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Artículo de método

Propagación de

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DOI:

10.3791/51953

⸱

25 de septiembre de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.

Resumen

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.

Introducción

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H. salvaje poblaciones vitripennis y demostrado que aumenta la mortalidad en las poblaciones 2-4, al tiempo que reduce la resistencia de los insectos a los insecticidas.

Desarrollo de métodos para efectivamente trasera infectada H. vitripennis hasta la edad adulta en un entorno de laboratorio han sido difíciles porque H. vitripennis tienen diferentes necesidades nutricionales de una etapa específica que requieren una variedad de plantas huésped 5.8. Instalaciones específicas están obligados a H. vivo trasera vitripennis en los Estados Unidos; Por lo tanto, el cultivo de células es más económico y una alternativa viable, así como cada vez más vital para HoCV-01 de detección y la replicación 2,9. Mientras que los métodos básicos para el establecimiento de cultivos de células de H. vitripennis se describen, estos métodos aún no se han utilizado para la producción comercial de agentes de control biológico, tales como virus 2.

El objetivo general de los siguientes procedimientos es producir una alta concentración de HoCV-01 adecuado para la utilización como agente de control biológico. La replicación viral requiere de una célula viva, que es la razón por cultivar con éxito y optimizar H. vitripennis culturas es vital para el progreso de la producción de los niveles rentables de virus.

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Protocolo

1. Cell Culture

NOTA: Las líneas celulares Homalodisca vitripennis establecidos por el laboratorio del Dr. Wayne Hunter en el Servicio de Investigación Agrícola del USDA (Ft. Pierce, FL EE.UU.) se utilizan para iniciar una acción de laboratorio compuesto por etapas de células mixtas incluyendo fibroblastos y monocapas iniciales.

  1. Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un entorno de laboratorio estéril mantenido a una temperatura de 20-24 ° C con 25 frascos de cultivo cm 2.
  2. Cultivar y mantener culturas en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos utilizando medio H2G + Saltamontes, un modificado medios abeja WH2 10 (Tabla 1).
  3. Incubar frascos de cultivo a 24 ° C con ~ 53% de humedad.
  4. Utilice un microscopio invertido con un aumento total de (TM) de 100X para controlar el crecimiento del cultivo, por ejemplo, comprobar si hay cualquier crecimiento celular anormal, monitorear todos los contaminantes potenciales, y comprobar el progreso de crecimiento a través de la callesuperficie tura.
  5. Realizar un cambio de medio completo (medio de cultivo ~ 4 ml por matraz) cada 7 - 10 días sin perturbar la superficie de cultivo.
  6. Pase culturas cuando la superficie de cultivo es de aproximadamente 80% cubierto por un crecimiento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para disociar las células. Añadir ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada matraz de cultivo y exponer cultivo (s) a la enzima durante períodos cortos de tiempo (5 - 10 min) para lograr la disociación celular completa.
  7. Añadir una cantidad igual de medio fresco al matraz de cultivo (s) (~ 2 - 3 ml) para detener la actividad enzimática y transferir toda la solución a un tubo cónico para centrifugación.
  8. Precipitar las células por centrifugación a 4 ° C durante 6 min a 350 x g.
  9. Eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y añadir ~ 8 ml de medio fresco a cada tubo. Homogeneizar suavemente las células con una pipeta.
  10. Culturas Split en una relación 1: 2 de 25 cm 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularsobre por matraz) y se deja culturas recién pasado en reposo durante 48 horas para permitir que las células en suspensión se adhieran firmemente a la superficie del matraz.
    NOTA: El cultivo de células de 48 pocillos en placas de cultivo de tejido estériles con una superficie de crecimiento de 1 cm 2 también es posible y que se puede mantener en la misma manera que los frascos de cultivo con una reducción en el volumen de medio de cultivo a ~ 250 l.

