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Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

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DOI:

10.3791/52002

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2 de noviembre de 2015

 ,  , 
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Resumen

Los cultivos de fotorreceptores enriquecido cono derivados de las retinas de embriones de pollo se han convertido en una herramienta indispensable para los investigadores de todo el mundo que estudian la biología de las neuronas de la retina, en particular los fotorreceptores. Las aplicaciones de este sistema van más allá de la investigación básica, ya que se pueden adaptar fácilmente a las tecnologías de alto rendimiento para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, la manipulación genética de fotorreceptores de la retina en estos cultivos ha demostrado ser muy difícil, que presenta una importante limitación a la utilidad del sistema. Recientemente hemos desarrollado y validado un ex ovo técnica de electroporación plásmido que aumenta la tasa de transfección de células de la retina en estos cultivos por cinco veces en comparación con otros protocolos disponibles en la actualidad 1. En este método los ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27, se retira el RPE, y la copa de la retina se coloca en una solución que contiene el plásmido y se electroporó usando Custom- de fácil construcciónelectrodos hechos. Las retinas son entonces disocian y se cultivan utilizando procedimientos estándar. Esta técnica se puede aplicar a los estudios de sobreexpresión, así como a la regulación a la baja de la expresión génica, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi plásmido impulsado, comúnmente la consecución de la expresión del transgén en 25% de la población de los fotorreceptores. El formato de vídeo de la presente publicación hará que esta tecnología de fácil acceso para los investigadores en el campo, lo que permite el estudio de la función de genes en cultivos de retina primarios. También hemos incluido una explicación detallada de los pasos críticos de este procedimiento para un resultado exitoso y reproducibilidad.

Introducción

Cultivos de células disociadas de retinas de embriones de pollo se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de las células fotorreceptoras, incluyendo su supervivencia 2-9 diferenciación 10-12, el crecimiento de neuritas 13, y más. Las ventajas de este sistema, desarrollado en la década de 1980 por Rubén Adler y colaboradores y perfeccionadas por él y para otros grupos de 14-20, residen en las características intrínsecas de la chica como un modelo animal 21. El gran tamaño del ojo polluelo, incluso en las etapas embrionarias, proporciona grandes cantidades de material para cultivos. Por otra parte, cuando los cultivos se realizan con el día embrionario (ED) 5 - 6 retinas, el 55 - 80% de sus células progenitoras diferenciar como fotorreceptores 14,15,18,22,23, y desde aproximadamente el 86% de los fotorreceptores en este animal son conos 24, estas culturas son especialmente adecuados para estudios centrados en este tipo de células.

Recientemente hemos desaped y caracterizado una técnica sencilla que permite una alta eficiencia plásmido transfección de las células en estos cultivos, ampliando así la utilidad de este sistema, facilitando estudios missexpression genética 1. El desarrollo de esta técnica se deriva de un vacío en la literatura científica de métodos que proporcionen un nivel aceptable de la transfección para permitir el estudio de la función génica en una célula de manera autónoma. Esto es en parte debido a cultivos neuronales primarios son notoriamente difíciles de transfectar 25,26. Algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas previamente disponibles para este propósito incluyen métodos de transfección químicos tales como lipofección o calcio transfección mediada por fosfato, que se traducen en una mayor eficacia en el orden de 3-5% y puede ejercer una toxicidad considerable, 27-32. A pesar de que el uso de plásmidos con un sistema reportero enzimática puede eludir el problema de la pobre eficiencia de la transfección mediante la amplificación de la señal, no lo hacendiscriminar los efectos específicos de la célula, y sus resultados se basan en una población de células pequeñas que pueden no ser representativos del conjunto. Otro método ampliamente utilizado en el pollo, infección por el virus RCAS, sólo es aplicable a las células en proliferación y por lo tanto no es adecuado para este sistema de cultivo primario de la retina 33.

