La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Resumen

Este protocolo presenta un método eficiente y fiable para transfectar humanos THP-1 macrófagos con siRNA o ADN plásmido por electroporación con una alta eficiencia de transfección mientras se mantiene alta la vitalidad celular y la capacidad de los macrófagos completo para la diferenciación y polarización.

Resumen

Los macrófagos, como actores clave de la respuesta inmune innata, están en el foco de la investigación frente a la homeostasis del tejido o diversas patologías. La transfección con siRNA y el plásmido de ADN es una herramienta eficaz para el estudio de su función, pero la transfección de los macrófagos no es un asunto trivial. Aunque muchos enfoques diferentes para la transfección de células eucariotas están disponibles, sólo pocos permiten la transfección fiable y eficiente de los macrófagos, pero redujo la vitalidad celular y comportamiento de las células gravemente alterada como la capacidad disminuida para la diferenciación o la polarización se observan con frecuencia. Por lo tanto se requiere un protocolo de transfección que es capaz de transferir siRNA y ADN plásmido en macrófagos sin causar efectos secundarios graves, permitiendo así la investigación del efecto de la siRNA o plásmido en el contexto del comportamiento celular normal. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para la transfección de humanos THP-1 macrófagos y Monocytes con alta vitalidad celular, alta eficiencia de transfección, y mínimos efectos sobre el comportamiento celular. Este enfoque se basa en Nucleofection y el protocolo se ha optimizado para mantener la capacidad máxima para la activación de células después de la transfección. El protocolo es adecuada para células adherentes después de la separación, así como células en suspensión, y se puede utilizar para pequeñas y medianas números de muestra. Por lo tanto, el método presentado es útil para la investigación de genes efectos reguladores durante la diferenciación de macrófagos y la polarización. Además de presentar los resultados que caracterizan macrófagos transfectados según este protocolo, en comparación con un método químico alternativo, también se discute el impacto del cultivo de células de selección medio después de la transfección en el comportamiento celular. Los datos presentados indican la importancia de la validación de la selección para los diferentes parámetros experimentales.

Introducción

Entre los componentes celulares del sistema inmune humano, los macrófagos son de gran importancia para la respuesta inmune innata. Sus tareas son diversas; que están involucrados en la fagocitosis de patógenos y material necrótico, juegan un papel importante en la homeostasis del tejido y producen y secretan un gran número de citoquinas para regular y orquestar la respuesta inmune ^1. Por lo tanto los macrófagos están implicados integralmente en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos condiciones. Debido a la diversidad de sus tareas, los macrófagos son un tipo de célula muy heterogéneo y multifacético. Esto se logra por diferentes polarizaciones; en función de los macrófagos estímulos externos puede desarrollar en diferentes fenotipos ^2. Variabilidad e impacto macrófagos 'en la respuesta inmune hacen una investigación muy interesante tema. Con el fin de dilucidar su complejo de las funciones metabólicas y reguladoras, macrófagos apropiado en modelos in vitro son reqpedirá otra que refleja correctamente la heterogeneidad de los macrófagos y la variabilidad.

La transfección de células con vectores de ADN plásmido o pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) con el fin de alterar la expresión génica celular se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada y de gran alcance en biología celular para investigar tanto la regulación génica y la función génica. Actualmente hay una gran selección de diferentes herramientas disponibles para la transfección de células eucariotas. Estas herramientas incluyen la aplicación de vectores virales, métodos mecánicos (tales como pistolas de genes), enfoques químicos (que se basan en polímeros o lípidos que pueden formar complejos con ácidos nucleicos), y la electroporación de las células ^3. Todos estos enfoques tienen sus ventajas y desventajas y la elección de la más adecuada de esta amplia gama para un tipo específico de célula y la aplicación puede ser un proceso que consume tiempo y difícil.

