El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Resumen

Utilizando un biorreactor neumático, demostramos el montaje, el funcionamiento y el rendimiento de este sistema de biorreactor de un solo uso para el crecimiento de células de mamíferos.

Resumen

Los avances recientes en el cultivo y la ampliación de células madre y mamíferos han creado enormes oportunidades para nuevas innovaciones terapéuticas y de medicina personalizada. Sin embargo, traducir estos avances en aplicaciones terapéuticas requerirá sistemas in vitro que permitan sistemas de biorreactores robustos, flexibles y rentables. Hay varios sistemas de biorreactores que se utilizan actualmente en entornos comerciales y de investigación; Sin embargo, muchos de estos sistemas no son óptimos para establecer, expandir y monitorear el crecimiento de diferentes tipos de células. Los parámetros de cultivo más difíciles de controlar en estos sistemas incluyen minimizar el cizallamiento hidrodinámico, prevenir la formación de gradientes de nutrientes, establecer una aireación uniforme del medio de cultivo, prevenir la contaminación microbiana y monitorear y ajustar las condiciones de cultivo en tiempo real. Utilizando un sistema de biorreactor neumático de un solo uso, demostramos el montaje y el funcionamiento de este novedoso biorreactor para células de mamíferos cultivadas en microportadores. Este sistema de biorreactor elimina muchos de los desafíos asociados con los sistemas disponibles actualmente al minimizar el cizallamiento hidrodinámico y la formación de gradientes de nutrientes, y permitir una aireación uniforme del medio de cultivo. Además, el software del biorreactor permite el monitoreo remoto en tiempo real y el ajuste de los parámetros de funcionamiento del biorreactor. Este sistema de biorreactor también tiene un enorme potencial para el escalado de células de mamífero adherentes y en suspensión para la producción de una variedad de proteínas terapéuticas, anticuerpos monoclonales, células madre, biosimilares y vacunas.

Introducción

Líneas de células de mamíferos se pueden clasificar en una de tres categorías basadas en sus características de crecimiento: células que crecen en suspensión, las células que crecen en forma de agregados, y las células que crecen anclado a un sustrato. Aunque el biorreactor de aire de la rueda demostrado en este video es capaz de crecer los tres tipos de células, este video demostrará el uso del biorreactor para cultivar células dependientes de anclaje en micro-soportes. Células de mamíferos dependientes de anclaje pueden ser cultivadas con el propósito de producir más células - donde las propias células son el producto. Por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana están siendo cultivadas con el propósito de recoger las células e inyectarlas en el tejido enfermo. El biorreactor neumático demostrado en este vídeo ha demostrado ser adecuado para la producción de dichas células madre mesenquimales para esta aplicación (Serra et al., Comunicación personal, 2013).

Anchorage depcélulas de mamífero se cultivan típicamente endent pequeña escala en recipientes de cultivo 2D tales como placas de cultivo celular, frascos de cultivo de células, o botellas de rodillos, donde se adhieren a una superficie de crecimiento especialmente tratado ^1. Cuando se desean más células, las placas o frascos se pueden ampliar mediante el uso de más o grandes vasos. Sin embargo, para un cultivo más rentable de grandes cantidades de células dependientes de anclaje, aumentando el área superficial para la fijación celular que se puede lograr mediante el uso de pequeñas perlas sólidas llamados micro-soportes. Dependiendo de las características de fijación de la célula, diferentes tipos de micro-soportes están disponibles comercialmente, tal como dextrano, un péptido, o colágeno recubierto. Micro-soportes tienen una gran área superficial a volumen que proporciona una mayor superficie para el crecimiento celular; y los micro-soportes se pueden mantener en suspensión con agitación, lo que permite que las células se cultivan a altas densidades en sistemas de biorreactores ^2. Actualmente, los tipos de bioreactors donde las células adherentes se cultivan en micro-vehículos incluyen matraces rotativos y sistemas de tanque agitado, que utilizan hélices axiales para mantener la suspensión de las células recubierto micro-soportes.