2. Extracción Virus Total

  1. Homogeneizar cuerpos enteros de virus H. positivo vitripennis en tampón fosfato, pH ~ 7,2, con 0,02% de trihidrato de dietilditiocarbamato de sodio (DETCA) por agitación durante ~ 10 seg intervalos hasta que no haya más grandes masas de tejido presente. Extracto de virus a través de la centrifugación a 124.500 xg supervelocidad durante 4 horas a 4 ° C o 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Si se forma un precipitado en la parte superior, retírelo con un algodón estéril 11.
  2. Eliminar el sobrenadante.
  3. Recoger el precipitado ydisolver con 5 ml de 10 mM de tampón de fosfato (sin DETCA), pH ~ 7,2, que contiene 0,4% de ácido Na-desoxicólico y 4% de éter hexadecil polietilen glicol (Brij 52).
    1. Para mezclar bien el sedimento, eliminar el sedimento desde el lado del tubo y aplastar hasta en solución si es necesario.
    2. Añadir más tampón fosfato 10 mM en ~ incrementos de 5 ml para ayudar a la pastilla entra en solución si es necesario y se combinan en 2 tubos de 11.
  4. Centrifugar la solución a 300 xg durante 15 min 11.
  5. Eliminar el sobrenadante y pasar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, y recoger el filtrado en un tubo de gran colección 11.
  6. Transferencia de filtrado a una membrana de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 kD, usando pequeñas cantidades de tampón fosfato 10 mM (pH 7) que no contiene DETCA si es necesario 11.
  7. Coloque la membrana de diálisis en un gran vaso lleno de ddH2O a 4 ° C. Cambie el ddH2O cada hora fo 5 - 6 horas, hasta que se forma un precipitado blanco en la membrana 11.
  8. Recoger el virus purificado desde dentro de la membrana y someter la solución de virus 100% a una serie de dilución de 10 veces mediante la adición de 10 l de solución a 90 l de ddH 2 O. A continuación añadir 10 l de la dilución para otros 90 l de ddH2O hasta llegar a una dilución de 1: 100.000.
  9. Solución de virus Conservar a -80 ° C.

3. replicación viral

  1. Se siembran las células en placas de cultivo de 48 pocillos y crecen todas las filas hasta que el crecimiento celular es el 80% de confluencia (aproximadamente 72 horas después de pase si las células están creciendo a una tasa promedio).
  2. Inocular cada fila de células con el virus diluido en serie una vez que el crecimiento celular alcanza la confluencia, es decir, una fila de una dilución 1:10, una fila de una dilución 1: 100, etc, a excepción de la fila superior. Utilice la fila superior como un control y añadir 10 l de ddH2O a cada pocillo como control de volumen.
    1. Con el fin de establecer una concentración de células de línea de base de partida para la comparación con los recuentos de células experimentales, disociar y contar el primer pocillo de cada fila antes de la inoculación inicial de cualquier pozos en los cultivos con virus.
  3. Monitorear placas de cultivo cada 24 horas después de la inoculación viral para cualquier cambio de color en el medio que indica un cambio de pH y de cambios en la morfología celular.
  4. Image una columna de la placa de ensayo en cada punto de tiempo, utilizando un microscopio invertido a 100X TM.
  5. Retire todo el medio de la columna que se ha proyectado en cada punto de tiempo de 24 horas y almacenarlo a corto plazo a -20 ° C para la extracción de RNA y cuantificación viral o largo plazo a -80 ° C.
  6. Disociar las células de los pocillos después de retirar el medio como se describió anteriormente en los pasos 1.6 a 1.9, utilizando sólo ~ 250 l de EDTA 0,25% tripsina y medio fresco para detener la actividad enzimática y ~ 250 l de medio fresco para volver a suspender la pelle celulart.
  7. Añadir 10 l de 0,4% de tripano mancha azul a cada tubo que contiene las células para realizar recuentos de células después de la disociación celular para cada período de 24 horas durante una semana. Permita que la mancha se asiente por 10 minutos antes de realizar el recuento de células.
    1. Realizar el recuento de células dentro de 1 h de exposición a manchar o células viables comenzará a la absorción de manchas así como las células no viables.
  8. Agregar lentamente 10 l de la solución de células teñidas a cada lado de un hemocitómetro estándar utilizando una micropipeta. Deje que la solución que se ha tomado por la acción capilar para evitar burbujas de aire.
  9. Contar el número de células viables (no teñidas) en ambos lados de la hemocitómetro (el equivalente de 4 cargos de las 16 plazas del hemocitómetro). Lleve a cabo el recuento de células de cada pocillo de la columna que se ha quitado.
  10. La media de los recuentos de células de cada columna y utilizar la siguiente fórmula para obtener el número total de recuento de células: (número medio de células / 4) x factor de dilución = número de células x 10 4 ml. Esta es la densidad celular o el número de células viables en el cultivo.

4. Extracción del virus a partir de cultivos celulares

  1. Retire H. tratada vitripennis células de los frascos de cultivo como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.6 a 1.8, utilizando sólo ~ 250 l de 0,25% EDTA tripsina y medio nuevo para detener la actividad enzimática.
  2. Eliminar el sobrenadante.
  3. Extracto de virus a partir de células de cultivo siguiendo el protocolo descrito anteriormente en los pasos 2.3 a 2.8.

5. extracción de RNA

  1. Extracto de ARN a partir de muestras de medio recogidos durante cada ensayo virus de una semana usando una extracción tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio diseñado para muestras líquidas por el protocolo del fabricante.
  2. Tienda extrae muestras a -80 ° C.

