registros de pares son registros simultáneos de pinza de parche de célula completa de dos neuronas conectadas sinápticamente, lo que permite una caracterización electrofisiológica y farmacológica precisa de las sinapsis entre neuronas individuales. Aquí describimos la metodología detallada y los requisitos para establecer esta técnica en cultivos organotípicos de cortes de hipocampo en cualquier laboratorio equipado para electrofisiología.
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Artículo de método
Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
registros de pares implican grabaciones simultáneas de pinzas de parche de células completas de dos neuronas conectadas sinápticamente, lo que permite no solo la caracterización electrofisiológica directa de las conexiones sinápticas entre neuronas individuales, sino también la manipulación farmacológica de la neurona presináptica o postsináptica. Cuando se lleva a cabo en cultivos organotípicos de cortes de hipocampo, la probabilidad de que dos neuronas estén conectadas sinápticamente aumenta significativamente. Esta preparación permite fácilmente la identificación de los tipos de células, y las neuronas mantienen su morfología y propiedades de función sináptica similares a las del tejido cerebral nativo. Una ventaja importante de los registros de células enteras emparejadas es la información altamente precisa que puede proporcionar sobre las propiedades de la transmisión sináptica y la plasticidad que no son posibles con otras técnicas más rudimentarias que utilizan la estimulación axonal extracelular. Las grabaciones de células completas emparejadas a menudo se perciben como demasiado difíciles de realizar. Si bien hay aspectos desafiantes en esta técnica, las grabaciones emparejadas pueden ser realizadas por cualquier persona capacitada en el sujetado de parches de células completas, siempre que se sigan criterios metodológicos y de hardware específicos. La probabilidad de lograr registros emparejados sinápticamente conectados aumenta significativamente con cortes organotípicos sanos y micromanipulación estable que permite el logro independiente de registros pre y postsinápticos de células completas. Si bien los pares de células piramidales CA3-CA3 son los más utilizados en la preparación organotípica del hipocampo de corte, esta técnica también ha tenido éxito en pares CA3-CA1 y se puede adaptar a cualquier neurona que esté conectada sinápticamente en la misma preparación de corte. En este manuscrito proporcionamos la metodología detallada y los requisitos para establecer esta técnica en cualquier laboratorio equipado para electrofisiología.
Introducción
Los receptores de glutamato median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora en las sinapsis del sistema nervioso central. Los dos subtipos principales de receptores ionotrópicos de glutamato localizados en la cabeza de la columna vertebral de la membrana postsináptica son N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico ácido (AMPA). En reposo los potenciales de membrana, receptores AMPA llevan la mayor parte de la corriente postsináptica durante la transmisión sináptica. En el hipocampo, el receptor de NMDA juega un papel clave en el desencadenamiento de los cambios en el número de receptores AMPA en la membrana postsináptica: al ....
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Protocolo
Declaración de Ética Animal:
Los protocolos descritos en este manuscrito siguen las directrices de cuidado animal establecidas por la Universidad de Auckland y la Universidad de Stanford. P7 crías de rata fueron sacrificados por decapitación rápida. La disección del hipocampo se realiza entonces inmediatamente como se describe a continuación.
1. organotípicos del hipocampo rebanada Cultura
- Preparación
- Preparar el medio de disección (sólo se utiliza para diseccionar el cerebro). Combinar 200 ml de medio esencial mínimo, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada u....
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Resultados
Conectividad sináptica es evidente mediante la estimulación de la neurona presináptica para disparar un potencial de acción por el que pasa un impulso de corriente de despolarización (típicamente 20-50 Pa durante 20 mseg) a través del electrodo de registro. La traza actual postsináptica se examina para detectar la presencia de un EPSC monosináptico evocado en corto (<5 ms) y latencias consistentes después del pico del potencial de acción presináptica (Figura 3A). En la mayoría de los experimentos múl.......
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Discusión
Aquí hemos descrito los requisitos para establecer exitosas grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. Grabaciones apareadas también se pueden realizar en múltiples preparaciones, incluso en lonchas agudas y sistemas de cultivo disociadas 26,27. Mientras que el enfoque aquí ha estado en la inducción de formas de plasticidad sináptica (LTP y LTD saber) más largos, es importante destacar que las grabaciones de células enteras pareadas en organotípico, rebanada agud.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Montgomery y Madison por su útil discusión. Agradecemos la financiación recibida de las siguientes fuentes en esta investigación: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC y NIH.
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Materiales
2
esencial mínimo Solución madre Tris salina equilibrada miniatura recubiertas de plástico suave manual de filtro membranade CO
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Micromanipuladores motorizados estables | de medio | ||
| Solución de penicilina-estreptomicina | Baño de tejido poco profundo | ||
| tampón HEPES | Cámara DIC | ||
| 1 M Solución | Amplificador | ||
| Hank' s Suero de caballo de computadora de solución | |||
| Mesa de aislamiento de vibraciones | |||
| Espátulas | Microscopio vertical | ||
| Pincel | Software de adquisición y análisis de datos | ||
| Picador | de tejidos Extractor de electrodos | ||
| #2 Papel | Jaula de Faraday | ||
| #5 Pinzas | |||
| Insertos de | |||
| Incubadora | |||
| Campana de disección Campana | |||
| de clase II |
Referencias
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation - A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T.
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Reimpresiones y permisos
