Artículo de método

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

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DOI:

10.3791/51954

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22 de diciembre de 2014

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1Department of Genetics, UMR_S 968, Institut de la Vision, 2Department of Visual Information, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3Exploratory Team, UMR_S 968, Institut de la Vision, 4Sorbonne Universités, Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 5INSERM, U968, Institut de la Vision, 6CNRS, UMR_7210, Institut de la Vision

En este artículo

Resumen

Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.

Resumen

La retina es una parte del sistema nervioso central que ha organizado la arquitectura, con las neuronas en las capas de los fotorreceptores, ambos conos y bastones en contacto con el epitelio pigmentado de la retina en la parte más distante sobre la retina teniendo en cuenta la dirección de la luz, y el las células ganglionares en la distancia más proximal. Esta arquitectura permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores por vibratome seccionamiento. La retina neural diseccionado de un ratón envejecido 8 días es plana embebido en 4% de gelatina en la parte superior de una rebanada de 20% de gelatina capa de fotorreceptores mirando hacia abajo. El uso de un vibratome y una cuchilla de afeitar de doble filo, el 100 m de espesor retina interna se secciona. Esta sección contiene las células ganglionares y la capa interior con en particular las células bipolares. Una sección intermediario de 15 micras se descarta antes de recuperar 200 m de la retina externa que contiene los fotorreceptores. La gelatina se elimina por calentamiento a 37 ° C. Los pedazos de la capa externa son íncubosted en 500 l de solución de Ringer con 2 unidades de papaína activada durante 20 minutos a 37 ° C. La reacción se detuvo mediante la adición de 500 l 10% de suero de ternera fetal (FCS) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), entonces 25 unidades de DNasa I se añade antes de la centrifugación a TA, se lava varias veces para eliminar el suero y las células se resuspenden en 500 l de DMEM y se sembraron a 1 x 10 5 células / cm 2. Las células se cultivan a 5 días in vitro y su viabilidad se calificó utilizando el ensayo en vivo / muerto. La pureza del cultivo se determina por primera vez por la observación microscópica durante el experimento. La pureza es luego validada por distribución y fijación de las células en un portaobjetos histológico y análisis utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-SAG, un marcador de fotorreceptores y monoclonal de ratón anti-RHO, un marcador específico de los fotorreceptores de varilla. Alternativamente, la capa de fotorreceptores (97% barras) se puede utilizar para el análisis de gen o expresión de la proteína y para el trasplante.

Introducción

La retina es una parte integral del sistema nervioso central que tiene una arquitectura conservada entre los vertebrados. Las neuronas de la retina neural se organizan en capas, con la más lejana de la luz incidente, la capa de fotorreceptores en estrecho contacto con el epitelio pigmentario de la retina (RPE) en la parte posterior del ojo. Conos y bastones photorecptors son células sensibles a la luz que se basan en moléculas sensibles opsina para la captura de fotones. Estas moléculas están encerradas en las membranas de disco de una estructura celular, que se encuentra en el segmento exterior del fotorreceptor que apunta en la dirección de la RPE 1. Esta estructura, que se ve afectado con mayor frecuencia muy temprano en casos de degeneración de los fotorreceptores, se renueva a un ritmo de 10% todos los días. La capa interna llamada contiene la mayoría de las otras neuronas que calculan la señal recibida de los fotorreceptores, el bipolar, amacrinas y células horizontales, así como las células ganglionares. Estas últimas con sus axonesformar un haz que es el nervio óptico. Esta estratificación es tan conservado que los biólogos han utilizado el término desplazados células amacrinas cuando las células se encuentran fuera de la capa plexiforme interna 2. Las capas de neuronas se distribuyen dentro de una armadura de las células gliales radiales Müller. Células bipolares enlazan fotorreceptores a las células ganglionares. Están situados entre la capa plexiforme externa y la capa plexiforme interna. Las células ganglionares de formar la capa plexiforme interna en relación con las células bipolares. Las células amacrin se denominan como células de asociación ubicadas en la capa plexiforme interna entre las células bipolares y células ganglionares. La capa plexiforme externa contiene células horizontales. Esta disposición única de capas neuronales del sistema nervioso central permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores de la capa celular interna por corte de la retina en montaje plano usando un vibratome.

