Confocal Lapso de tiempo de imágenes como un método eficaz para la Evaluación Cytocompatibility de composites dentales

Summary

El aspecto más estudiado de la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales es su citotoxicidad 3D CLSM imágenes lapso de tiempo combinado con la cuantificación de la señal fluorescente permite la evaluación sensible del destino celular en el tiempo. Utilizando este método podría ser una herramienta eficaz para evaluar la cytocompatibility de composites dentales.

Abstract

Es generalmente aceptado que la interacción in vitro de material celular en es un criterio útil en la evaluación de biocompatibilidad material dental. El objetivo de este estudio fue utilizar 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso para evaluar la biocompatibilidad in vitro de compuestos dentales. Este método proporciona una indicación exacta y sensible de la tasa de células viables en contacto con extractos de compuestos dentales. El ELS adicional baja contracción, un compuesto dental utilizado para la restauración directa, se ha tomado como ejemplo. En la evaluación in vitro se realizó en células de fibroblastos gingivales humanos en cultivo primario mediante la tinción de Live / Dead. Las imágenes se obtuvieron con el sistema biológico FV10i confocal invertido y analizados con el Software 3.1 FV10-ASW. Análisis de la imagen mostró una muy ligera citotoxicidad en presencia del compuesto de prueba después de 5 horas de lapso de tiempo. Una ligera disminución de la viabilidad celular se muestra en contacto con el compuesto de extractos compar probadoed con las células control. Los resultados pusieron de relieve el uso de 3D CLSM imágenes lapso de tiempo como un método sensible para evaluar cualitativa y cuantitativamente el comportamiento de biocompatibilidad de materiales compuestos dentales.

Introduction

Una de las principales normas citadas en las recomendaciones de la ISO para definir biocompatibilidad es la ausencia de toxicidad de material a las células. Compuestos dentales a base de resina pueden liberar componentes de la matriz resinosa, que podría ser debido inicialmente a la polimerización parcial, y / o más tarde debido a procesos de degradación con el tiempo ^1-4. Estos componentes liberados entrar en contacto con los tejidos orales y pueden tener varios inconvenientes como las reacciones de urticaria y mucosas ^5, el desarrollo de las reacciones alérgicas y de hipersensibilidad en los pacientes ^6, modificaciones de la morfología de fibroblastos gingivales y la reducción en la proteína colágeno de tipo I ^7, de inmunosupresión o inmunoestimulación en mitógeno impulsada por la proliferación de los linfocitos T purificados y células de bazo ⁸ y el daño del ADN en los fibroblastos gingivales humanos primarios, lo que subraya su potencial genotóxico ^9. Muchos parámetros pueden afectar la toxicidad compuesto dental, como la sombra de la composite, la luz de curado, la composición química del monómero de la resina, el relleno y el grado de conversión ^{de 10 13.} Desde potencial tóxico in vitro de materiales puede predecir en situaciones in vivo y podría ser comparado con situaciones clínicas por el estudio de algunas variables relevantes. La citotoxicidad de compuestos dentales y sus componentes han sido ampliamente evaluado utilizando sistemas de cultivo celular ^{14- 16.}

Estos sistemas in vitro se han desarrollado para evaluar compuestos dental biocompatibilidad en términos de: crecimiento celular, y la apoptosis celular utilizando THP-1monocytes como las células ^17, la citotoxicidad en fibroblastos gingivales humanos ^18, el potencial inflamatorio en queratinocitos HaCaT como las células ^2, la funcionalidad de células odontoblast- como 23 MDPC células ^19, la reducción de los niveles de ARN total, y aumento significativo en la inducción de la apoptosis de queratinocitos gingival humano ²⁰ yDaño en el ADN en fibroblastos gingivales y pulpa de células ^21.

