contra la RB para evitar desajustes de amortiguamiento. Diálisis (o cualquier otro método de intercambio de tampón) es especialmente recomendable cuando se utilizan productos químicos de alta viscosidad (por ejemplo, sacarosa, glicerol, DMSO). Antes de conectar la botella RB a la entrada de la bomba mantener a un lado 10 ml de la RB en un tubo separado.
3. Diluir el ligando madre concentrada en RB a una concentración final de ~ 20 mg / ml. Como regla general, para la inmovilización del ligando estable, utilizar concentraciones de ligando bajas con inyecciones más largos a bajo flujo, en oposición a altas concentraciones, de alto flujo y las inyecciones más cortas.
4. Diluir el analito en el RB a la concentración deseada. Típicamente, probar la gama de concentraciones para un sistema de afinidad desconocido de 10 M a 10 nM en diluciones de diez veces. Comience siemprecon las concentraciones más bajas primero.

2. Sensor de Chip

1. Selección Chip: Utilice un ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adecuado para la captura de proteínas con una etiqueta oligo-histidina.
2. Uso Chip:
   1. Cuando se utiliza un nuevo chip, tomar el chip fuera de la vaina, enjuague suavemente con agua doblemente destilada (DDW), secar líquidos restantes cuidadosamente usando limpiadores delicados, y asegúrese de no tocar la superficie de la capa de oro. Coloque el chip en la vaina en la orientación correcta (la inserción es suave cuando el chip se coloca correctamente).
   2. Cuando vuelva a utilizar un chip, sacar el chip almacenado desde la memoria intermedia, enjuague bien con DDW y seca suavemente como se ha dicho, y colocar en su vaina originales.
      NOTA: La acumulación de material de chatarra no específica en el chip puede afectar a su 'viabilidad'. Esto puede ser controlado mediante la comparación de las EF antes de la inmovilización del ligando y post extracción. Aunque muchas mediciones pueden serhecho usando el mismo chip NiNTA, el tema de su longevidad no es una 'clara' y varía mucho entre los diferentes chips.
3. Docking Chip: Abra la puerta chip sensor y coloque el chip en su vaina. Cuando se utiliza un nuevo chip, el número de serie de entrada del chip para mantener registro de uso. Cierre la puerta y pulse 'chip de muelle ".

3. Los ajustes de temperatura

1. Ajuste la temperatura de la célula de chips a 25 ° C (o la temperatura experimento preferido).
2. Opcional: establecer el compartimiento de muestras a 7 ° C para mantener las proteínas estable durante todo el experimento.

4. Las soluciones para carga y el arrastre

Preparar las siguientes soluciones para la carga y el arrastre: 0,5 mM NiCl ₂ en RB, EDTA 350 mM en RB (añadir detergente a la solución de EDTA a una concentración final como en RB), 0,25% SDS en H ₂ O, y HCl 100 mM en H ₂ O. Cuando se utiliza bañera de micro-centrífugaes y no SPR tubos designados, no se olvide de cortar las tapas de los tubos.

5. Primer Instrumento SPR con RB

6. Iniciar un nuevo Run

1. Ajuste el caudal que se utilizará durante el experimento. Para obtener los resultados descritos aquí establecer el flujo de 50 l / min.
   NOTA: Este parámetro se puede modificar durante el experimento.
2. Definir las vías de flujo y la resta de referencia. Para obtener los resultados descritos aquí establecidas las rutas de Fc = 1 y Fc = 2, Fc sustracción = 2-1.
   NOTA: El programa mostrará en tiempo real la sustracción de dos células de medición. Tenga en cuenta que este parámetro no puede ser alterado durante el experimento.
3. Seleccione la gradilla de muestras adecuado (que puede influir en el consumo de volumen de la muestra).
4. Guarde el archivo de resultados.

7. Ciclos Experiment

Cada experimento se compone de ciclos, mantener un registro claro de las inyecciones realizadas en eaciclo ch, y separar la carga de los ligandos, la inyección en blanco de la memoria intermedia, y la inyección analito en diferentes ciclos.