Varios factores son importantes para el cultivo con éxito de células, incluyendo la tensión de oxígeno, la tensión de cizallamiento, la matriz de superficie, y de nutrientes y las concentraciones de metabolitos. El uso de biorreactores permite la monitorización en tiempo real de las condiciones de crecimiento y el potencial de significativamente más bajos costos de producción ^1. Hay varios diseños de biorreactores común para el cultivo in vitro de células incluyendo, suspensión agitada, recipiente de pared giratorio, de fibra hueca, la bolsa de biorreactor en una plataforma de balancín, y sistemas de lecho fluidizado ^3. Muchos de estos sistemas presentan problemas únicos para el cultivo de células y la escala -up, tales como el alto costo, los gradientes de concentración de nutrientes, cizallamiento hidrodinámico, la agregación de células, y la dificultad en el muestreo, monitoreo y control de cell de escala.

Varias líneas de células adherentes se utilizan en la producción de virus, ya sea en la producción de vacunas virales o para la producción de vectores virales para aplicaciones de terapia génica. En este video, usando el sencillo uso neumática (aire-ruedas) sistema de biorreactor, se demuestra la cultura de células de carcinoma de pulmón humano (A549) las células en micro-soportes para la producción de un adenovirus oncolítico. El diseño del biorreactor neumática utiliza una rueda de agitación vertical que es alimentado por la flotabilidad del gas burbujeado en la parte inferior del biorreactor. Este método de agitación suave limita las fuerzas de cizallamiento hidrodinámico, pero aún asegura medio y óptima de la célula de mezcla ^4. En comparación con el reactor de tanque agitado, el reactor neumático tiene una baja tensión de cizallamiento, incluso con sistemas de biorreactor de aire de la rueda de alto volumen (Figura 1). En contraste con los biorreactores de tanque agitado, el impulsor vertical de este reactor único uso está activado por una corriente de burbujas de gas dentro deel recipiente, lo que permite suave y uniforme de mezcla medio (Figura 2).

Protocolo

1. Login

1. Encienda el biorreactor. Haga clic en cualquier lugar para abrir la página de inicio de sesión. Seleccione el nombre de usuario y escriba la contraseña y haga clic en "Iniciar sesión".

2. Calibración

1. Calibrar sensor de pH (2 puntos antes de la esterilización en autoclave).
2. Inspeccione sensor de pH y confirme la punta del sensor se llena con solución electrolítica. Prepare dos vasos con soluciones de calibración pH (electrolitos) pH 4 y pH 7 y disponer de una botella de lavado con agua destilada.
3. Conectar el cable de pH para el sensor de pH. Vaya a la pestaña "Acciones" en la interfaz de Hola y haga clic en "calibrar". Ingrese temperatura del tampón en el campo de temperatura solución de calibración.
4. Coloque el sensor de pH en tampón 1 (pH 4) e introduzca el valor en el campo "cero". Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón "calibrar 1". Enjuague el sensor de pH con agua destilada.
5. Coloque el sensor en tampón 2 (pH 7). Ingrese búfer2 valor en el campo "span". Espere a que se estabilice el gráfico y haga clic en la calibración de 2 botones.
6. Haga clic en "Guardar" y luego haga clic en "Cerrar".
7. Calibrar el sensor de oxígeno disuelto (OD).
8. Asegúrese de que el sensor de oxígeno se ha polarizado al ser conectado al sistema durante varias horas. Vaya a la pestaña "Acciones" en la interfaz de Hola y haga clic en Calibrar. Haga clic en el botón "HACER A".
9. Desconecte el sensor de oxígeno y escriba 0 en el campo "cero". Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón "Calibrar 1".
10. Vuelva a conectar el sensor de oxígeno y escriba 100 en el campo "Span". Espere a que el gráfico se estabilice y el clic en el botón "Calibrar 2".
11. Haga clic en "Guardar" y luego haga clic en "cerrar".