En el protocolo actual ojos de embriones de pollo se enucleados en la etapa 27 (ED 5), se retira el epitelio pigmentado de la retina (RPE), y la copa de la retina se coloca en una cámara de electroporación llena con una solución que contiene el plásmido y electroporación utilizando a medida electrodos, seguido por la disociación de la retina y de cultivo utilizando técnicas estándar 21. Después de la optimización de este procedimiento hemos sido capaces de alcanzar consistentemente las eficacias de transfección en el orden del 22% del número total de células en cultivo y 25% dentro de la población de los fotorreceptores solo, sin comprometer las características de supervivencia y diferenciación de lasculturas 1. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describa todos los pasos importantes de este procedimiento a fin de garantizar el éxito y la reproducibilidad de esta técnica.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este trabajo se realizaron de acuerdo a las pautas recomendadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad Johns Hopkins.

1. Antes de Tiempo: Preparación de Instrumentos, reactivos y Platos

  1. Preparación de los huevos: Incubar huevos de gallina fertilizados White Leghorn a 37,5 ° C y una humedad relativa del 60% durante 5 días en una incubadora de huevos.
    NOTA: Una incubadora con balanceo de la capacidad puede ser útil para la normalización y la sincronización de desarrollo embrionario, pero oscilante no es estrictamente necesario para el resultado de este protocolo.
  2. Preparación de plásmido:
    1. Diseño plásmido constructo para la sobreexpresión de genes o regulación a la baja (por ejemplo, mediante el uso de la tecnología del RNAi 1,34) según sea necesario. Incluya un gen indicador (por ejemplo, EGFP, RFP o LacZ) en la construcción siempre que sea posible.
      NOTA: Algunos promotores de uso común, tales como el CMV, pueden llegar a ser silenciada en el tiempo. El promot CAGer (pollo beta-actina promotor con promotor de CMV) es una muy buena alternativa, proporcionando eficiente expresión a largo plazo del gen de interés 35-37.
    2. Preparar una solución de plásmido a una concentración de 1,5 g / l en PBS estéril. OPCIONAL: Preparar la solución plásmido antes de tiempo y almacenarlo congelado hasta que esté listo para su uso.
      NOTA: Superior concentraciones de plásmido no dan lugar a un aumento significativo en la eficiencia, mientras que el uso de concentraciones más bajas de plásmidos disminuyen la eficiencia de transfección 1.
  3. Electrodos:
    1. Para el uso de ánodos de oro gruesa punta del electrodo (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo). Limpie con etanol al 70%.
      NOTA: Aislamiento del oro punta de electrodo, dejando aproximadamente 0,5 mm expuestos, es aconsejable minimizar la fuga de la corriente eléctrica. Información para material aislante se puede encontrar en la Tabla de materiales específicos.
    2. Hacer un cátodo de un cuadrado de 2,5 mm bfilamento de buey, de 4,5 mm de ancho (normalmente utilizado en extractores micropipeta). Con la ayuda de unas pinzas, deshacer la caja cuadrada y enderezar filamento en una tira larga. Luego, bajo microscopio de disección y usando una regla como guía, doblar el filamento en una forma cuadrada 'U' 3 mm de largo en la base y 2 mm de alto en un lado, con el otro lado de la longitud restante del filamento (Figura 1 , C - D). Con unas pinzas, sumerja el electrodo en etanol al 96% y la llama para esterilizar. A continuación, conecte un cable eléctrico con una pequeña pinza de conexión para el brazo del electrodo más largo.
  4. Cámara electroporación de configuración:
    1. Preparar la cámara de electroporación mediante la reducción de la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y la colocación de ella, lado plano hacia abajo, a una placa de Petri de 100 mm usando cinta (Figura 1E).
      NOTA: Otros recipiente en forma de un pozo de tamaño similar funcionaría; sin embargo, un tubo de microcentrífuga de tapa es fácilmente accesible y autoclavable. El biendebe ser lo suficientemente para alojar un electrodo de ojo de pollo y el cátodo grande, pero no tan grande como para resultar en una pérdida de solución de plásmido.

