De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

Carmine Di Rienzo; Enrico Gratton; Fabio Beltram; Francesco Cardarelli

doi:10.3791/51994

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Artículo de método

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

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DOI:

10.3791/51994

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9 de octubre de 2014

Carmine Di Rienzo¹^,² , Enrico Gratton³ , Fabio Beltram¹ , Francesco Cardarelli²

¹NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, ²Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, ³Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

Resumen

Es cada vez más evidente que la distribución espacial y el movimiento de los componentes de la membrana, como lípidos y proteínas son factores clave en la regulación de muchas funciones celulares. Sin embargo, debido a la dinámica rápida y las diminutas estructuras involucradas, se requiere una resolución espacio-temporal muy alta para capturar el comportamiento real de las moléculas. Aquí presentamos el protocolo experimental para el estudio de la dinámica de las proteínas y los lípidos del plasma membrana fluorescencia marcado en células vivas con alta resolución espacial y temporal. En particular, este enfoque no es necesario realizar un seguimiento de cada molécula, pero calcula comportamiento de la población utilizando todas las moléculas en una región dada de la membrana. El punto de partida es una imagen rápida de una determinada región de la membrana. Después, una función de autocorrelación espacio-temporal completa se calcula la correlación de imágenes adquiridas a aumentar los retardos de tiempo, por ejemplo cada 2, 3, n repeticiones. Es posible demostrar que el anchodel pico de los incrementos espaciales función de autocorrelación en el aumento de retardo de tiempo como una función del movimiento de las partículas debido a la difusión. Por lo tanto, encajando de la serie de funciones de autocorrelación permite extraer la proteína real significa desplazamiento cuadrático de formación de imágenes (IMSD), que aquí se presenta en forma de difusividad aparente vs desplazamiento medio. Esto produce una vista cuantitativo de la dinámica promedio de moléculas individuales con una precisión nanométrica. Mediante el uso de una variante de GFP-etiquetados del receptor de transferrina (TfR) y un ATTO488 el nombre 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 fosfoetanolamina (PPE) es posible observar la regulación espaciotemporal de la difusión de proteínas y lípidos en regiones de membrana-micras de tamaño en el rango de tiempo-micro-para mili-segundos.

Introducción

A partir del modelo original "mosaico fluido" de Singer y Nicolson, la imagen de la membrana plasmática celular se ha actualizado continuamente durante las últimas décadas con el fin de incluir el papel emergente de citoesqueleto y lípidos dominios ^1,2.

Las primeras observaciones fueron obtenidos por la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) descubrimiento de que una fracción significativa de proteínas de la membrana es inmóvil ^3-5. Estos estudios pioneros, aunque muy informativo, sufrieron de la relativamente pobre resolución en el espacio (micras) y el tiempo (segundos) de las configuracione....