3. Autoclave e instalación de sensores y recipientes de reactivos

1. Después de la calibración, los sensores de lugar y así térmica en autocLave y bolsas de autoclave durante 30 min a 121 ° C, 15 psi.
2. Desinfectar las bolsas de autoclave con 70% alcohol isopropílico (IPA) y bolsas de transferencia a cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje exterior del buque.
3. Desinfectar envase interior con un 70% de IPA y transferir buque cabina de seguridad biológica (BSC). Retire el embalaje interior e inspeccionar el buque y la tubería por los daños infligidos durante el envío.
4. Instale el pH y DO sensores en los dos puertos frontales. Instale el bienestar térmico en el puerto lateral izquierdo. Abra la tapa del sensor.
5. Guía del sensor a través del puerto del sensor. Pase el sensor firmemente en el puerto.
6. Transferencia recipiente de BSC.
7. Cuelgue la DO y cables de los sensores de pH fuera de la manga del vaso y compruebe que no hay nada en la manga. Deslice el recipiente dentro de la funda, los pies por delante.
8. Coloque con cuidado el sensor de temperatura en el pozo termal buque. Asegúrese de que el fondo del recipiente se apoya contra los calentadores.
9. Retirela tubería fija de sus bolsas. Partido codificación de color en el tubo a los conectores correspondientes y bombas en la unidad de control biorreactor.
10. Instale la línea de gas principal presionando el conector en su salida de gas. Instale la línea de gas micro girando el conector hacia la derecha en la salida de gas. Instale el tubo de filtro de escape:
11. Abrir la estufa filtro. Asegure el filtro de escape en el canal en U de modo que su tubo pasa por los dos ganchos al filtro y fuera del horno.
12. Instale el tubo de la bolsa de condensador en el soporte de la tubería. Cierre la puerta.
13. Ruta líneas adición de A y B, ambas líneas de comunicación, y la línea de cosecha detrás del sensor de oxígeno y en el banco junto a la unidad de control de bioreactor.
14. Conecte los cables a los sensores de oxígeno y pH.

4. Añadir medianas y micro-portadores

1. Vaya a la pestaña "acciones" y haga clic en "Control de Bombas" en la interfaz de la computadora.
2. Formar un esterilizadorLe conexión entre una línea sin usar medio de adición (1 banda naranja) y la fuente de la botella / bolsa de medio por soldadura el tubo o el uso de accesorios Luer.
3. Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en. Haga clic en el control deslizante para activar los medios de comunicación de la bomba después de adición deseada cantidad de medio.
4. Coloque microportadoras cuentas en Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} PBS libre durante 3 horas a temperatura ambiente.
5. Lavar perlas varias veces con Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} PBS libre.
6. Autoclave durante 15 min a 115 ° C, 15 psi.
   NOTA: Añadir 3 g / L (peso en seco) en este experimento.
7. Bomba en micro-soportes que han sido hidratadas, lavados y esterilizados en autoclave en el reactor de la misma manera se añadió el medio en el paso 4.1.

5. de equilibrado y de un punto de calibración HACER

1. Establecer los controladores a Automático e introducir los puntos de ajuste deseados. Aquí, utilice Agitación Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Espere a que el parámetros se equilibren.
2. Confirmar sensor es completamente polarizada. Confirmar DO valor actual se ha estabilizado.
3. Vaya a la pestaña "Acciones" y haga clic en "calibrar". Haga clic en "DO A", haga clic en "One-punto".
4. Introduzca "100" en el campo "Span". Haga clic en el botón "Calibrar 1", haga clic en "Guardar" y haga clic en "cerrar":

6. de iniciar una ejecución

1. Vaya a la pestaña Acciones. Haga clic en "lotes". Utilice el teclado en pantalla o un teclado externo para ingresar un nombre de lote de 16 caracteres o menos.
2. Haga clic en el botón "Ocultar" del teclado en pantalla. Haga clic en "Iniciar lote" confirme haciendo clic en "Inicio" en la superposición.