2. Ex Procedimiento electroporación in ovo

  1. Preparación de los instrumentos:
    1. Esterilizar las herramientas de micro-disección (2 pares de grandes pinzas Moloney curvos para la apertura de las cáscaras de huevo y sacando embriones, 2 pares de punta fina curvas pinzas Dumont para la eliminación de RPE, un par de Bonn dentado pinzas para quitar la lente y vítreo) por inmersión de la consejos en etanol al 96% y en llamas. Alcance la disección Limpie con trapos mojados en etanol al 70%. Calentar una botella de solución salina equilibrada estéril calcio-magnesio-libre de Hank (CMF-HBSS) en un baño de agua a 37 ° C. Rellene 100 mm placas de Petri estériles a 3/4 de su capacidad con una cálida CMF-HBSS.
    2. Coloque la cámara de electroporación bajo otro microscopio de disección limpia y llena con 120 l de solución de plásmido. Conectar los electrodos al aparato de electroporación, haciendoSeguro electrodo de medida está conectado al polo negativo y el oro con punta de electrodo al polo positivo.
  2. Embrión Colección:
    1. Limpie los huevos limpiando conchas con toallitas húmedas en etanol al 70%. Mantener procedimiento estéril durante todo el resto del protocolo para evitar llevar la contaminación en los cultivos. El uso de grandes pinzas Moloney curvas abrir cuidadosamente un agujero en la cáscara del huevo golpeando suavemente en la punta redondeada de un huevo (más de la cámara de aire) y luego agarre y sacando trozos de concha.
    2. Con otro par de pinzas quitar las membranas y recoger embriones por sacar con pala fuera del huevo (con cuidado de no dañar el embrión). Colóquelo en un plato con CMF-HBSS.
      NOTA: Recoger la mayor cantidad embriones como sea necesario para obtener el número deseado de vasos de la retina para la electroporación como se especifica en 2.4.4
    3. PASO CRÍTICO: Etapa de los embriones de acuerdo a Hamburger y Hamilton 38.
      NOTA: Para obtener embriones óptimos de eficienciadebe ser en la etapa 27 (Figura 2A).
    4. La eutanasia a los embriones por decapitación utilizando fórceps Moloney.
  3. La obtención de Copas de la retina:
    1. Usando pinzas Dumont finas, enuclear cuidado de los ojos y la transferencia a un nuevo plato CMF-HBSS.
    2. A partir de la parte posterior de cada ojo, cerca de la cabeza del nervio óptico y utilizando dos pinzas Dumont finas, introducir un consejo de cada par de pinzas entre la retina neural y RPE y cuidadosamente diseccionar el EPR ser cauteloso para no dañar el neuronal retina (Figura 2B).
      NOTA: La falta de Ca 2+ y Mg 2+ en la solución ayudará a la RPE desprenda de la retina neural más fácilmente.
  4. Electroporación:
    1. Establecer parámetros de electroporador para entregar 5 pulsos cuadrados de 15 voltios, 50 mseg de duración y 950 intervalo de milisegundos. Place 'U' en forma de electrodo negativo dentro de la cámara de electroporación (microcentrífuga tapa de llenadoed con 120 l de solución que contiene el plásmido).
    2. Usando pinzas Dumont curvas transferir una taza de la retina a la cámara de electroporación (por sacar con pala, no presionar), y lo colocan en el interior del electrodo en forma de 'U', con la parte posterior de la retina hacia la parte inferior del electrodo y la lente hacia arriba ( Figura 2D).
    3. Coloque el ánodo de modo que toque la parte anterior del ojo, al lado de la lente, y el uso de pedal de pie del electroporador entregar los pulsos eléctricos.
    4. Transferencia de la taza de la retina a electroporación a una nueva placa de Petri con CMF-HBSS y repita el procedimiento de electroporación con cada uno de los vasos de la retina restantes.
      NOTA: Hasta 6 tazas de la retina puede ser a electroporación con la misma solución plásmido sin una disminución significativa en la eficiencia de la transfección.
    5. Retire el objetivo y el cuerpo vítreo de cada vaso de la retina a electroporación sujetando con pinzas dentadas de Bonn y tirando suavemente a través de tque por alumno apertura mientras mantiene el ojo en su lugar con el dorso de las pinzas Dumont curvas.
    6. Proceder a la disociación y la cultura de las células de la retina electroporación siguientes procedimientos estándar.
      NOTA: Para un protocolo detallado en la disociación y la cultura de células de la retina de pollo se refieren a Vergara y Canto-Soler, 2012, la disposición 4 21 En este protocolo, las células se sembraron a baja densidad en placas de 6 pocillos polyornithine recubiertos o 35. platos -mm (6 x 10 5 células / 35 mm de diámetro, así o plato). El medio utilizado es medio 199 con penicilina / glutamina, 10% de suero de ternera fetal (FCS), y ácido linoleico-BSA a 100 mg / ml. Los cultivos se mantienen en un humidificado 37 ° C incubadora con 5% de CO 2. Usando este procedimiento, 5 - 6 x 10 6 células típicamente se pueden obtener por cada etapa 27 del ojo a electroporación.
      NOTA: Idealmente, no más de 3 horas debe pasar entre recogida de embriones y de las planchas de células, para garantizar una buena supervivencia celulary minimizar el estrés. Un tiempo típico para la observación y el análisis adicional es después de 4 días de cultivo, ya que en este punto que las células han logrado una buena diferenciación morfológica y molecular y la supervivencia sigue siendo alta.