Los macrófagos son notoriamente difíciles de transfectar transfe como todos bien establecida casienfoques ction reducen drásticamente la viabilidad macrófagos 'o interfieren con su comportamiento, es decir, la diferenciación y en particular la polarización. Por lo tanto, se presenta aquí un protocolo eficiente, no viral para transfectar humanos THP-1 macrófagos utilizando la tecnología Nucleofector basado en electroporación, lo que representa un enfoque optimizado electroporación requieren cantidades reducidas de ADN. Nucleofection está bien adaptado para las células sensibles, como los monocitos y macrófagos. Este protocolo es una adaptación de las versiones publicadas previamente ^4,5.

En resumen, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) se utiliza para diferenciar humanos THP-1 monocitos durante 48 horas en macrófagos prematuros antes de la transfección con siRNA o ADN plásmido. Para la transfección de los macrófagos predifferentiated se separan enzimáticamente mediante el tratamiento Accutase I. La transfección se realiza utilizando un dispositivo 2b Nucleofector para la electroporación de las células. Después de la transfección, difierenciación se continúa durante otro 24 a 48 horas según sea necesario. Finalmente, los macrófagos maduros transfectadas se incuban con diferentes tipos de compuestos para los estudios funcionales.

Este enfoque permite la transfección de líneas celulares tales como humanos THP-1 monocitos y macrófagos y se ha aplicado con éxito en el pasado ^6-10. En contraste con la mayoría de los enfoques de transfección química, nuestro procedimiento Nucleofection modificado usando macrófagos prematuros produce altas eficiencias de transfección en combinación con la viabilidad celular intacta, sin la necesidad de utilizar vectores virales o añadir compuestos portadores adicionales con efectos secundarios desconocidos. Además, los macrófagos conservan su potencial de diferenciación, así como la polarización permitiendo así que las investigaciones funcionales sin obstáculos después de la transfección ^11.

Además, el medio de cultivo celular después de aplicado Nucleofection influye fuertemente en estudios funcionales siguiente transfection; En particular, la capacidad de los macrófagos 'para polarización puede verse afectada en función de medio de cultivo aplicado. Aquí cuatro diferentes tipos de medios de cultivo celular (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 y ratón T Cell medio Nucleofector) se pusieron a prueba en condiciones de desactivación mediante la interleucina (IL) 10 Uso de THP-1 macrófagos, se observó que la capacidad de respuesta celular a IL10 es más fuerte cuando se utiliza el medio de la célula T Nucleofector de ratón en comparación con el otro medio de cultivo mencionado anteriormente. Estos resultados demuestran que la optimización adecuada de todas las condiciones de cultivo celular es esencial para la transfección con éxito los estudios funcionales posteriores und ya que éstos pueden mejorar significativamente los resultados experimentales.

Como los macrófagos están implicados en varias enfermedades humanas, mucha investigación se centra en la aclaración de comportamiento de los macrófagos, así como mecanismos reguladores que influyen en los macrófagos o a su vez controlados por los macrófagos. Por lo tanto, este protocolo es de relevancia enmuchas diferentes áreas de investigación.

Protocolo

1. prediferenciación de THP-1 macrófagos

1. Cultivar las células THP-1 en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina / L-glutamina (PSG) en un CO ₂ (5% ) incubadora a 37 ° C.
2. Antes de la transfección, las células dividir y transferirlos a un medio RPMI fresco como antes. Cultivar las células durante 24 horas.
3. Semilla de 1,0-1,5 x 10 ⁷ células en un matraz de cultivo de tejido 75 cm ² o 2,5 x 10 ⁷ células en un tejido de 150 cm ² cultivo en matraz en un medio RPMI-1640 y añadir 10% (v / v) de FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de piruvato de sodio, 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales, 10 ng / ml de PMA, y 50 mM β-mercaptoetanol durante 48 horas.