7. inoculan con células

1. Formar una conexión estéril entre un (banda naranja 1) línea de adición de medio sin usar y la botella de células / fuente bolsa por soldadurael tubo o el uso de los accesorios Luer.
2. Instale la sección de silicona de la tubería en la bomba de los medios de comunicación por lo que la flecha apunte hacia la tubería entre la bomba y el recipiente.
3. Compruebe pinza de la línea está abierta y su pinza de la línea ramificada está cerrado. Haga clic en el control deslizante para encender la bomba de los medios de comunicación en y haga clic en "No", después de la adición de las células.
4. Vaya a la pestaña "Acciones" y haga clic en "Bombas de control".

8. Muestreo

1. Después de inocular y tan frecuentemente como se desee para controlar la cultura, extraer una muestra de la cultura de la siguiente manera:
2. Vaya a la pestaña "acciones" y haga clic en "tomar la muestra". Coloque el tubo de muestreo en la bomba de muestreo y manipular la llave de paso de muestreo de acuerdo con las instrucciones de la pantalla.
3. Realizar al menos una observación microscópica diario y recuento de células en estas muestras.
4. Cuando las células han alcanzado la densidad deseada, en este cASE 1,2 x 10 ⁶ células / ml, infectar las células con la adición de un inóculo de virus.
5. Agregar asépticamente el inóculo a una jeringa de 20 ml, y conectar la jeringa a uno de los puertos de adición de repuesto en el reactor. Introducir el inóculo en el reactor presionando en el émbolo de la jeringa.
6. Continuar el muestreo y el análisis de la cultura de la concentración de partículas intracelulares adenovirus.

Resultados

En la Figura 3, se muestran los parámetros para el inicio de la carrera biorreactor. Esta figura muestra la pantalla antes de establecer los parámetros de temperatura, oxígeno disuelto, pH y agitación. Una vez que los parámetros se establecen, los parámetros de ejecución son monitoreados continuamente y se pueden hacer ajustes para mantener las condiciones requeridas. El software produce una lectura continua que permite una fácil identificación de problemas. En este experimento utilizando 2,5 L de DMEM que contenía 10% de FBS, 250 ppm de SAFC anti-espuma C, 2 mM L-glutamina y 3 g / L de micro-soportes, el sistema se estabiliza por lo que el porcentaje de oxígeno es 50%, el temperatura es 37 ° C, y el pH es 7,2. El reactor es inoculado con células A549 a una concentración de 7 x 10 ⁴ células / ml (o 10 células / micro-portadoras). Los parámetros elegidos para esta ejecución resultaron en la mayoría de las células que se adhieren a los micro-soportes dentro de 2 horas (Figura 4). Después de 12 h, las células son demoniossignos trating de aplanamiento y la difusión en la superficie micro-portadora (Figura 5). Por 24 horas, micro-soportes tienen una distribución relativamente uniforme de las células, sin micro-soportes sin células y no hay grandes grupos de células en los micro-soportes (Figura 6). El porcentaje de colonización micro-portador por las células A549 es de 75% en 24 horas y el 90% a partir de entonces (Figura 7). Las células continuaron creciendo exponencialmente a ~ 1 millón de células / ml después de 48 horas (Figura 8). Después de la infección con una dosis de adenovirus oncolítico (2 x 10 ⁸ viriones / ml) a 50 h, la densidad aumentó a 1.2 millones de células / ml y luego comenzó a disminuir a medida que la infección lítica progresó. Había ~ 10.000 amplificación pliegue del inóculo viral.