Originalmente, se utilizó esta técnica para aislar los fotorreceptores para transplantation en el ojo del ratón rd1, un modelo de la retinitis pigmentosa humana (RP) 3. El ratón rd1 lleva una mutación recesiva en el gen PDE6B que codifica para la subunidad beta de la fosfodiesterasa-rod específico. Las mutaciones recesivas de este gen producen en los seres humanos RP 4. Después de fotorreceptores han degenerado, el paciente pierde la visión nocturna, y fotorreceptores sorprendentemente cono, que no expresan el gen mutado, degeneran en una segunda etapa. Debido a que los conos se necesitan para la visión del color y de la agudeza visual, los pacientes se vuelven progresivamente ciega y un tratamiento efectivo para la enfermedad aún no se ha desarrollado. Al injertar capa de fotorreceptores de un ratón de tipo salvaje de la degeneración cono del ratón anfitrión se retrasa 3,5. Las barras de perdidas en el modelo degenerativa de conos y bastones no podrían ser reemplazados por un trasplante porque la conexión sináptica entre las barras y las células bipolares sólo se puede obtener en una etapa específica de rdesarrollo etinal, marcado por la aparición de la expresión Nrl 6. La capa de fotorreceptores se introduce por la cirugía en el espacio subretiniano de la retina RD1-rod menos, entre el RPE y la retina externa correspondiente a sólo el 3% de los fotorreceptores restantes, los conos. Dos semanas después de la cirugía, el 40% de los conos del animal trasplantado con una capa normal de fotorreceptores sobrevivió en comparación con el animal trasplantado con una capa normal de las células de la retina interna, o al animal con operación simulada. La topografía de la supervivencia de cono, desplegada sobre toda la superficie de la retina mutado situado en la posición del tejido injertado indica que el efecto protector se debe a una molécula difusible 7.

A continuación, se utilizó un sistema de co-cultivo, así como medios de cultivo condicionados para validar el hecho de que el efecto protector se basa en la secreción de una proteína por varillas 8,9. Nuestra hipótesis es que esta proteína se exprcomputan de forma continua y específicamente por varillas y que su muerte durante la primera fase de la enfermedad se disparará la degeneración secundaria de cono por la pérdida de una señal de protección de las barras de una manera autónoma no celular 10. Debido a la importancia de cono mediada por la visión central en primates esta proteína putativa será una herramienta terapéutica de gran relevancia para RP. Preservar los conos en la RP podría teóricamente evitar que un total de 1,5 millones de pacientes en todo el mundo para convertirse en ciegos 11. Hemos utilizado un enfoque de detección de alto contenido y un modelo de cultivo de cono enriquecido para identificar un ADNc que codifica Cono derivados-Rod Factor Viabilidad (RdCVF) a partir de una biblioteca de ADNc de retina 12. RdCVF es el producto empalmada del gen NXNL1 que, curiosamente es homóloga a la codificación de genes para las proteínas de tiorredoxina que participan en la homeostasis redox 13. El segundo producto de corte y empalme del gen, RdCVFL es una enzima que protege su objetivo, la proteína TAU contra oxidativo damage 14. Administración de RdCVF evita la degeneración secundaria de los conos y la pérdida de su función visual en una recesiva, y el modelo dominante de RP 12,15. Esto demuestra dos aspectos importantes de esta estrategia terapéutica innovadora 16. En primer lugar, se puede aplicar en la mayoría de los casos RP de una manera gen independiente. En segundo lugar, contrariamente al factor de supervivencia compitiendo CNTF, RdCVF está asociado con el mantenimiento de la función visual 17. La ausencia de efecto funcional puede explicar la razón de la ausencia de beneficio clínico de la administración de CNTF a pacientes con RP 18. RdCVF es muy probable que una de las señales de supervivencia importante entre los conos y bastones de rescate desde cono in vitro es inhibida por RdCVF immunodepletion 12. Además, la interrupción del gen viabilidad cono varilla derivados conduce a la disfunción de los fotorreceptores y la susceptibilidad al estrés oxidativo 19.