Diferentes metodologías se sugieren para investigar la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales. Ensayos colorimétricos, que implican colorantes específicos y medidas de adsorción de luz, siguen siendo los más utilizados, debido a su relativa simplicidad y bajo costo ^{22- 26.} Análisis de Microscopía de contraste de luz con frecuencia consume más tiempo e incurre en mayores costos. Sin embargo, estas técnicas de microscopía tienen algunas ventajas importantes. La observación de la estructura celular proporciona información ampliada sobre los efectos tóxicos experimentados, proporcionando así datos más relevantes y sensibles. En particular, la introducción de la microscopía confocal ²⁷ ha permitido para la observación de estructuras biológicas con la mejora de la resolución axial en comparación con el de campo amplio tradicionales microscopios de fluorescencia de imágenes. Por lo tanto, la imagen confocal se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en diferentes campos de lainvestigaciones médicas y científicas. En contraste con las técnicas de microscopía electrónica, microscopía de barrido confocal ofrece la capacidad de visualizar los distintos componentes de las células mediante la incorporación de marcadores fluorescentes específicos. La mayoría de estos trazadores específicos son estables en un entorno acuoso, sensiblemente medible, barato y no tóxico ^28, lo que permite su uso en clínica, así como los estudios de investigación de laboratorio. Por otra parte, el secado y fijación de muestras requerido para el análisis de microscopía electrónica convencional no es necesaria para la formación de imágenes confocal lapso de tiempo, la adquisición de este modo dependiente del tiempo también es posible en muestras. En comparación con la formación de imágenes de dos dimensiones, el principio de formación de imágenes confocal permite una visualización del subsuelo muestra y la estructura tridimensional de reconstrucción de las diferentes imágenes de profundidad obtenidos; detalles que dan como resultado, más precisos y más estructurales ^{29, 30.} El presente estudio de vídeo es un ejemplo de la utilización de tres dimensiones de intervalos de tiempo Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) combinada con etiquetado Live / Dead fluorescente y la cuantificación de la señal como un método innovador. La técnica presentada en este documento tiene la ventaja de permitir la evaluación y el lapso de tiempo sensible de imágenes de células vivas sin cambiar la estructura de la célula evaluado. No se requieren pasos de preparación antes del análisis confocal. Anteriormente, la misma tinción se utilizó para evaluar la viabilidad del cultivo núcleos de hueso esponjoso ³¹ pero sin confocal de lapso de tiempo siguiente. Del mismo modo se utilizó el mismo procedimiento confocal de lapso de tiempo para evaluar la actividad de letalidad eritromicina en las bacterias de lodos activados de acuerdo a su tipo de Gram ³² utilizando una bacteria específica Vivir / tinción muertos. Estos métodos se han adaptado y utilizado para comparar la toxicidad de compuestos dentales basados ​​en monómeros de metacrilato de ¹¹ recientemente.

Protocol

El protocolo consta de tres pasos principales: la primera etapa comprende la preparación de extracto de material compuesto en medios de cultivo; el segundo se refiere la Primaria Humanos fibroblastos gingivales (HGF) de cultivo de células, el contacto de las células con los extractos compuestos y tinción de células; la tercera etapa consiste en la formación de imágenes confocal y el análisis de la señal fluorescente. Para tejidos gingivales tomando, el protocolo fue aprobado en cumplimiento de la legislación francesa, el consentimiento informado y el comité de ética local.

1. Extractos Compuesto Preparación

Utilice medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) como el medio de elución. Asegúrese de que la relación entre el área superficial de las muestras y el volumen de medio de extracción está en el nivel más bajo de los requisitos de la norma ISO 10993/12. El procedimiento se describe recientemente ¹¹ y esbozó brevemente a continuación:

1. Formar muestras esféricas de material compuesto no curado dental utilizando una retención a medidaer. El tamaño titular es 2 mm de radio, que está de acuerdo con la profundidad de curado generalmente se recomienda en el tratamiento clínico oral.
2. Preparar pocillos de la placa, cada uno conteniendo 1 ml de medio de cultivo (DMEM), con una mezcla de 5% de penicilina / estreptomicina y 1% de la anfotericina pero sin suero bovino fetal (FBS).
3. Muestras de curación en el medio DMEM que contiene bien utilizando una lámpara de luz LED con un 1,070 mW cm ^-2 intensidad (λ = 465-475 nm) durante 40 segundos. Asegúrese de que la distancia entre la punta de curado y las muestras está en el intervalo de 0,5 mm. Utilice este modo de curado para simular el contacto temporal entre el diente y el material compuesto no curado dental. En la situación clínica, el contacto se produce cuando el compuesto de restauración se coloca en la cavidad oral.
4. Incubar las muestras (composites especímenes en medio DMEM) a 37 ° C en ambiente humidificado de 5% de CO ₂ en el aire. Incubar medio DMEM (sin muestras compuestas) para las células de control en las mismas condiciones.

