RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

Resumen

Este video muestra los pasos básicos para realizar el análisis del transcriptoma completo en muestras de médula espinal embrionarias de pollo disecadas después de la transfección con electroporación in ovo.

Resumen

La electroporación in ovo del tubo neural del pollito es un método rápido y barato para la identificación de la función génica durante el desarrollo neuronal. El análisis de todo el genoma de las transcripciones expresadas diferencialmente después de una manipulación experimental de este tipo tiene el potencial de descubrir una imagen casi completa de los efectos posteriores causados por la construcción transfectada. Este trabajo describe un método simple para comparar transcriptomas de muestras de médula espinal embrionaria transfectada que comprende todos los pasos entre la electroporación y la identificación de transcripciones expresadas diferencialmente. La primera etapa consiste en pautas para la electroporación e instrucciones para la disección de mitades de médula espinal transfectadas de embriones HH23 en un entorno libre de ribonucleasa y la extracción de muestras de ARN de alta calidad adecuadas para la secuenciación del transcriptoma. La siguiente etapa es la del análisis bioinformático con directrices generales para el filtrado y la comparación de conjuntos de datos de RNA-Seq en el servidor público Galaxy, lo que elimina la necesidad de una estructura computacional local para experimentos de pequeña y mediana escala. Los resultados representativos muestran que los métodos de disección generan muestras de ARN de alta calidad y que los transcriptomas obtenidos de dos muestras de control son esencialmente los mismos, un requisito importante para la detección de genes de expresión diferencial en muestras experimentales. Además, se proporciona un ejemplo en el que la sobreexpresión experimental de una construcción de ADN puede verificarse visualmente después de la comparación con muestras de control. La aplicación de este método puede ser una herramienta poderosa para facilitar nuevos descubrimientos sobre la función de los factores neuronales involucrados en el desarrollo temprano de la médula espinal.

Introducción

Los estudios genéticos en los organismos vivos utilizan con frecuencia el embrión de pollo como modelo porque en la electroporación in ovo representa un modo rápido y barato para transfectar parcialmente estructuras embrionarias in vivo con construcciones de ADN ^1-5. Vectores de expresión bicistrónicos que codifican una transcripción que contiene un indicador fluorescente junto con el gen de interés, tales como pCIG ⁶ o ⁷ PMES, permiten una rápida verificación de la calidad de la transfección en la región deseada bajo un estereomicroscopio embriones antes de procesar para el análisis de aguas abajo.

Protocolo

1. electroporar la construcción de interés en los tubos neurales de HH12-13 pollo embriones in ovo

Utilice un indicador fluorescente, preferiblemente en una transcripción bicistrónico o fusionado a la proteína de interés con un intercalante péptido 2a viral ^11, para permitir la identificación rápida de los individuos con niveles satisfactorios de la transfección. NOTA: El tiempo de incubación típico para esta etapa es de alrededor de 48 horas a 37,8 ° C.

1. Abrir una pequeña ventana en los huevos después de la eliminación de 3 ml de albúmina con una jeringa acoplada a un 18 G x 1 1/2 aguja. Para mejorar la visu....

Resultados

Para validar el método descrito, dos muestras de control se generan a partir de embriones a electroporación con las PME vector vacío ⁷ y una muestra a partir de embriones transfectadas con el mismo vector que contiene el inserto construir SCRT2-ZNF, que codifica los dominios de dedos de zinc de ¹⁸ SCRT2 pollo. Las muestras que producen ARN total 11-22 mg cada se obtuvieron de las piscinas de 8 a 12 embriones. Las tres muestras se calificó como un valor óptimo de RIN 10 en un control de calidad real.......

Discusión

Aquí proporcionamos directrices para el análisis de los efectos después de la electroporación de la gallina de la médula espinal. Aunque la electroporación de vectores de ADN se utiliza con más frecuencia para sobreexpresar un gen de interés, se puede también utilizar construcciones que codifican dominantes negativos, proteínas o precursores para quimeric siRNAs para generar las condiciones de la función de genes knock-down ^19-21. De hecho, la comparación de los perfiles resultantes de transcriptoma tanto gan.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinta china	Cualquier proveedor
18G x 1 1/2 aguja	BD	305196
jeringa de 3 ml	BD 309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Colorante alimentario utilizado para visualizar la inyección de ADN
Solución de Ringer (1 L)
- 7,2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 0,225 g CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
- 0,217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O a 800 ml y ajustar el pH a 7,4
- ddH2O a 1 L
- Filtro y autoclave
PBS (solución tamponada de fosfato) (1 L)
- 8 g de NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0,2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
- 1,15 g Na2HPO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0,2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2O a 800 ml y ajustar el pH a 7,2
- ddH2O a 1 L y filtro
- 1 ml DEPC (Dietilpirocarbonato)	Sigma-Aldrich	D-5758
- Agitar vigorosamente y dejar reposar toda la noche a temperatura
- Autoclave
Cuchara tamizada	Cualquier proveedor
Estéril 60 x 15 mm Placas de poliestireno Placas de Petri	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap Solución de descontaminación de RNasa	Life Technologies	AM9780
Tijeras quirúrgicas de punta fina	Cualquier proveedor
Pinzas rectas de punta fina	Cualquiera proveedor
Aguja de vidrio estirado hecha de tubos capilares de vidrio de 1,1 x 75 mm Kimble	Chase	40A502
Pipeta Pasteur de vidrio de 9''	Cualquier proveedor
Bomba de pipeta manual	Cualquier proveedor
Microcentrífuga transparente de 1,5 ml tubos de polipropileno	Microcentrífuga Corning Life Sciences	MCT-150-C
	Cualquier proveedor
Solución RNAlater para la estabilización del ARN	Life Technologies	AM7020
ARNkit de aislamiento de ARN total acuoso	Life Technologies	AM1912
Etanol de grado de biología molecular	Cualquier proveedor
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electroforesis Instrumento bioanalizador	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq Kit de preparación de muestras de ARN v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002

ambiente