2 Preparación de Nucleofection

1. Coloque Accutase yo y todos los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C.
2. Aspirar el medio de cultivo del frasco y reemplazar con 6 ml (frasco de 75 cm ²) o 12 ml (frasco de 150 cm ²) deAccutase I y se incuba durante 30 min a 37 ° C para la completa separación de las células. Observe la morfología celular después del tratamiento Accutase I para asegurar que las células tienen una apariencia redonda. Si todavía aparecen algunas células que se adjunta, enjuague con cuidado el frasco con una micropipeta o golpear suavemente el cuerpo para completar el desapego. No utilice raspadores de células, ya que esto tendrá un efecto negativo sobre la vitalidad celular. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml.
3. Durante el tratamiento Accutase I, preparar los siguientes medios:
   1. Preparar medio de transfección: suplemento de medio de cultivo celular con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de ácidos no esenciales aminoácidos, 1% (v / v), piruvato de sodio y 5% (v / v) de suero humana (por siRNA) o 20% (v / v) de suero humano (por ADN plásmido); preparar un volumen final de cualquiera de 3 ml / muestra para una placa de 6 pocillos o 4 ml / muestra por dos placas de 12 pocillos.
   2. Preparar medio de cultivo: medio de cultivo suplemento con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales, 1% (v / v) de piruvato de sodio, y 5% (v / v) husuero de hombre (por siRNA) o 20% (v / v) de suero humano (por plásmido), 2,5 ng / ml de PMA, y 50 mM β-mercaptoetanol; preparar un volumen final de cualquiera de 3 ml / muestra para una placa de 6 pocillos o 4 ml / muestra por dos placas de 12 pocillos.
4. Suspensión de células se centrifuga durante 5 min a 300 xg a temperatura ambiente.
5. Células Aspirar Accutase I y volver a suspender en 1 ml de medio RPMI precalentado a 37 ° C; contar las células para determinar el número de células.
   NOTA: Cuando se utilizan procedimientos de recuento de células automáticas rápidas, pasos 2.4 y 2.5 pueden ser omitidos y las células se pueden contar inmediatamente después de la separación, siempre que se evite la exposición prolongada a Accutase yo.
6. Para cada muestra de transfección preparar alícuotas en tubos de centrífuga que contienen 2,0 a 2,5 x 10 ⁶ células.

3. Nucleofection de THP-1 macrófagos

1. Centrifugar todos los alícuotas durante 10 min a 250 xg a temperatura ambiente.
2. Diluir el ADN plásmido o siRNA en libre de nucleasaagua o un tampón apropiado. Mantenga el volumen requerido de ADN de plásmido o siRNA tan pequeño como sea posible.
3. Preparar una cubeta Nucleofector ya sea con 1 g de siRNA o 0,5 g de ADN plasmídico para cada transfección.
4. Realice una transfección a la vez. Aspirar el sobrenadante de la alícuota de células.
5. Resuspender las células sedimentadas en solución de Nucleofector para producir un volumen total de 100 l de ADN / siRNA y solución de Nucleofector. Mantener el tiempo de exposición a la solución de Nucleofector pura a un mínimo y asegurar que el tiempo de exposición no exceda 15 min.
6. Mezclar células resuspendidas y ADN / siRNA en Nucleofector cubeta con unos golpecitos suaves.
7. Transfectar células mediante la realización de programa Y-001 en el dispositivo de Nucleofector 2b.
8. Transferir las células transfectadas en un vial de reacción utilizando pipetas Pasteur de plástico desechable.
9. Inmediatamente después, añadir 500 l de medio de transfección preparado.
10. Repita los pasos 3.4 a 3.9 para cada muestra de transfección.

4. Post-Nucleofection Care

1. Prepara ya sea de 6 pocillos o de 12 pocillos de células transfectadas. Pipetear 2,5 ml de medio de transfección en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (1 así / transfección) o 1,75 ml de medio de transfección en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (2 pozos / transfección).
2. Mezclar las suspensiones de células a fondo con una micropipeta.
3. Transferencia de las células transfectadas en los pocillos preparados (ya sea un pocillo de una placa de 6 pocillos o dos en una placa de 12 pocillos).
4. Incubar las placas durante 4 horas en un incubador humidificado (5% de _CO2, 37 ° C).
5. Compruebe la reinserción de las células al microscopio.
   NOTA: La mayoría de las células debe ser adherente de nuevo. Ocasionalmente, se extiende el período de incubación por 1 hr aumenta el número de células adherentes en caso de reinserción insuficiente.
6. Aspirar cuidadosamente medio de transfección con una micropipeta y reemplazar con la misma cantidad de medio de cultivo. Aspirar sólo un pozo a la vez.
7. Se incuban las células para el período de tiempo requerido para un efecto máximo de plásmido o siRNA (24-72 h). Si los períodos de incubación superior a 48 horas, sustituya medio después de 48 hr.
8. Para el tratamiento adicional con efectores (por ejemplo., Citoquinas, agonistas, antagonistas e inhibidores) utilizan medio libre de suero sin PMA y β-mercaptoetanol. Tiempo final del período de incubación del efector con el tiempo de efecto máximo del plásmido o siRNA y planificar el cambio de medio y la adición del efector en consecuencia. No mantener las células en condiciones libres de suero durante más de 24 horas.