2. HGF Cultivo Celular, Compuesto Extractos Pruebas y tinción de las células

1. Crecimiento y mantenimiento de cultivos de células
   Aislar fibroblastos gingivales humanos de biopsias de tejidos gingivales sanos de pacientes tomadas durante las extracciones de ortodoncia de rutina.
   1. Cultivar fibroblastos gingivales humanos en DMEM en presencia de 10% de FBS, 5% de penicilina / estreptomicina y 1% anfotericina B. mantener las células a 37 ° C en una incubadora bajo una atmósfera humidificada de 5% de _CO2 en aire.
   2. Medianas cambian cada 3 días, y de paso las células cada 5 días. Después de alcanzar la confluencia, las células de la cosecha por tripsinización.
   3. Centrifugar las células a 90 xg durante 5 minutos y volver a suspender en el medio de cultivo. Recuento de células con un contador de células automatizado de mano cetro.
   4. Seed suspensión de células a una densidad celular de 2,5 x 10 ⁴ células / ml en un sistema de cámara de diapositivas. Permitir la incubación de las células durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de 5%.
2. La adición de extractos de compuestos a las células en cultivo
   1. Reemplazar los medios de comunicación de dos pocillos de la cámara de diapositivas por 1 ml de los extractos compuestos ensayados (después de 24 h de incubación).
   2. Mantener los dos pozos restantes (células de control) en las mismas condiciones.
   3. Incubar el portaobjetos cámara que contiene los cuatro pozos a 37 ° C en la incubadora, en una atmósfera humidificada de 5% de _CO2 en aire.
3. La tinción fluorescente
   Utilice el Live / Dead mancha de citotoxicidad para las células eucariotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: el kit proporciona un ensayo fluorescente de dos colores rápida para determinar la viabilidad de las células en una población basada en la integridad de la membrana plasmática y la actividad esterasa. La mancha distinguir en vivo de las células dañadas por el etiquetado simultáneamente con verde fluorescente calceína-AM para indicar la actividad de la esterasa intracelular y de etidio rojo fluorescente homodímero-1 (EthD-1) para indicar la pérdida de membrane integridad.
   1. Preparar una solución de trabajo de los dos reactivos de tinción que contienen 2 mM de calceína AM y 4 M EthD-1 (concentración final notificado para ser adecuado para la tinción de fibroblastos). Añadir la mancha para las células adherentes cultivadas en la presencia o ausencia de los extractos compuestos seleccionados.
   2. Observar directamente y rápidamente las poblaciones de células teñidas en el menos 15 minutos después de la tinción y por medio de la proyección de imagen de lapso de tiempo. No centrífuga y no fixe las células teñidas.

Lapso de tiempo 3. confocal de imágenes y Análisis de Señales

El sistema utilizado está equipado con un cuatro unidades de láser de diodo y una imagen multi-manchado durante un máximo de cuatro tintes fluorescentes para cada espécimen. El sistema puede realizar una imagen de mapeo (magnificación 10X) que da una visión general de la muestra de ensayo en la que uno se puede mover para observar una región de interés (aumento 600X).

1. Proyección de imagen Lapso de tiempo
   1. Coloca las specimens (la diapositiva cámara que contiene las muestras teñidas) en el cuarto oscuro de la incubadora integrada confocal (37 ° C, 5% de CO ₂ y la atmósfera húmeda).
   2. Seleccione los láseres correspondientes. Utilice las dos fuentes de láser 473 nm (15 mW) y 559 nm (18 mW) para excitar Calceína y EthD-1.
   3. Utilice un modo de dos secuencial para adquirir imágenes a través de secuencias de línea y sin interferencia en la imagen con los dos colorantes fluorescentes usados.
   4. Utilice un detector con un espectro recientemente desarrollado para ajustar automáticamente las condiciones de conformidad con el colorante de fluorescencia en la unidad de exploración.
   5. Optimizar los anchos de banda de la fluorescencia detectada para cada canal al máximo. Registre todas las adquisiciones de forma secuencial para evitar posibles cruz-parlante.
   6. Seleccione las condiciones de formación de imágenes más adecuados basados ​​en la selección colorante fluorescente utilizando el software de adquisición.
   7. Adquirir una imagen de mapa que se crea de forma automática desde el centro en forma de espiral,con el área de interés de ser seleccionado para un examen más fácilmente.
   8. Seleccione el modo de observación. Seleccione hasta cinco tipos de modos de observación, incluyendo time-lapse, Z-pila, y multi-zona, según sea necesario. Use una combinación de modos de time-lapse Z-pila y en el presente estudio y completar rápidamente la captura de imágenes,
   9. Cambiar y cambiar el tinte fluorescente. Alternativamente, superponer el fluorescente y las imágenes de contraste de luz entre sí. Observe la imagen en vivo usando el punto seleccionado en la pantalla del mapa inferior izquierdo.
   10. Determinar el área de formación de imágenes mediante el uso de la formulación y zoom funciones. Opcionalmente, cambiar entre las pantallas para cada tipo de colorante fluorescente.
       NOTA: El microscopio usado en este protocolo tiene la misma funcionalidad que un alto confocal convencional en un diseño compacto. El microscopio está equipado con objetivos de inmersión en agua invertidas que se adaptan de forma óptima para estable time-lapse de células vivas con una incubadora integrado simplificado.
2. Análisis de la señal y la cuantificación
   1. Utilice el software de imágenes para cuantificar la señal de fluorescencia. Obtener cinco imágenes de mapa con el objetivo de 10X, tanto para la muestra y la celda de control probado.
   2. Obtenido 1.024 × 1.024 píxeles imágenes regulares, con un tamaño de 0.231 × 0.231 píxeles micras micras. Almacenar imágenes en formato de imagen Olympus (OIF) para el análisis de señales. Este formato permite almacenar varios ajustes de los parámetros y las imágenes juntos. Utilizar diferentes herramientas de análisis (medición de perfil de intensidad, relación de intensidad entre los dos canales utilizados).
   3. Guarde las imágenes de proyección máximas como archivos TIFF de 12 bits / pixel.
   4. Preforma análisis estadísticos utilizando el software R comandante. Analizar las diferencias utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con una prueba de repetición. Informe de resultados de la desviación estándar como media (± DE) y la significación estadística de p <0,05.