6. RT-PCR

  1. Establecer normas virales para RT-PCR mediante la ejecución de PCR tradicional utilizando elpar de cebadores cebador HoCV RT-PCR 1 (adelante 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-revertir ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') con el virus aislado de toda H. cuerpo vitripennis.
  2. Asunto producto de la PCR a electroforesis en gel durante 60 min a 120 V en un gel de agarosa al 2% que contenía 0,1% de bromuro de etidio.
  3. Escindir las bandas del gel y se purifica utilizando un kit de extracción de gel según el protocolo del fabricante.
  4. Piscina todo extirpados y producto de gel purificado y purificar aún más por la precipitación básica etanol. Eluir el producto de precipitación en aproximadamente 30 l de Tris EDTA (TE) para aumentar la concentración total de la muestra.
  5. Cuantificar el nivel de cDNA en muestras combinadas a través de espectrofotometría usando ajustes de longitud de onda 260/230 para la detección de ácido nucleico.
  6. Lleve a cabo una serie de diez veces diluciones seriadas de la muestra purificada que van desde 57 ng / l a 57 ag / l (10 -18). Realizar la dilución en serie similar a la descrita in 2.8 con los ajustes realizados para la diferencia en los requisitos de concentración.
  7. Determinar límites de detección de la serie de dilución mediante la realización de QRT-PCR utilizando un kit de QRT-PCR con una cuantificación fiable de las transcripciones de baja abundancia.
    NOTA: Las concentraciones virales inferiores a 5 x 10 -3 copias no son detectables.
  8. Extracto de ARN de las muestras experimentales como se describe anteriormente en el paso 5.1 y cuantificar mediante espectrofotometría.
  9. Normalizar todas las muestras extraídas a 5 ng / l usando agua libre de nucleasa.
  10. Realizar qRT-PCR en todas las muestras, en los duplicados, como 25 reacciones mu l usando un kit de qRT-PCR de un solo paso con la capacidad de detectar bajo número de copias de la siguiente manera: 50 ° C para mantener 10 min; 95 ° C suspenso durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 s; fundir 50 a 99 ° C durante 5 segundos en cada paso.
    1. Hacer la mezcla maestra para que cada mezcla de reacción contiene 12,5 l de masters de 1xmezcla r, 1,0 l (0,3 M) de cebador directo, 1,0 l (0,3 M) de cebador inverso, 0,25 l de la transcriptasa inversa y cantidades variables de plantilla en base a los valores de normalización.
    2. Llevar el volumen total de reacción de 25 l con agua libre de RNasa.
    3. Incluir cinco concentraciones estándar en cada PCR se ejecutan con los siguientes números de copias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 y 5 x 10 -2 copias. Establecer el umbral para cada ejecución hasta justo debajo de una fluorescencia de 10x -2,5 para reducir el ruido durante la adquisición temprana en el comienzo de cada ejecución.

7. Microscopía Confocal

  1. Se cultivan las células Homalodisca vitripennis en unas doce placas que contiene así cubreobjetos de vidrio que miden 18 mm de diámetro en cada pocillo.
  2. Inocular una columna en la placa de cada 24 h durante un período de cuatro días, una vez se logra una monocapa. Asegúrese de que cada cCOLUMNA contiene también un control, una dilución baja viral (1:10) bien y una dilución viral alta (1: 100.000) también. Utilice soluciones de virus obtenidos en la etapa 2.8.
  3. Quite todos los medios de comunicación en el quinto día y lavar las células dos veces con 1x PBS (pH 7.4).
  4. Fijar las células con paraformaldehído al 4% frío a 4 ° C durante 30 min.
  5. Añadir 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS) a las células y se lavan durante 10 min a TA en un agitador a baja velocidad. Lavar las células tres veces.
  6. Añadir 500 l de 0,1% de Triton X-100 a las células para permeabilizar ellos. Deje reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  7. Lavar las células de nuevo como se describió previamente en el paso 7.5.
  8. Añadir 500 l de una solución al 5% de albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear las células a TA. Deje reposar durante 2 horas y luego retire.
  9. Diluir de stock rodamina faloidina-rojo conjugado (RCP) 1: 250 en 1X PBS que contenía 5% de BSA y añadir 250 l de la dilución a cada pocillo para manchas para F-actina.
  10. Placa de cubierta de aluminio faceite para evitar que el tinte de blanqueo e incubar las células a 4 ° CO / N.
  11. Retire la RCP después de 12 h de incubación y reemplazarlo con 250 l de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (250 mg / ml) diluido en PBS 1x conteniendo 5% de BSA, para teñir los núcleos de las células .
  12. Se incuban las células que contienen DAPI a TA durante 1 h.
  13. Lavar las células tres veces con 1x PBS como se describe anteriormente en el paso 7.5.
  14. Retire con cuidado los cubreobjetos de los pozos y montar a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje con un reactivo anti-fade.
  15. Deje que los portaobjetos se sequen en lightproof cajas hasta que se observa bajo el microscopio confocal. Ver prepara diapositivas tan pronto como sea posible ya que los tintes pueden desvanecerse rápidamente.
  16. Image células teñidas utilizando un sistema confocal equipado con un microscopio que contiene una lente de 63X (aceite) plan de apochromate.
    1. Establezca las longitudes de onda de láser a 543 ± 10 nm de excitación y 575 ± 10 nm de emisión para Rhoadmine phalloidin-rojo conjucated, Y 369 ± 10 nm de excitación y 450 ± 30 nm de emisión para DAPI.
    2. Utilice ganancia idéntica y los ajustes establecidos fuera de para el detector para obtener todas las imágenes.
    3. Procesar imágenes utilizando el software adecuado para el procesamiento de imágenes y la clasificación e importar imágenes deseado en un software de gestión de imágenes.