Resultados

Usando este protocolo para la transfección de THP-1 macrófagos con siRNA por lo general alcanzar tasas de transfección de por encima de 90% sin una reducción significativa de la vitalidad celular. Figura 1 muestra los datos representativos que caracterizan el estado de las células 24 horas después de la transfección con ARNip marcado con fluorescencia frente a una no transfectadas de control, que no fueron tratados con reactivos nucleofection y el pulso o siRNA pero recibió todos los cambios de los medios de cultivo como muestras transfectadas. En la Figura 1A, la morfología celular se muestra de acuerdo con la medición de citometría de flujo. Las imágenes microscópicas se muestran en la Figura 1B Figuras 1C y 1D representan las tasas bajas para la apoptosis (control: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). Y necrosis (control: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) que indican la vitalidad celular afectado. La necrosis y la apoptosis son ligeramente más altos para la muestra transfectadas como transfectadas THP-1 macrófagos son másdifíciles de separar que las células no transfectadas, por lo tanto la probabilidad de daño celular durante los aumentos de desprendimiento. Finalmente la eficiencia de transfección se presenta en la Figura 1E. Como toda la población transfectada se desplaza contra el control, esto indica que todas las células son transfectadas que se confirma por las imágenes microscópicas de fluorescencia (Figura 2B). Tanto el flujo de datos de citometría así como imágenes microscópicas de fluorescencia indican que todas las células son transfectadas de manera compatible con la distribución homogénea de siRNA entre las células, así como dentro de las células. Esto está en contraste con muchos reactivos de transfección químicos, para la comparación las Figuras 2A y 2B muestran los datos de citometría de flujo de fluorescencia respectivas y las imágenes microscópicas para un agente de transfección química usando un enfoque basado en lípidos. Estas cifras muestran que dos poblaciones distintas de células transfectadas pueden ser detectados. La primera población es similar a las células transfectadas Folloala Nucleofection. Se caracterizan por baja fluorescencia global y la distribución homogénea de ARNsi en las células. La segunda población está marcada por una fluorescencia más intensa que se origina a partir de aglomerados intracelulares muy brillantes de siRNA. La morfología celular se ve afectada por ambos enfoques de transfección como se muestra por contraste de interferencia diferencial en la Figura 2C. Las transfecciones utilizando rendimiento de ADN plásmido efectivamente resultados similares, por favor ejemplos se refieren a Robenek et al. (2009) ⁹ o Xie et al. (2006) ^7.