El uso decapa de fotorreceptores está en el origen de la identificación de RdCVF y de una señal redox novela implicados en enfermedades neurodegenerativas 20. Este manuscrito describe el protocolo usado para aislar y cultivar células de la capa de fotorreceptores para caracterizar la actividad de RdCVF. Los fotorreceptores se pueden mantener en cultivo durante 5 a 7 días 21. Esta técnica también se puede utilizar para estudiar la expresión de genes específicos fotorreceptoras.

Protocolo

NOTA: El procedimiento fue aprobado por el comité de ética de Darwin de la Universidad Pierre y Marie Curie (ce5 / 2009/048)

1. Preparación de la gelatina de soluciones, instrumentos, Vibratome, Cultura Medios de Comunicación y Cultura de la Plata

  1. Preparar una solución de gelatina 20% al menos un día antes del experimento.
    1. Bajo el capó, añadir 500 l de gentamicina [10 mg / ml] a una botella de 500 ml que contiene CO 2 medio independiente (CO 2 -i).
    2. En un vaso de precipitados separado, añadir 20 ml de CO2-I (de la etapa 1.1.1) y se calienta a 95 ° C en un bloque de calentamiento con agitación constante durante 15 min. Observe un cambio de color a amarillo, indicando que la solución está lista para su uso posterior.
    3. Pesar 4 g de gelatina y pobres gradualmente a la solución preparada anteriormente (etapa 1.1.2) con el aumento de la agitación y calentamiento a 95 ° C durante 45 min, para obtener una solución de color amarillo. Deje que la solución de gelatina se enfríe bajoel capó durante aproximadamente 5 minutos.
    4. Verter 4 ml de la solución de gelatina en 35 mm placas de cultivo de diámetro sin introducir burbujas de aire. Mantenga el plato a 21 ° C durante 30 minutos. Cubra los platos con una película de plástico, y girar los platos al revés. Opcionalmente, guardar los platos a 4 ° C durante un máximo de 2 meses antes de su uso.
  2. Preparar una solución de gelatina 4%.
    1. Bajo el capó, añadir 25 ml de CO 2 medio -i en un recipiente de plástico estéril, y se calienta a 42 ° C en un bloque de calentamiento. Retire el medio del bloque de calentamiento y añadir poco a poco 1 g de gelatina para el medio caliente y revolver. Volver rápidamente el recipiente en el bloque de calentamiento (42 ° C) y mantener el calor durante el proceso.
  3. Instauración del aparato vibratome:
    1. Retire los platos que contienen solución de gelatina al 20% se almacena a 4 ° C. Cortar la gelatina con un bisturí. Da la vuelta al trozo de gelatina y pegarlo en el disco de soporte negro del vibratome usando una gota de spegamento uper.
    2. Romper una hoja de afeitar en dos mitades, e inserte un medio en el receptáculo que sostiene vibratome. Inserte el disco de soporte negro sobre el aparato vibratome. Gire la perilla de negro en el lado derecho. Fijar el recipiente con el jefe de la vibratome. Agregue la cantidad suficiente de CO 2 medio -i en el tanque vibratome para cubrir el bloque de gelatina.
    3. Encienda el vibratome y cortar tres 100 micras rodajas de bloque de gelatina. Mantenga el bloque de gelatina para su uso posterior.
  4. Preparar 40 ml de medio de cultivo:
    1. Preparar medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS) bajo el capó. Preparar 1 mg / ml de poli-D-lisina usando tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4.
    2. En una placa de 96 pocillos, añadir 2 g / cm 2 de poli-D-lisina para cubrir el fondo de los pocillos. Incubar la placa durante 45 minutos a 37 ° C en 5% de CO2. Después de la incubación, retirar PBS y reemplazar con 200 l/ Pocillo DMEM y lugar de nuevo a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora antes de usar.