Results

La figura 1 muestra una vista general de las células teñidas de vivos / muertos en imágenes obtenidas de mapeo (objetivo 10X), tanto para el control y las células expuestas a los extractos compuestos ensayados (ELS muy baja contracción). La estructura tridimensional de las células puede ser visualizado en la 600X aumentos. Visualización de células recogidas en la cámara de control y de las células recogidas en la cámara en presencia de los extractos compuestos ensayados se presenta en la Figura 2. La proyección máxima (60X objetivo) muestra el destino de las poblaciones celulares seleccionadas en el comienzo de el lapso de tiempo (a 15 min) y al final del período de tiempo transcurrido (en 5 h). Cincuenta y siete pilas de imágenes (tomografía xyzt mod, 39 imágenes por pilas, voxel de profundidad 1,00 m) se obtuvieron durante este periodo. Una ligera disminución en la señal fluorescente verde y muy ligera variación en el fluorescente de color rojo se obtuvieron en las células expuestas. No se observó variación significativa para el control delas células. Células expuestas extractos compuestos supone la morfología del huso similar a las células de control; morfología no fue alterada en estas condiciones experimentales (a pesar de la disminución de la señal verde y el aumento de la señal roja en la presencia del compuesto probado). El análisis de imágenes se realizó en cinco diferentes pilas de imágenes seleccionadas correspondientes a diferentes poblaciones de células a partir de las imágenes obtenidas para el compuesto probado en comparación con células de control negativo para la señal de tanto verde y rojo. El perfil de intensidad de las células teñidas se ilustra en la Figura 3; la evolución de la señal verde y rojo de las células en contacto con el compuesto probado fue comparable a las de las células de control. Calceína y EthD-1 intensidades de emisión de fluorescencia se midieron en células de control y en las células expuestas compuestos. La medición se realizó a intervalos de una hora durante un máximo de cinco horas. La proporción verde / rojo de fluorescencia (basado en las intensidades integradas de la verde 495-515 nm y 620-650 nm señales rojas) Se calculó durante el período de lapso de tiempo. Las proporciones de viabilidad para el control y las células expuestas a los extractos de ELS adicional baja contracción se muestran en la T abla 1. En la presencia del compuesto de prueba, se encontró que el porcentaje de células vivas para disminuir ligeramente de 100% a 93,9% después de 1 h de contacto. Se observó una diferencia significativa entre el compuesto probado y el control negativo (células sin ningún extractos compuestos) después de 5 horas del período de lapso de tiempo indicado.

Figura 1: Vista general de mapeo de imagen mostró células en objetivo de 10X, las células de control (A) y (B) las células teñidas en presencia de extractos de compuestos (ELS muy baja contracción) en el comienzo del período de tiempo transcurrido (t = 15 min). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. En estecondiciones del experimento, no de variación (tanto para la fluorescencia verde y rojo) se observó para los compuestos expuestos células en comparación con células de control negativo.