La elección del medio de cultivo celular después de la transfección es de gran relevancia; por lo tanto, diferentes medios de cultivo celular se ensayaron en comparación. Los medios de comunicación seleccionados son adecuados para el cultivo de las células THP-1 y fueron elegidos de acuerdo a las recomendaciones de Lonza como medios aplicables para post-Nucleofection cultivo. Figura 3 representa el MEDIAT siRNAed eficiencia desmontables mediante un siRNA dirigido contra IL10RB (interleuquina 10 receptor de la cadena β) mRNA. Para todos los medios ensayados la expresión de IL10RB se redujo significativamente hasta aproximadamente 10 a 20% del nivel de control (Figura 3). Sin embargo, las células transfectadas difieren dependiendo del medio de cultivo en su potencial de polarización. THP-1 macrófagos transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico o IL10RB-siRNA fueron cultivadas en diferentes medios de comunicación después de la transfección y se tratan con IL10. Posteriormente, los niveles de expresión del gen SOCS3 inducida por IL10-(supresor de la señalización de citoquinas 3) en el nivel de mRNA se midieron por RT-qPCR. Las diferencias entre los medios de cultivo se producen en lo que respecta a la medida de la inducción de la expresión del ARNm de SOCS3 (Figura 4), ​​las inducciones para cada uno de los medios de comunicación a prueba de ratón de células T Nucleofector mediana, LGM3, X-VIVO 20 y IMDM eran 19,5 [17,7-21,5 ], 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] y 7.2 [5.6 a 9.5] veces, respectivamente. Elaplicación refore del medio Nucleofector ratón de células T es vital. Además, las diferencias en el efecto de la caída de IL10RB sobre la expresión de SOCS3 después del tratamiento IL10 eran observables, los niveles de expresión de ARNm SOCS3 se redujeron a 9.5 [8.8 a 10.3] veces en medio de la célula T de ratón Nucleofector, 2.1 [1.1 a 4.1] pliegan en LGM3, 4.8 [3.2 a 7.2] veces en X-VIVO 20 y 3.3 [2.7 a 3.9] veces en IMDM. Estos valores corresponden a la reducción de la expresión SOCS3 en los diferentes medios de comunicación a 49%, 18%, 60% y 45%, respectivamente. Reducción de la expresión inducida por IL-SOCS3 10-después de la transfección de ARNsi IL10RB confirma la regulación a la baja con éxito de IL10RB por la transfección.

Figura 1. Caracterización de transfectadas THP-1 macrófagos. El estado característico de las células no se ve afectada como se revela por microscopía óptica y análisis de citometría de flujo de co no transfectadascélulas de contro l frente a macrófagos THP-1 transfectadas según el protocolo presentado. THP-1 macrófagos se diferenciaron con 10 ng / ml de PMA durante 48 horas y se transfectaron con la etiqueta fluorescente (Alexa 488) de control no específica siRNA. 24 h después de la transfección ya sea imágenes de células vivas se tomaron (B), o las células fueron separadas por Accutase tratamiento I y se analizaron por citometría de flujo (A). La apoptosis y la necrosis tinción se realizó usando Anexina V-ficoeritrina (PE) (C) y 7-aminoactinomicina (7-AAD) (D). La eficiencia de transfección (E) se determinó por citometría de flujo utilizando la etiqueta de fluorescencia unida a la siRNA. La señal de fluorescencia de las células transfectadas (negro) se muestra en contra de la señal de control (gris). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de la distribución intracelular de siRNA después Nucleofection frente lipofección. THP-1 células se diferenciaron durante 48 horas de acuerdo con este protocolo y luego transfectadas ya sea por Nucleofection o mediante lipofección. Los resultados de lipofección presentados se obtuvieron usando el kit de Xtremegene siRNA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con una relación de carga de reactivo para ARNsi de 4: 1. 