2. Disección de Retina completa

  1. Enuclear el ratón:
    1. Sacrificar el ratón de acuerdo a la directiva europea 2010/63: por dislocación cervical. Cortar la cabeza con curvas-tijeras y lo coloca en una placa de Petri de diámetro 100 mm después de haber desinfectado el ojo con desinfectante.
    2. Retire el ojo después de haber separado el nervio óptico seccionando usando con mucho cuidado una empuñadura curvada. A continuación, coloque los dos ojos en una placa de Petri de 35 mm que contiene CO 2 medio -i estéril a 21 ° C.
  2. Extracción de la retina:
    1. Hacer un agujero en el nivel del ojo de la extremidad con la ayuda de una aguja de 18 G para poder introducir las tijeras en el globo ocular. Introducir tijeras rectas dentro del agujero y cortar cuidadosamente la esclerótica debajo de los iris en todo el perímetro del globo ocular para eliminar cuerpo ciliar.
    2. Eliminar la córnea y la lente y mantener la cámara posterior del ojo con la retina contigua a la esclerótica. Con dos apretones finas, quitar el vítreo situado dentro de la cámara posterior sin dañar la retina. Realizar cuatro cortes radiales (retina / esclerótica) para permitir el aplanamiento de la retina.
    3. Repunte del globo ocular y pelarlo como "naranja". Separe la retina de la esclerótica y epitelio pigmentario retiniano (EPR). Separe la retina todavía unido a nivel del nervio óptico muy cuidadosamente con finas curvas-tijeras.
    4. Separar el vítreo restante desde la periferia hacia el centro de la retina con dos empuñaduras finas. Asegúrese de que todo el vítreo se elimina completamente para permitir el aplanamiento de la retina.
    5. Cortar el extremo de una pipeta de plástico y transferir la retina a una placa de Petri de diámetro 35 mm que contiene CO 2 medio -i con la pipeta de plástico.

3. Sellado de-mounte planad Retina en gelatina Bloquear

  1. Retire 20-30 ml de CO 2 medio -i del tanque vibratome (el bloque de gelatina es gratis) para permitir el sellado de retina en montaje plano.
  2. Transferir la retina a un portaobjetos de vidrio usando una pipeta de plástico y añadir una gota de CO 2 medio -i antes de transferir a la rodaja de gelatina con el fotorreceptor hacia abajo en la rebanada de gelatina.
  3. Coloque la retina al bloque de gelatina mediante la inyección suavemente calentado 4% de gelatina en un lado del bloque entre la retina y el bloque de gelatina y al mismo tiempo la expulsión de gelatina caliente en el otro lado.
  4. Aspirar 4% de gelatina con una pipeta pasteur. Espere 10 minutos para permitir la total estanqueidad. Añadir CO 2 medio -i para sumergir el bloque y la pala por completo.

4. Seccionamiento la Retina

NOTA: Este paso es crítico para obtener una capa de células fotorreceptoras sin las otras células de la retina (Figura 1).

  1. A partir de la parte superior del bloque de gelatina, cortar 100 m de serie de secciones para llegar a la retina. A continuación, corte 100-120 micras secciones de la capa interior. Dependiendo de la aplicación, esta capa puede ser desechada o se almacena en nitrógeno líquido. Asegúrese de que la velocidad de la vibratome es muy lento (a 1 o 2) durante el seccionamiento de la capa o capas interiores fotorreceptores.
  2. Realizar intermedios 15 micras secciones de la retina correspondiente a la interfaz entre el interior y la retina externa. Observe esta sección con un microscopio. La ausencia de vasos sanguíneos indica que se ha alcanzado la retina externa.
  3. Cortar 200 m de la retina externa (la capa de fotorreceptores) con gelatina y la transfiere a un plato de 35 mm de diámetro lleno con 3 ml de CO 2 medio -i. Guárdelo en hielo hasta que se obtengan todas las secciones de la capa de fotorreceptores de todas las retinas.