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Resultados

La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso en los dos frascos de cultivo de pequeños y grandes, a partir de cultivos primarios y pasajes continuos. Crecimiento y desarrollo de fibroblastos también se observó dentro de este marco de tiempo. Cuando frascos recién sembrados fueron perturbados antes de 48 horas, se produjo una disminución visible en la unión de las células, lo que lleva a las culturas de crecimiento más lento ya veces no sujeción o de crecimiento en absoluto. Las células fue...

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Discusión

El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación práctica tie...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Programa de Investigación y Educación sobre la Enfermedad de Texas Pierce y al USDA-APHIS por su apoyo financiero para este proyecto. También nos gustaría agradecer a Hema Kothari del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Tyler por su ayuda con la microscopía confocal.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matraces de cultivo celular CorningSigma AldrichCLS430168Superficie 25 cm2, cuello inclinado, tapón (junta de tapón)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusMicroscopio invertido y cámara
Trypsin-EDTA soluciónSigma AldrichT40490,25%, filtrado estéril, BioReactivo, apto para cultivo celular, 2,5 g de tripsina porcina y 0,2 g de EDTA y toro; 4Na por litro de Hanks′ Solución salina equilibrada con rojo fenol
Greiner CELLSTAR placas de cultivo multipocillosSigma AldrichM893748 pocillos (TC tratado con tapa)
DETCASigma Aldrich228680dietilditiocarbamato de sodio trihidrato
Sistema de filtro de vacío con tapa de botella CorningSigma AldrichCLS431206Membrana de acetato de celulosa, tamaño de poro 0,45 μ m, área de membrana 54,5 cm2, capacidad de filtro 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Éter de hexadecil de polietilenglicol
Solución tampón de fosfatoSigma AldrichP5244Recibido como 100 mM diluido a 10 mM con agua estéril
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgarosaSigma AldrichA5304Para electroforesis
Bromuro de etidioSigma AldrichE7637BioReactivo, para biología molecular, en polvo
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCRkit Qiagen204243
4% paraformaldehídoSigma AldrichP6148Grado reactivo, cristalino
PBSSigma AldrichP5368Fosfato solución salina tamponada
Triton X-100Sigma AldrichX100
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma AldrichA2153
Faloidina conjugada roja con rodaminaLife TechnologiesR415La faloidina de rodamina es una sonda de F-actina de alta afinidad conjugada con el colorante fluorescente rojo-naranja, tetrametilrodamina
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold Reactivo antidecoloraciónLife TechnologiesP36934
LSM510 Meta Sistema ConfocalCarl Zeiss
LSM Zen 2007 SoftwareCarl Zeiss
Grace' s Medio para insectos (suplementado, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ componente medio de saltahojas
L-histidina monohidratoSigma AldrichH8125H2G+ componente medio de saltahojas
Medio 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ componente medio de saltahojas
Medio 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ componente
medio de saltahojasHank' s Sales equilibradas (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ componente medio del saltahojas
L-glutamina (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ componente medio del saltahojas
MEM, mezcla de aminoácidos (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ componente medio del saltahojas
1 M MgCl soluciónSigma AldrichM8266H2G+ componente del medio del saltahojas
Pen-Strep (con glutamina)Sigma AldrichG6784H2G+ saltahojas componente medio
NistatinaSigma AldrichN6261H2G+ saltahojas componente medio
GentamicinaSigma Aldrich46305H2G+ saltahojas componente medio
DextrosaSigma AldrichD9434H2G+ saltahojas componente medio
Suero fetal bovinoSigma AldrichF2442H2G+ componente medio de la tolva

Referencias

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