24 h después de la transfección las células fueron separadas ya sea con Accutase I para el análisis de citometría de flujo o evaluó microscópicamente con células vivas. (A) La eficacia de transfección y distribución de siRNA por celda dentro de la población fue determinada por citometría de flujo utilizando la etiqueta fluorescente unido al siRNA, controles transfectadas sin siRNA se muestran en gris, muestras transfectadas con siRNA se muestran en negro. (B) Microscopía de fluorescenciaimágenes que muestran la distribución intracelular de la etiqueta fluorescente siRNA (Alexa Fluor 488); la barra de escala representa 40 micras. Diferencial imagen de contraste de interferencia correspondiente a la imagen de fluorescencia (C); la barra de escala representa 40 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Desmontables de IL10RB Figura 3. ARNsi mediada transfectadas en células THP-1 macrófagos. Macrófagos THP-1 se transfectaron de acuerdo con el protocolo descrito. Después de la transfección las células fueron cultivadas en cuatro medios de cultura diferente, a saber Ratón T Cell medio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C), y X-VIVO 20 (D), suplementados como se describe en la sección Protocolo. Cells fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico (Ctrl) o IL10RB-siRNA (IL10RB). Como controles adicionales se incluyeron las siguientes muestras: Regulador de impulsos, es decir. células que se sometieron a transfección en ausencia de siRNA (pulso), y un medio de control, es decir. las células que recibieron sólo los cambios de medios de cultivo, pero se quedaron sin tratar de otra manera. 24 h después de la transfección, las células se incubaron en medio libre de suero con o sin 50 ng / ml para más IL10 24 hr. Expresión IL10RB se midió por RT-qPCR; diagramas muestran la media de tres experimentos independientes, las barras de error representan el error estándar de la media; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 frente Ctrl. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4.-IL10 dependiente de regulación de SOCS3 después desmontables de IL10RB transfectadas en células THP-1 macrófagos. Macrófagos THP-1 se transfectaron de acuerdo con el protocolo descrito. Después de la transfección las células fueron cultivadas en cuatro diferentes medios de cultivo de células T de ratón medio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C) y X-VIVO 20 (D) suplementado como se describe en la sección de Protocolo. Las células fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico (Ctrl) o IL10RB-siRNA (IL10RB). Como controles adicionales se incluyeron las siguientes muestras: Regulador de impulsos, es decir, las células que se sometieron a transfección en ausencia de siNRA (Pulso), y un medio de control, es decir. las células que recibieron sólo los cambios de medios de cultivo, pero se quedaron sin tratar de otra manera. 24 h después de la transfección, las células se incubaron en medio libre de suero con o sin 50 ng / ml para más IL10 24 hr. SOCS3 expresión se midió por RT-qPCR; diagramas muestran la media de tres experimentos independientes, las barras de error representan el error estándar de la media; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; ***, ### P <0,001 frente Ctrl y vs. Ctrl + IL-10, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo descrito aquí presenta una forma fiable y eficiente para transfectar células THP-1 macrófagos que son generalmente bastante difícil para transfectar. La transfección se puede lograr con eficacias de transfección de por encima de 90% para siRNA sin una reducción significativa de la vitalidad celular. Eficiencias de plásmidos pueden ser menos debido a su tamaño, pero de transfección eficiencias de alrededor del 70% se puede lograr generalmente. La eficiencia de la caída siRNA mediada puede alcanzar de 80 a 90% dependiendo de la siRNA aplicada. Una gran ventaja de este protocolo es que no interfiere con la diferenciación celular. Después de la transfección, las células todavía responden normalmente al agente de diferenciación PMA (Figura 1A a 1B y la Figura 4) ^12. Además polarización celular por estímulos tales como citoquinas IL10 o LPS / IFN no se ve afectada ^12, aunque esto también depende fuertemente del medio seleccionado para el cultivo después de la transfección de uns se muestra en la Figura 4.