Figura 2: imágenes CLSM en objetivo 60X de una población celular de (A) y la cámara de control (B) cámara de extractos de compuestos en el comienzo y el final del período de exposición de lapso de tiempo (I: 15 min y II: 5 hr, respectivamente ). Las áreas verdes son células vivas y las zonas rojas son las células dañadas. El panel de las imágenes demostró ligero cambio en la señal de intensidad (ligero descenso en la señal verde y muy ligero incremento en el rojo). No se observaron alteraciones en la morfología celular en presencia de extractos de material compuesto; exponer células mantenido su morfología en forma de huso y fibroblástica como las células de control.

Figura 3: Perfil Línea de células observadas en microscopía de lapso de tiempo las células (A) de control (B) células extractos compuestos expuestos, (I) a los 15 min y (II) a las 5 h.. Ninguna variación visible en la evolución de la señal verde en presencia de compuesto probado independientemente el tiempo de contacto. Sin embargo, se observó ligero aumento de la señal de color rojo en presencia de compuesto después de 5 h de contacto.

El tiempo de contacto (horas)	Viabilidad celular (%)
	1	2	3	4	5
Las células de control	100	100	100	100	100
ELS adicional baja contracción ®	93,9 ± 7	91,3 ± 5 *	89,5 ± 3 *	87,6 ± 2 *	87,7 ± 3 *

Tabla 1:. Tasa de HGF en vivo evolución células después de 1, 2, 3, 4 y 5 hr de contacto con los extractos compuestos se ensayó la viabilidad celular mediante la tinción utilizando el kit de citotoxicidad Live / Dead. Los datos muestran valores medios ± DE de cinco imágenes apila análisis. Los valores son significativamente diferentes de las células de control en p <0,05.

Discussion

Comportamiento del material biocompatibilidad es el parámetro más requisito previo para ser evaluados antes de su uso médico. Las normas internacionales cubren los dispositivos médicos ISO 10993 ³³ y específicamente los materiales dentales ISO 7405 ^34. La ausencia de los efectos tóxicos a las células circundantes es la norma fundamental en la evaluación de la biocompatibilidad de estos materiales. Es por eso que las pruebas de citotoxicidad tiene tal importancia en la evaluación de la biocompatibilidad material dental ^35-37. La ISO sugirió métodos de prueba podrían basarse en la actividad metabólica o integridad de la membrana. Puntos finales seleccionados deben seguir condiciones específicas para la clasificación de efectos adversos inducidos por un material de ensayo con el fin de minimizar el tiempo y el costo de los ensayos de evaluación. El método actual de investigación (imágenes por lapso de tiempo confocal 3D) es la integridad de la membrana basada. La evaluación de la citotoxicidad a través de este punto final parece ser un valioso marcador de biocompa celulartibilidad con materiales probados y que es también la ISO aprobó punto final. In vitro pruebas están diseñadas para determinar cómo una muestra de material afecta a un tipo de célula particular. El ensayo colorimétrico MTT fue descrito originalmente por Mossman (1983) como un método útil para la medición de la citotoxicidad in vitro y la proliferación celular. La prueba de MTT se basa en la conversión de la sal de tetrazolio en cristales de formazán por las células activas, que determina la actividad mitocondrial. Esto se puede traducir por bajos viabilidad ^38. Gupta y colaboradores informaron de que la prueba de MTT es el método más ampliamente utilizado para medir la citotoxicidad de las resinas compuestas. Deshidrogenasa succínico y respuestas de fosfatasa alcalina también se han utilizado para el mismo propósito ^39. Sin embargo, las células de destino no puede ser objeto de seguimiento, puesto que el ensayo de MTT requiere matar las células en cada punto de tiempo de medición. Con el fin de seguir más de cerca el comportamiento de las células teñidas en el estudio actual, diSe llevó a cabo la observación de células vivas rect, gracias a imágenes CLSM lapso de tiempo combinado con una tinción protocolo corto, análisis de imágenes automatizado y cuantificación de la señal fluorescente.