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Resultados

Aquí presentamos un protocolo sencillo para el plásmido transfección en vasos de la retina de pollo enucleados para el cultivo celular disociada subsiguiente. La transfección se consigue mediante electroporación utilizando fácil de hacer electrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Los parámetros descritos en este protocolo se han optimizado para obtener eficiencias de transfección que oscilan entre el 20 y el 27% (con un promedio de 22%) (Figura 3D). Tenga en cuenta que,...

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Discusión

El paso más crítico para el éxito de este protocolo es la selección de la etapa apropiada de los embriones. En publicaciones anteriores, se da una serie de etapas embrionarias de estas culturas, por lo general definido por los días del día de incubación o embrionarias (ED); por lo que se suele suponer que el uso de ED 5 de ED 6 embriones producirá resultados equivalentes. Sin embargo, hemos encontrado que en el escenario 27 (ED 5), la eficiencia de transfección será de alrededor de 22% de la población total de células, ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a David O'Brien por su apoyo con el análisis de datos, y a todos los miembros del laboratorio de Canto-Soler por sus discusiones críticas. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH EY004859 y EY022631 (MVCS), la Subvención Básica EY1765 y una subvención departamental sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ECM 830 Electro Cuadrado PoratorBTX/ Aparato Harvard45-0052
Genetrodo, en forma de L, 5 mm Punta de oroBTX/ Aparato Harvard45-0115 modelo 512Electrodo con punta de oro utilizado como ánodo
Tubo de poliimidaVention Medicalhecho a medidaDiámetro interno: 0,5 mm / espesor de pared: 0,15 - 0,2 mm. Se utiliza para aislar electrodos con punta de oro
Filamento de caja cuadrada de 2,5 mm, 4,5 mm de anchoSutter Instrument CompanyFB245BSe utiliza para fabricar electrodos de cátodo
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenolGibco - Life Technologies14175-095
Pinzas MoloneyRobozRS-8254Dentadas; Ligera curva; Pinzas Dumont de 4,5" de longitud
5/45RobozRS-5058Patrón #5, ángulo de 45 grados; Tamaño de la punta de .10 x .06 mm; 109 mm de longitud
pinzas Bonn, 1x2 dientesRobozRS-5172; 1x2 dientes, 0,12 mm de dientes; 3,75" de longitud; 0,3 mm de ancho de la punta
Micro Plataforma de atado

Referencias

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