Hay varias opciones dentro del procedimiento que puede ser modificado con el fin de adaptar el protocolo para los requisitos específicos. Como se muestra en la Figura 4 que las células reaccionan de manera diferente al mismo estímulo IL10 dependiendo del medio de cultivo seleccionado después de la transfección. Esto indica que la composición del medio tiene una fuerte influencia en el comportamiento celular. Como el efecto impuesto por el medio podría diferir para diversos estímulos experimentales, es posible que el medio óptimo podría cambiar y, por tanto, hay una necesidad de verificar la idoneidad del medio para diferentes experimentos de forma independiente. Sin embargo, el medio RPMI-1640, que es el medio predeterminado que se utiliza para el cultivo de las células THP-1, ha demostrado ser poco adecuados para el cultivo después de la transfección como se observó una pérdida significativa en la vitalidad celular. Además, el protocolo también se puede aplicar a monocitos THP-1 sin la diferenciación inducida por PMA antes de esto,obviamente, elimina la necesidad de que el desprendimiento de células durante el procedimiento, pero todos los pasos restantes no tienen que ser ajustado. Los monocitos THP-1 se pueden diferenciar después si es necesario.

Los elementos más importantes del mismo son en primer lugar el desprendimiento y en segundo lugar el tiempo necesario para la transfección. La separación debe realizarse lo más suavemente posible, con el fin de mantener la viabilidad celular alta. Por lo tanto recomendamos el destacamento enzimática comparativamente leve por Accutase I sobre métodos muy agresivos como tripsinización. Se han encontrado, además, métodos de desprendimiento, tales como el tratamiento con lidocaína o raspar a ser bastante perjudicial y no deben utilizarse. En el caso de que 30 minutos de tratamiento Accutase no debería ser suficiente para separar todas las células adecuadamente esta suele ser una indicación de solución incorrectamente almacenados o expirado Accutase I o de demasiados ciclos de congelación-descongelación. Hemos obtenido buenos resultados mediante el almacenamiento de pequeñas alícuotas de Accutase I a -20 °C para reducir el número de ciclos de congelación-descongelación. Sin embargo cuando hay desprendimiento insuficiente reemplazar Accutase I con Accutase fresco o aumentar el tiempo de incubación de hasta 1 hr. Además golpecitos suaves o enjuague del matraz o placa puede ayudar a la separación. En cuanto el tiempo requerido para la transfección el tiempo de exposición de las células a la solución de Nucleofector pura tiene alto impacto en la supervivencia celular y por lo tanto debe ser tan corto como sea posible. La mejor manera de lograrlo es realizar cada transfección a la vez (pasos 2.10-2.15) y no varios transfecciones en paralelo.

Si la eficiencia desmontables es baja, esto normalmente no es causada por la baja eficiencia de transfección, pero esto puede ser verificado fácilmente usando citometría de flujo o microscopía de fluorescencia y la etiqueta fluorescente siRNA o un plásmido que codifica GFP. Sobre todo la causa es un ADN plásmido siRNA o ineficiente. Bajo estas circunstancias se debe considerar para aumentar la cantidad de siRNA (hasta 2-3 mg) oplásmido de ADN (de hasta 1-2 mg) o utilizar un vector de expresión de siRNA o diferente si está disponible. Alternativamente, los resultados satisfactorios también podrían lograrse mediante el uso de un grupo de varias diferentes siRNAs dirigidos contra el mismo objetivo. Además, experimentos de tiempo podrían ser necesarias para determinar con precisión el período de efecto máximo, que normalmente se alcanza después de 24 a 72 h después de la transfección.

Aparte de la transfección por electroporación hay más técnicas bien establecidas para la transfección de células de mamífero. Frecuentemente los sistemas aplicados son agentes de transfección químicos que pueden formar complejos con el ácido nucleico de carga y luego facilitar el transporte en las células. Los reactivos más comúnmente usados ​​están basados ​​en diferentes especies de lípidos o se pueden elegir entre una serie de polímeros catiónicos ^3. Para ambos enfoques una selección diversa está disponible comercialmente. Estos reactivos de transfección ofrecen la ventaja de que son generalmentefácil de usar, no requieren mucho tiempo, y trabajar con células adherentes, así, eliminando así la necesidad de desapego. Desafortunadamente, los macrófagos son más bien difíciles de transfectar mediante estos métodos, ya que no proliferan significativamente in vitro y poseen mecanismos de defensa dirigidos contra el ADN citosólica extranjera ^13-15. Por lo tanto, los enfoques de transfección química con frecuencia dan como resultado una grave reducción de la viabilidad celular. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2 hay agentes químicos de transfección que puede transferir con éxito siRNA en macrófagos, pero como citometría de flujo (Figura 2A) y microscópica fluorescente (Figura 2B) análisis indican que no logran alcanzar la misma distribución homogénea de siRNA dentro de las células como obtenido por Nucleofection. De hecho, los datos de citometría de flujo indican que se producen dos poblaciones diferentes de células transfectadas, en primer lugar con una población de fluorescencia similar al de las células después de Nucleofectien que se detecte y en segundo lugar hay una población con mayor intensidad de fluorescencia. Confirmación definitiva todavía es necesaria, pero se supone que la primera población se encuentra en la microscopía de fluorescencia idéntica a aquellas células que muestran una distribución homogénea de siRNA fluorescente en el citosol, mientras que la segunda población que corresponde a las células con aglomerados muy brillantes. Los datos de citometría de flujo que se muestra en la Figura 2A sugieren que los resultados nucleofection en menos siRNA por célula que el enfoque lipofección alternativa. Sin embargo, los datos de la Figura 3 muestra que incluso la comparativamente pequeña cantidad de siRNA incorporado por Nucleofection ya es suficiente para 80 a 90% caída del gen diana. Por lo tanto, la cantidad adicional de siRNA incorporado por la segunda población después de la transfección química es muy probable superávit y es por lo tanto más probabilidades de causar efectos secundarios no deseados que a mayor aumento de eficiencia desmontables. Aparte de esoformación de aglomerados intracelulares ya no es deseable en sí mismo ya que esas moléculas de siRNA no es probable funcional o al menos, menos eficientes que las moléculas de siRNA libres y pueden causar efectos puntuales de destino. Por otra parte la verdadera naturaleza de estos aglomerados no es todavía clara. Es posible que estos puntos brillantes representan los endosomas que indican que el ARNsi fue internalizada por las células, pero posteriormente libera de los endosomas fallado y el siRNA permanece atrapado y por lo tanto ineficaz. Alternativamente, los puntos pueden ser aglomerados que se forman intracelularmente. Evaluaciones funcionales de la transfección química están pendientes, por lo tanto, no hay conclusiones definitivas sobre la eficiencia desmontables se pueden hacer, sin embargo, sigue siendo la existencia de dos poblaciones distintas ya no es favorable, ya que esto significa que todos los resultados describen la media de ambas poblaciones, esto, por tanto, no corresponde a cualquiera de las poblaciones. Por esa razón Nucleofection es el enfoque superior.