1. Ciclo 1: preparación Chip y níquel carga
   1. Asegúrese de que el flujo y caminos se establecen de acuerdo con el paso 6.1 y 6.2.
   2. Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min para lavar platos sobrantes.
   3. Definir el flujo de 10 l / min.
   4. Inyectar 0,5 mM _NiCl2 durante 2 min.
      NOTA: Ahora el chip de resina se recubre por iones de níquel.
2. Ciclo 2: Ligandos inmovilización
   1. Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 2.
   2. Inyectar ligando A hasta alcanzar valores de RU que son 10-20 veces de su peso molecular. Por ejemplo, cargar un ligando de 50 kDa a 500-1000 EF. Mantenga un registro del valor RU logrado.
   3. Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1.
   4. Inyectar ligando B (control) hasta el mismo valor que el de RU ligando A. Seguimiento de la Sensograma resta (Fc = 2-1) en línea para ayudar a controlar lalongitud de la inyección.
   5. Flujo Set a 50 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, lavar el sistema de 5-20 minutos hasta que la línea de base (Fc = 2-1) se estabiliza.
3. Ciclo 3: inyección en blanco. Esta inyección servirá para la resta en blanco, por lo tanto, incluir todos los componentes que se inyectan con el analito, excepto el propio analito.
   NOTA: La longitud de inyección puede variar en función del tiempo que tarda en alcanzar el equilibrio (mesetas de la señal).
   1. Flujo Set a 15 l / min, trayectoria del flujo Fc = 1 y Fc = 2, Fc = 1.2 resta.
   2. Introduzca el comando 'espera' (en lo sucesivo como "esperar") durante 30 segundos (para tener una línea de base estable).
   3. Inyectar 15 seg RB.
      NOTA: La duración de la inyección puede variar entre los diferentes sistemas, en función de sus constantes cinéticas pre-equilibrio (sobre todo el k _A).
   4. Espere 120-600 segundos para registrar la fase de disociación.
      NOTA: La duración de esta etapa varía de acuerdo con el k _d: Cuanto menor sea la disociación cuanto más tiempo este paso tiene que ser. Para los complejos de disociación muy lenta (k _d <10 ^-4 s ^-1), espere 10 a 15 minutos y luego se procederá a la superficie de regeneración (ver más adelante).
4. Ciclo 4: inyección de analitos
   1. Copia / pega las condiciones exactas utilizadas en la inyección de referencia (ciclo 3), por lo que estos dos inyecciones pueden ser más tarde restan. Cambio de la ubicación de la ranura en el bastidor de la que contiene la solución de control a uno que tiene la solución de analito. Elija una concentración que es ligeramente superior a la esperada K _D. Si no hay ningún conocimiento previo está disponible, elija 1 mM como un buen punto de partida.
5. Ciclo 5: Inyección Buffer
   1. Repita el ciclo de 3.
6. Ciclo 6: inyección del analito
   1. Repita el ciclo de 4.
7. Ciclo 7: Chip desnudarse
   1. Definir el flujo de 50 l / min.
   2. Inyectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip.
   3. Inyectar 0,25% SDS durante 1 min. Repita este paso dos veces más. No utilice una sola inyección de 3 minutos ya que esto puede dañar el chip.
   4. Si no se alcanza el nivel de referencia, inyectar HCl 100 mM durante 1 min como etapa de separación adicional.
   5. Introduzca el comando 'run final' que cambia al modo de espera.
8. Almacenamiento chip
   1. Desacoplar el chip sensor y lo saca del instrumento.
   2. Tome el sensor fuera de su funda, evite tocar la superficie, enjuagar con DDW, y colocar en un tubo de 50 ml que contiene RB. Almacenar a 4 ° C.