5. Las células fotorreceptoras disociar

  1. Sacar la fuente (es) que contiene la capa (s) de los fotorreceptores y ponerlo (ellos) en una incubadora a 37 ° C durante 10 min.
  2. Utilizando unas pinzas separan suavemente la capa de fotorreceptores de la gelatina y la transfiere en una nueva placa llena con 3 ml de solución de Ringer. Repita este paso (5.2) para cada preparación capa de fotorreceptores.
  3. Incubar 2 unidades de papaína con 25 l de solución de activador (EDTA 1,1 mM; 5,5 mM L-cisteína; 60 mM β-mercaptoetanol) en un tubo estéril de polipropileno de 5 ml y se incuba 30 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora . La activación de la papaína se consigue a 37 ° C. Durante la incubación, corte la capa de fotorreceptores en 2 mm 2 piezas (no demasiado pequeñas) y la transferencia de estas piezas en un tubos de 5 ml.
  4. Enjuague la retina dos veces con 1,5 ml de solución de solución de Ringer, seguido por sedimentación por gravedad. Retire toda la solución restante de Ringer del tubo con la muestra.
  5. Añadir 475 l de solución de Ringer al tubo que contiene papaína activado y mezcla. Añadir esta solución al tubo que contiene la retina.
  6. Incubar el tubo con la retina durante 20 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora. Detener la reacción mediante la adición de 1 ml de 10% de FCS en DMEM. Añadir 25 U de desoxirribonucleasa I (ADNasa I) a ADN digerido a partir de células de muerte. Homogeneizar cuidadosamente la suspensión celular usando una pipeta de 1 ml-. Gira a 50 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente.
  7. Descartar el sobrenadante para eliminar trazas de suero y se añade medio DMEM con suplementos (ver tabla de reagents_equipment específica) a la célula-pellet y resuspender cuidadosamente la suspensión de células con una pipeta de 1 ml. Gira a 50 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso (5.7) una vez más.

6 cultivar células fotorreceptoras

  1. La capa de fotorreceptores de un ratón en PN8 contiene alrededor de 1 y 1,5 millones células utilizando esta técnica. Sembrar las células fotorreceptoras en 1x 10 5 células / cm 2 en una placa de cultivo con medio de cultivo y cultivar las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO2. El día 5, proceder a la inmunoquímica y métodos de estudio tras el Western Blot proporcionados por los proveedores de anticuerpos.
    NOTA: Los pasos para detener la cultura y los ensayos preliminares se describen en la referencia 21.

Resultados

Aparte de trasplante, las capas fotorreceptoras también se han utilizado para estudiar la señalización celular mediante la siembra de las células para hacer culturas fotorreceptoras 12,22. Además, se utilizan para estudiar la expresión génica y 23,24 ritmo circadiano. Hemos utilizado la capa de fotorreceptores de células de un ratón de tipo salvaje en el día postnatal 8 para preparar cultivos de fotorreceptores en ausencia de FCS y mantenido las células durante 5 días a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2 (Figura 1E ). Las células se fijaron a continuación, utilizando 4% paraformaldehído y luego procedieron para el análisis inmunocitoquímico utilizando métodos proporcionados por los proveedores de anticuerpos, ya sea con anticuerpo monoclonal de ratón anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) o policlonal de conejo anti-SAG (1: 200, una generosa don de Igal Gery y David Hicks). Utilizamos anti-RHO y anti-SAG (aunque los conos de la etiqueta anti-SAG, varillas), debido al hecho de que el anti-SAG es un marcador temprano, que anti-RHO. La proporción de cells positivos para el anticuerpo anti-Rho está más bajos que los positivo para los anticuerpos anti-SAG (Figura 2). Esto puede explicarse por el hecho de que SAG, la arrestina varilla también se expresa por los conos que hacen que 3% de los fotorreceptores en la capa aislado, o alternativamente por el hecho de que durante la maduración post-natal de la retina, la expresión de SAG que precede de RHO 25,26.