Sin embargo también existen limitaciones para el procedimiento de transfección descrito aquí. Dado que las células tienen que estar en suspensión para células adherentes nucleofection necesitan ser individual, que presenta un factor de tensión adicional a las células. Además todo el protocolo se consume bastante tiempo. Dado que las transfecciones no se puede realizar simultáneamente, pero tiene que realizarse rápidamente a fin de evitar el daño celular, el número de muestras está limitado a cerca de 8 - 10 por experimento. Por lo tanto, este protocolo no es adecuado para los proyectos de exploración de alto rendimiento. Para aplicaciones de alto rendimiento diferentes sistemas nucleofector están disponibles. En primer lugar, es el sistema 4D-Nucleofector que ofrece un formato de tira 16 también. Para aún mayor rendimiento, hay el sistema de traslado de 96 pocillos y 384 pocillos el sistema HT Nucleofector. Sin embargo, como estos nuevos sistemas trabajan con electrodos conductivos polímeros en lugar de aluminio y por lo tanto las condiciones eléctricas, es decir, programas y composition de la solución de Nucleofector, han cambiado en consecuencia, necesita ser determinado si nuestro protocolo se puede transferir a esos sistemas.

Sin embargo, a pesar de estas limitaciones, el protocolo que aquí se presenta no producir una transfección fiable y eficaz de células THP-1, que es superior a todos los otros métodos no virales. Este protocolo permite la investigación de los efectos de la alteración de la expresión génica en células THP-1 que en todos los demás aspectos se diferencian y polarizar normalmente y por lo tanto muestran como pequeños efectos secundarios de transfección posible.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Aminoácidos no esenciales	PAA	M11-003
Tubos de centrífuga (15 ml)	TPP	TPP91015
Suero fetal de ternero (FCS gold)	PAA	A15-151
Kit de nucleofactor de monocitos humanos	Lonza	VPA-1007	Contiene solución de nucleofector, cubetas y Pasteur pipetas
Suero humano fuera del coágulo	Lonza	C11-020
Medio de Dulbecco modificado de Isove (IMDM) con 25 mM HEPES y 25 mM de L-glutamina	Lonza	12-722F
Medio de crecimiento de linfocitos 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Medio nucleofector de células T de ratón	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicilina / estreptomicina / L-glutamina (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medio (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plásmido
Piruvato de sodio (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 monocitos de leucemia humana	CLS 300356
Matraces de cultivo de tejidos (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Placas de cultivo de tejidos (6 pocillos; 12 pocillos)	Tubos TPP	TPP92406/TPP92012
(1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Agua (sin nucleasas) o tampón
X-Vivo 20 con gentamicina	Lonza	BE04-448Q
β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148