8. Análisis de datos utilizando Designado Software de evaluación

1. Realice los siguientes pasos para procesar los datos brutos obtenidos por SPR antes de derivación de los parámetros cinéticos.
   1. Utilizando el software de evaluación, abiertael archivo de resultados, seleccione los ciclos 3-6 Fc = 2.1 (referencia resta de datos).
   2. Eje de cambio:
      1. Mostrar ciclos 3-6.
      2. Poner a cero el valor del eje Y de la línea de base (el 30 seg tiempo de espera inicial en cada ciclo) a la de todos los cuatro curvas.
   3. Alinear el eje X de las cuatro curvas. Elija las acentuadas características (por ejemplo, los picos de salida de la inyección o el final) para alinear perfectamente los cuatro curvas a lo largo del eje X. Establezca la hora del comienzo de analito (o tampón de control) a cero.
2. Referencia de resta
   1. Restar la respuesta de fondo restando la curva de ciclo 3 de la curva de ciclo de 4 y la curva de ciclo 5 de la curva de ciclo de la operación 6. Uso curva de sustracción que se puede encontrar en el eje Y se desplaza menú.
      NOTA: Es importante realizar este paso en que anula los componentes no específicos (relacionados con el analito) que pueden haber influido en el índice de refracción de la superficie.
      1. Guarde las curvas restados en tél hoja de proyecto bajo un nombre diferente.
   2. Consulte estas curvas como "curvas" doblemente restados: la primera es la sustracción 2-1 resta se realiza en ambas inyecciones, y la segunda es la resta de una curva de otro.
      NOTA: Tal doble referencias es el estándar de oro en los experimentos de SPR.
   3. Superposición de las curvas sustraídas mediante la realización de cambio del eje como se ha explicado antes.
3. Determinación de la cinética de las constantes y ajuste del modelo
   1. La realización de un experimento de cinética
      1. Inyectar una serie de 6-7 concentraciones de analitos tener un fiable de datos para la determinación de las constantes cinéticas. Elige concentraciones de analito a partir de 10 veces por encima de 10 veces por debajo del estimado K _D, en diluciones 2-3 veces. Incluya la concentración "cero", posteriormente utilizado para la sustracción de referencia de matrimonio (ver arriba). Llevar a cabo inyecciones por triplicado y en orden aleatorio.
      2. Alineary restar todas las curvas con respecto al eje Y y el eje X antes de intentar el ajuste del modelo.
   2. Ajuste del modelo
      1. Seleccione un programa de análisis adecuado.
         NOTA: La mayoría de los programas de ajuste disponibles ofrecen varios modelos que se pueden aplicar para el montaje y la determinación de las constantes cinéticas.
      2. Aplicar el modelo más simple (Langmuir) suponiendo una reversible 1: 1 la interacción entre el analito y el ligando para el montaje. A menos convincentes datos disponibles de otros métodos experimentales para la existencia de una interacción más compleja, utilice siempre el modelo de Langmuir simple.

Resultados

En el sistema descrito en el presente documento, un chip de NiNTA se utiliza para inmovilizar el transportador de membrana Su-etiquetados ^6,7. Al ser un homo-dímero, cada transportador está doblemente etiquetada, mejorando su unión al chip NiNTA. Después de la carga de níquel, ligando A (el transportador de interés) se inmoviliza sobre Fc = 2, hasta ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A etiqueta negro). Luego, utilizando el mismo flujo y la duración de la inyección, ligando B (el ligando...

Discusión

SPR es un método muy sensible para estudiar las interacciones moleculares, y es a menudo el único enfoque que proporciona monitoreo en tiempo real de (pero importantes) interacciones transitorias. Un ejemplo es la interacción transitoria presentada en este documento, que no podía ser detectado por cualquier otro método (pull-down ensayos, los ensayos de liposomas de sedimentación ^6). Por otra parte, mientras que otros métodos están limitados a mediciones de equilibrio (ya sea cuantitativa o cualitativa), SPR ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Chip de sensor NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Cloruro de níquel	Sigma	N6136
Tungstato de sodio dihidratado	Sigma	T2629
Cloruro de sodio	Bio-Lab LTD.
Trizma base	Sigma	T1503
Ácido etildiamino-tetraacético sal disódica dihidratada (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Solución de dodecil sulfato de sodio	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Ácido clorhídrico	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Filtro de membrana	Sartorius	25007--47------N
ModBC Transportador ABC Laboratorio			Lewinson
RbsBC Transportador ABC Laboratorio
LewinsonProteína de unión al sustrato ModA Laboratorio			Lewinson