Materiales compuestos dentales vienen en estrecho contacto con los tejidos orales, especialmente células de la encía y la pulpa. Los fibroblastos serían el blanco de los componentes liberados de estos compuestos restauradores ^40-41. Además, varios estudios han informado de que las células inmortalizadas y células primarias pueden tener diferentes respuestas celulares en contacto con biomateriales. Se encontraron células primarias para ser más apropiada para evaluar los efectos biomateriales ^42. Esto explica el uso de células de fibroblastos gingivales humanos primarios como modelo de células para la evaluación de la citotoxicidad del material compuesto dental probada en el estudio actual. El potencial toxicidad de las sustancias liberadas a partir de composite dental ha sido ampliamente estudiado ^43-44. A fin de evaluar tél potencial citotóxico de los materiales, dos células modelo de contacto se podrían realizar. En el sistema modelo de contacto directo el material se coloca directamente con las células diana, mientras que en el sistema de contacto indirecto, las células diana están en contacto con eluye de medios biológicos. En las aplicaciones clínicas y para los procedimientos de restauración, compuesto dental se colocan en contacto indirecto con los tejidos gingivales. Por esta razón, el protocolo experimental actual se centra en el sistema de contacto indirecto con fibroblastos gingivales humanos (células en presencia de los extractos compuestos ensayados). Como se informó anteriormente por Dahl y colaboradores, las respuestas de citotoxicidad se clasificaron como graves (<30%), moderada (30-60%), leve (60-90%) o no citotóxico (> 90%), basado en la actividad relativa a los valores obtenidos para los controles ^45. Por lo tanto, según este ranking, ya la luz de los resultados obtenidos (Tabla 1), compuesto ELS adicional baja contracción podría ser clasificado como very ligeramente citotóxica y mostró un comportamiento comparable con las células control durante todo el período de lapso de tiempo. Utilizando el mismo método de investigación, precisamente, los resultados de este estudio podrían ser comparados con los de un estudio recientemente publicado. El extra de compuesto de baja contracción ELS demostró la biocompatibilidad superior en comparación con los dos compuestos ensayados previamente utilizados para la misma aplicación clínica que es la restauración directa ^11. Otros estudios son aún necesarios para establecer una comparación más completa.

Al decidir que la citotoxicidad de ensayo para aprobar una evaluación específica de punto final, es importante entender las ventajas y las limitaciones de cada ensayo. El propósito principal de formación de imágenes confocal es lograr una arquitectura de 3-D de las células y órganos. La técnica es capaz de revelar no sólo la superficie de una muestra, sino también su subsuelo. El protocolo se describe en este documento pone de relieve el uso de 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso, como sensitiva método para evaluar el comportamiento de biocompatibilidad in vitro de un material compuesto dental. Sin embargo, a fin de evitar las limitaciones encontradas en este trabajo, estaciones de trabajo anti-vibración podrían ser utilizados con el fin de permitir que la imagen más estable y más largo lapso de tiempo; el tablero de la mesa podría aislar el sistema confocal utilizado por los efectos perjudiciales que las vibraciones en el laboratorio pueden causar. Además, los materiales que se utilizarán en la cavidad oral idealmente debería ser inocuo para los tejidos gingivales y no deben contener sustancias que podrían causar toxicidad sistémica. De acuerdo con la metodología utilizada y los resultados obtenidos en el presente estudio se puede concluir que el compuesto probado (ELS adicional baja contracción) no es citotóxica en las presentes condiciones experimentales. Como el método MBRC sensibilidad puede dar la velocidad inicial de células viables, otras posibilidades podrían preverse para evaluar más puntos finales. En particular, como se ha informado recientemente que los monómeros compuestos afectan a las células thrOugh especies reactivas de oxígeno (ROS) ^{46- 48,} se necesita más investigación para evaluar si los hay correlaciones entre la citotoxicidad redes y la producción de ROS señalización. El futuro protocolo podría ser diseñado para evaluar simultáneamente la producción de ROS (H ₂ O ₂ y / o O ₂ ^- tinción) y la relación de la citotoxicidad (tinción en vivo / muerto) utilizando imágenes CLSM lapso de tiempo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Fluoview FV10i	Microscopio confocal	Olympus
O2/CO2 Incubadora	Pnasonic	MCO 5M	Cell incubation
Live/Dead Kit	Invitrogen	MP 03224	Mancha
ELS contracción extra baja	Saremco		Composite dental
DMEM medio	Sigma	D 6046	Medio de cultivo
Tripsina	Sigma	T1426	células de recolección sistema de
portaobjetos de cámara	PAA	14220040X	Cámara de cultivo
penicilina/estreptomicina	PAA	P11-010	Cultivo celular
Anfotericina B	PAA	P11-001	Cultivo celular
Suero fetal bovino	PAA	A11-101	Cultivo celular
Contador de células	Merck Millipore	00110230TP1	Recuento de células