La capa de fotorreceptores también se utilizó para controlar la expresión específica de genes por los fotorreceptores de la retina de tipo salvaje y el cerebro de los animales de 35 días de ARN se prepararon utilizando CsCl ultracentrifugación 27 y se hibridan a la matriz de chips de ADN de ratón. Los mensajeros de la rodopsina (RHO), S-arrestina (SAG) y el cono-transducina (Gnat2) se expresan específicamente en la retina en comparación con el cerebro (Figura 3A). La expresión es prominente en la capa de fotorreceptores (PR) que en toda la retina que abarcala capa retiniana interna que muestra que estos genes se expresan de hecho por fotorreceptores. Para Gnat2, la expresión relativa en comparación con Rho y el SAG muestra que se expresa por los conos contenidos dentro de la capa de fotorreceptores aislado. La expresión de recoverina (Rcvrn) en la capa de fotorreceptores en comparación con toda la retina se aumenta (Figura 3B).

La capa de fotorreceptores también se utilizó para controlar la expresión de Rho y GNAT2 utilizando el Western Blot siguiendo métodos proporcionados por los proveedores de anticuerpos y comparar a la capa retiniana interna (Figura 4). Nótese la ausencia de RHO y GNAT2 28, los marcadores de bastones y conos, respectivamente, en toda la retina y en la retina de rd1 ratón en día postnatal 35.

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Fifigura 1. Vista esquemática del seccionamiento vibratome de retina del ratón. (A) Instalación de la retina en montaje plano con el fotorreceptor hacia abajo en la rebanada de gelatina. (B) Sección de la retina interna con la hoja vibratome. (C) Sección de la retina externa añade la gelatina. (D) Control de la presencia de los fotorreceptores en el borde del fragmento de retina después del aislamiento de la capa de fotorreceptores. Barra de escala utilizado para la fluorescencia verde se utiliza un microscopio de luz blanca. Los fotorreceptores se encuentran en el borde de la imagen. (E) cultivadas de células fotorreceptoras (post-cinco días). (F) Un mayor aumento de panel de E.

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Figura 2. Expresión diferencial de RHO y SAG en la cultura de los fotorreceptores de ratón. (A) La tinción de los núcleos (imagen azul), (B) tinción SAG (verde), (C) tinción RHO (rojo). (D) se fusionaron. Debido a la tinción de SAG se expresa antes de lo tinción RHO, sólo dos células se doble etiquetados SAG y RHO (ver *). Barra de escala:. 23 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Comparación de la expresión de tres genes en el cerebro y toda la retina y los fotorreceptores de los animales de tipo salvaje a los treinta y cinco días. (A) La rodopsina (RHO), S-arrestina (SAG) y el cono-transducina (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) y Recoverin (Rcvrn). Los datos se muestran como expresión relativa. La expresión relativa es una expresión de valorobtenida a partir de los datos de microarrays después normaliszation con el software robusta gama Multi-Media (RMA) disponibles en la base de conocimientos KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/).

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Figura 4. Expresión de RHO y GNAT2 en retina externa de una de tipo salvaje retina en postnatal día 35. La ausencia de su expresión en la retina interna y en la retina del ratón rd1 en postnatal día 35. ACTB, beta actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La retina es un modelo de órgano en la biología. Estudio de la retina llevó a 6 grandes descubrimientos en la biología. Es en el origen de la primera gen supresor de tumor RB1. Revela el vínculo molecular entre los receptores de tirosina quinasas y las MAP quinasas a través de la interacción con Hijo de sevenless. Se participó en el descubrimiento de PAX6, el primer gen de control maestro para la morfogénesis de órganos. Es en el centro de la asociación genética del factor H del complemento (CFH) con degeneración macular relacionada con la edad (AMD), el primer gen de susceptibilidad enfermedad identificada por la pantalla de asociación amplia del genoma (GWAS). Por último, se llevó a la primera terapia génica exitosa para la amaurosis congénita de Leber, el primer ensayo de terapia génica correctiva en humanos de cualquier enfermedad hereditaria. La estructura de este órgano se conserva en la mayoría de las especies de vertebrados. Su accesibilidad para la manipulación in vivo ha animado desde el principio de la genómica funcional investigaciones en esta parte integral del cientoral sistema nervioso.

