Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Summary

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Abstract

Este manuscrito ilustra un protocolo para la creación de células de manera eficiente a la integración libre inducidos por el hombre madre pluripotentes (iPSCs) a partir de sangre periférica utilizando plásmidos episomales e inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC). Las ventajas de este enfoque incluyen: (1) el uso de una cantidad mínima de sangre periférica como un material de origen; (2) nonintegrating vectores de reprogramación; (3) un método rentable para la generación de vectores iPSCs libres; (4) una sola transfección; y (5) el uso de pequeñas moléculas para facilitar la reprogramación epigenética. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de muestras de flebotomía de rutina y después se cultivaron en factores de crecimiento definidas para producir una población de células progenitoras de eritrocitos altamente proliferativa que es notablemente susceptibles de reprogramación. Nonintegrating, plásmidos episomales no transmisibles que expresan Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, y un corto horquilla (sh) ARN p53 son introduced en los eritroblastos derivados través de un único nucleofection. La cotransfección de un episoma que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) permite una fácil identificación de las células transfectadas. Un plásmido de replicación deficiente separada expresar Epstein-Barr antígeno nuclear 1 (EBNA1) también se añade a la mezcla de reacción para aumentar la expresión de proteínas episomales. Las células transfectadas se sembraron sobre una capa de fibroblastos de embriones de ratón irradiados (iMEFs) para continuar la reprogramación. Tan pronto como colonias IPSC-como aparecen en aproximadamente doce días después de nucleofection, se añaden inhibidores de HDAC al medio para facilitar la remodelación epigenética. Hemos encontrado que la inclusión de los inhibidores de HDAC aumenta habitualmente la generación de colonias IPSC totalmente reprogramadas por 2 veces. Una vez que las colonias IPSC presentan la morfología típica de células madre embrionarias humanas (CMEH), se transfieren suavemente para placas de cultivo individuales recubiertos de tejido IMEF para el continuo crecimiento y expansión.

Introduction

iPSCs se derivan de tejidos somáticos a través de la expresión ectópica de un conjunto mínimo de genes pluripotencia. Esta técnica se demostró inicialmente por la transducción retroviral de los fibroblastos humanos con Oct4, Sox2, Klf4, y cMYC, que son altamente expresado en el estado pluripotente ^1. Estos transitoriamente expresadas "factores de reprogramación" alteran el perfil de expresión génica y epigenética paisaje de la célula diana análoga a las células madre de embriones humanos ^2. Una vez creado, iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de tejido para análisis adicionales. Por lo tanto, mantienen la promesa para el uso en la medicina regenerativa, el modelado de la enfermedad, y aplicaciones de terapia génica. Sin embargo, lo que altera el genoma con virus que se integran tiene el potencial de alterar la expresión del gen endógeno, la influencia fenotipo celular, y en última instancia sesgan los resultados científicos. Además, integraciones virales aleatorias pueden conducir a celular e deletéreofectos, incluyendo la posibilidad de la transformación maligna ³ o re-expresión de los transgenes oncogénicos ^4. Aplicaciones clínicas futuras requerirán-integración no generación de IPSC.

Episomas, que son moléculas de ADN circular cromosómicas adicionales, ofrecen una estrategia para generar, CMPI-integración libre de costo efectivo ^5. La combinación de vectores episomales que se muestran en la Tabla 1 expresa la reprogramación factores de Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, y LIN28A. El plásmido pCXLE_hOCT3 / 4-F-shp53 también contiene una p53 shRNA para la supresión temporal de TP53 para mejorar la reprogramación celular ^6. El vector deficiente pCXWB-EBNA1 replicación promueve la amplificación de factores de reprogramación y el aumento de la eficiencia de reprogramación proporcionando un aumento transitorio en la expresión de EBNA1 ^7. El plásmido pCXLE_EGFP se puede añadir a la mezcla de nucleofection con el propósito de determining la eficacia de transfección o para aplicaciones de células de clasificación. Con la excepción de p CXWB-EBNA1, los plásmidos episomales utilizados en este protocolo contienen el origen del virus de Epstein-Barr de la replicación viral y el gen EBNA1, que median la replicación y la partición del episoma durante la división de la célula huésped ^8. Los episomas se pierden espontáneamente con la expansión sucesiva IPSC ^7. Subclonación y caracterización de iPSCs con pérdida vector episomal, que se puede inferir a partir de la pérdida de la expresión de eGFP, pueden conducir a la integración completamente iPSCs gratuitas para futuras aplicaciones clínicas.

Inherente al proceso de generación de IPSC es la supresión de genes específicos de linaje y la reactivación de los genes de pluripotencia asociada. Regulación de la expresión del gen se produce en múltiples niveles dentro del núcleo, incluyendo modificaciones en el ADN y la cromatina para permitir que factores de transcripción, elementos de ADN reguladores, y el acceso de la ARN polimerasa para orientargenes. Remodelación del paisaje epigenético de la cromatina a través de modificaciones globales es un componente clave para la re-expresión del programa genético pluripotencia. Una modificación de la cromatina específica que es importante en la regulación de la expresión génica es la acetilación de las histonas en particular los residuos de lisina, que permite el acceso a genes diana a través de disminución de la tensión de la bobina de ADN-histona. Inhibidores de HDAC son pequeñas moléculas que se han demostrado para mejorar IPSC reprogramación y células madre auto-renovación ^9,10, probablemente debido al apoyo del estado acetilado ^11. El protocolo se describe a continuación, adaptada de una publicación anterior utilizando la integración de los lentivirus ^12, proporciona un método paso a paso para la generación de IPSC optimizado a partir de sangre periférica utilizando episomas y los inhibidores de HDAC. Las concentraciones de inhibidor de HDAC utilizados aquí son la mitad de los descritos por Ware, y otros han llevado habitualmente a un aumento de 2 veces en colonias IPSC totalmente reprogramadas más estándar. ^9, yprotocolos de reprogramación episomales sin inhibidores de HDAC. Este nivel de reprogramación es a la par con la eficiencia que observamos con métodos de lentivirus. El uso de este protocolo, se han generado de manera eficiente IPSC de individuos como viejos como 87 años de edad.