En experimentos anteriores, se ha encontrado que el control y regulación del caudal de gas es crítica para maximizar el crecimiento celular (datos no publicados). El rápido crecimiento de las células pueden agotar el sistema de oxígeno con el nivel de OD de caer a cero. Mientras que las células continuaron creciendo, fue a un ritmo mucho más lento. Es crítico para controlar y ajustar el flujo de oxígeno para satisfacer las demandas celular durante la fase de crecimiento logarítmico. Cada serie se puede analizar para un óptimo crecimiento comparando el pH, DO, y la temperatura con recuentos de células diarias.

Figura 1. Dinámica de Fluidos del sistema biorreactor neumático (PBS) en comparación con el tanque biorreactor Agitador medición de fuerzas de cizallamiento de pared en varios volúmenes de reactor.

Figura 2. neumática Aire rueda impulsor reactor.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Figura 3. software de ruedas Aire neumático captura de pantalla de los parámetros para iniciar la carrera biorreactor.

Figura 4. colonización Micro-portador con células A549 2 horas después de la inoculación. (Diámetro medio de micro-portador ~ 180 m.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. 12 horas después del inicio del cultivo, las células A549 están otorgando, aplanar, y la difusión en los micro-soportes.5highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Micro-portadoras recubiertas con células después de 24 horas en la cultura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Porcentaje de colonización micro-portadora por las células A549 después de la inoculación.

Figura 8. El número de células A549 viables en cultivo antes y después de la infección con adenovirnosotros. Tenga en cuenta que el paso de la infección viral se produjo a las 50 h.

Discusión

Este sistema de biorreactor de un solo uso es relativamente sencillo de usar y proporciona análisis en tiempo real para la monitorización y el análisis reactor. Está muy bien adecuado para el cultivo de células de mamíferos y de insectos con densidades celulares que llegan a más de 30 millones de células / ml. Además de las células A549 describen en este informe ^11, hemos crecido SF-9 células de insectos en el biorreactor también. La mezcla suave proporcionado por la rueda de aire neumático reduce el daño celular. Varios pasos son críticos al establecer este reactor. Primera calibración, apropiado del pH y DO sensores es importante para la vigilancia óptima de la cultura y para la adición de reactivos para ajustar el pH o el oxígeno en el sistema. En segundo lugar, los frascos de reactivos y de semillas deben ser llenados y los accesorios Luer realizan en un ambiente estéril, como un BSC. Una vez que los frascos de reactivos se mueven fuera del ambiente estéril, las conexiones a las líneas de alimentación de biorreactores deben hacerse con cuidado para evitar la contaminación microbiana.

Si bien este sistema de biorreactor funciona bien para las líneas de células de mamíferos e insectos que no está diseñado para los cultivos bacterianos. El sistema no puede proporcionar la mezcla rápida y la oxigenación que se requiere para células bacterianas. El crecimiento bacteriano se realiza mejor en un biorreactor de tanque agitado. En comparación con otros biorreactores de un solo uso para el cultivo de células de mamífero o insecto, este sistema es fácil de usar, proporciona datos suficientes para el análisis de pistas, y tiene el crecimiento celular similar o mejor que el otro sistema de un solo uso que hemos evaluado.

El uso único sistema biorreactor neumático tiene el potencial para satisfacer muchas de las investigaciones y aplicaciones clínicas en los campos de bioterapéuticos, vacunas, las células madre y la medicina personalizada ^4. Además, la flexibilidad de este sistema permite por lotes, Fed-batch, la perfusión, y las aplicaciones de biorreactores de transfección basado ^5. Por último, de un solo uso sistemas de biorreactores desechables tienen el potenciales para satisfacer las necesidades de la producción industrial a gran escala y para cumplir con las directrices y recomendaciones de los organismos reguladores nacionales e internacionales ^10.6.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PBS 3	de
Células de carcinoma de pulmón humano PBS
DMEM Medio de alta glucosa
Suero
Tripsina EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microportadores	GE	3781
Antiespumante C	Sigma	A8011

Ensamblaje un solo uso PBS (A549)ATCC CCL-185 fetal bovino