Mostramos aquí cómo separar la capa de fotorreceptores de la capa interna de la retina por vibratome seccionamiento. Este paso es fundamental para obtener cultivos puros fotorreceptoras. Nuestro protocolo de disección hace que la contaminación por células del RPE muy poco probable.

Uno de los principales retos es el aplanamiento de la retina que es necesario seccionar adecuadamente el interior y la retina externa. El seccionamiento de la retina es mejor en la retina con diámetro pequeño como los de los roedores y este diámetro es una limitación de la técnica con el material disponible actual.

Es aconsejable antes de comenzar un experimento biológicamente significativo, para practicar en una muestra de la retina. Se ilustra el método por los resultados representativos obtenidos a partir de células fotorreceptoras cultivadas, utilizando el material para estudiar la expresión de ambos ARNm y proteínas de realizar. Los estudios de expresión también se puede realizar alternativamente en seccións obtuvieron por captura láser microdissection, pero los cultivos se realizan mejor usando vibratome seccionamiento. Podríamos haber utilizado la técnica de láser microdisección con una estrategia completamente diferente. Pero, para recoger la capa de fotorreceptores con el aparato de microdisección por la cultura, sería necesario evitar fijador y esto complicaría la actual metodología de manera significativa.

Estamos desarrollando un protocolo destinado a estudiar la cinética de la expresión génica y proteica en vibratome secciones durante la degeneración de fotorreceptores en modelos de retinosis pigmentaria. Creemos que la descripción detallada del protocolo será de utilidad para los investigadores en el campo de la biología de la retina, y muy especialmente para los estudios de proteómica y metabolómica.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Igal Gery y David Hicks para anticuerpos anti-SAG. Ram Fridlich por leer el manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Citidina 5′-difosfocolina*Sigma-AldrichC02564.7 µ M Cytidine 5′-difosfocolina
Cytidine 5′-difosfoetanolamina*Sigma-AldrichC04562.7 µ M Cytidine 5′-difosfoetanolamina
Linoleï ácido c/ albúmina sérica bovina (BSA)*Sigma-AldrichL8384100 µ g/ml de linolï ácido c / albúmina sérica bovina (BSA)
Triyodo-L-tironina *Sigma-AldrichT63970.03 y micro; M Triiodo-L-tironina
Placas de 96 pocillosGreiner bio-one655-095
Microscopio binocularLeicaMZ-75
CO2 independiente (CO2-i)Life Technologies18045054
DMEMLife Technologies41966029 Pinzas
n° 5 DumontBionic11254-20
Gelatina de piel de porcina tipo ASigma-AldrichG2500
GeneChip AffymetrixU74v2
Solución de gentamicinaLife Technologies 15710049
Hidrocortison*Sigma-AldrichH08880.55 µ M hidrocortison
Insulina* (I)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.86 µ M insulina (I)
PapaínaWorthington-biochemWOLS03124
Poly-D-lisinaSigma-AldrichP-6407
Progesterona*Sigma-AldrichP7556 2.0 y micro; M progesterona
Prostaglandina*Sigma-AldrichP51720.28 µ M prostaglandina
Putrescina*Sigma-AldrichP5780182 µ M putrescina
Bisturí AlbionEMS72000
TijeraMoria15396-00
Piruvato de sodio*Sigma-AldrichS86361 mM piruvato de sodio
Selenito de sodio* (S)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.29 µ M Na2SeO3    (S)
Taurina*Sigma-AldrichT86913 mM taurina
Transferrina* (T)Sigma-AldrichI1884 (ITS)0.07 µ M transferrina (T)
Aparato de vibratomoLeicaVT1000-S
* Suplementos

Referencias

  1. The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (2014).
  2. Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
  3. Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
  4. Daiger, S., Sullivan, L., Bowne, S. RetNet, the Retinal Information Network. , The University of Texas Health Science Center. Houston, TX. Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014).
  5. Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
  6. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
  7. Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
  8. Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
  9. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
  10. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
  11. Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
  12. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
  13. Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
  14. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  15. Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
  16. Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47(2005).
  17. Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
  18. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
  19. Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
  20. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16(2010).
  21. Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
  22. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  23. Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
  24. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  25. Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
  26. Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
  27. Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
  28. Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).

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