Protocol

Consentimiento informado por escrito, según lo aprobado por las juntas de revisión institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson y los niños "s Hospital of Philadelphia, se obtuvo de los pacientes antes de la recogida de muestras de sangre periférica. Se observaron Todas las directrices institucionales. Todos los experimentos con animales, incluyendo la generación de MEF y formación de teratomas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.

1. Ficoll separación de PBMC y Expansión de Eritroblastos - Día 0

1. Diluir la sangre periférica 1: 1 con tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS). En un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 ml, la capa cuidadosamente 7 ml de sangre diluida sobre 3 ml de temperatura ambiente Ficoll-Hypaque.
2. Centrifugar la muestra a 400 xg durante 30 min.
3. Las PBMCs se han asentado a la interfaz entre el plasma y el Ficoll-Hypaque, visto como una capa blanca turbia. Con una pipeta de transferencia estéril, recoger el PBMCs en uno 15 ml tubo cónico. Llevar el volumen a 10 ml usando DPBS.
4. El uso de un hemocitómetro, contar las CMSP.
5. Pipetear 2 × 10 ⁶ PBMCs en un tubo cónico de 15 ml separado y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Centrifugar las células restantes y congelar a una concentración de 2 × 10 ⁶ PBMC / ml en suero bovino fetal al 90% (FBS) sulfóxido / 10% de dimetilo (DMSO).
6. Preparar Media Expansión: medio libre de suero QBSF-60 (proteger de la luz) + penicilina / estreptomicina (1%) + ácido ascórbico (50 ng / ml) + factor de células madre (SCF, 50 ng / ml) + interleucina 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoyetina (EPO, 2 U / ml) + insulina como factor de crecimiento 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexametasona (1 M; protegerlo de la luz; descongelar una alícuota fresca cada medio cambiar).
7. Resuspender 2 × 10 ⁶ PBMC en 2 ml de medio de expansión recién hecho y el lugar en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos y se incuban en un incubador humidificado 37 ° con una atmósfera de 5% O _2, 5% de CO _2, y 90% de N _2.
8. En el día 3 y el día 6, sustituir los medios de comunicación.
   1. Recoger las células y lavar el pocillo con 2 ml de QBSF-60 para recoger las células restantes.
   2. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
   3. Resuspender las células en 2 ml de nuevo medio de expansión y devolverlos a la misma placa de 12 pocillos.

2. Las células reprogramación por Nucleofection - Día 9

1. Pipetear los plásmidos de reprogramación en un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml (Tabla 1).
2. Mezclar la solución con nucleofection Suplemento (suministrado por el fabricante) y pipeta en un tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril.
3. Pipetear 2 ml de Media Expansión en un pocillo de una placa de 12 y colocarla en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O _2, 5% de CO _2, y 90% N _2), para el equilibrado antes de añadir las células.
4. Recoger elcélulas cultivadas y lavar el pocillo con 2 ml de QBSF-60 para recoger las células restantes.
5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante.
6. Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de DPBS y centrifugando a 300 xg durante 5 min.
7. Aspirar el sobrenadante.
8. Resuspender el sedimento celular en 100 l de solución de nucleofection + Suplemento, teniendo cuidado de evitar la generación de burbujas.
9. Pipetear la suspensión de células en el tubo que contiene los plásmidos reprogramación, pipeta arriba y hacia abajo una vez, y pipetear la muestra en la parte inferior de la cubeta nucleofection.
10. Colocar la cubeta en la máquina nucleofection y ejecutar el Programa T-019.
11. Transferencia de 100 l de la expansión precalentado mediano (de la placa equilibrante en el Paso 2.3) en la cubeta nucleofection.
12. Inmediatamente recoger toda la muestra y el depósito en el pozo de pre-calentado medio de expansión. Evite recoger el blanco, flotando los restos celulares muertos.
13. Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O _2, 5% de CO _2, y 90% N ₂₎ para el crecimiento.

3. Revestimiento células alimentadoras - Día 10 o 11

1. El día 10, las células alimentadoras placa.
   1. Escudo uno de 6 pocillos placa de cultivo de tejidos con gelatina.
      1. Pipetear 1 m de 0,1% de gelatina en solución salina tamponada de Hank (HBSS) en cada pocillo de la placa.
      2. Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37ºC durante al menos 5 min.
      3. Inmediatamente antes de su uso, aspirar la solución de gelatina de la placa.
   2. Descongelar un vial de 2 × 10 ⁶ fibroblastos embrionarios de ratón irradiados a 3000 cGy en 10 ml de precalentado MEF Medios (Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + penicilina / estreptomicina (1%)).
   3. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 12 ml de MEF Medios y pipeta de 2 mlnto cada pocillo de la placa de 6 así revestida con gelatina. Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O _2, 5% de CO _2, y 90% N ₂₎ hasta el día 12.

4. Revestimiento células en células alimentadoras y Cambio Medio - Día 12

1. Recoger las células nucleofected en uno 15 ml tubo cónico y recoger cualquier resto de las células por lavado de las bien con 2 ml de QBSF-60. Centrifugar la muestra a 300 xg durante 5 min.
2. Preparar reprogramación Medio: Iscove medio de Dulbecco modificado (IMDM) + FBS (10%) + no animal L-glutamina (1 mM) + no esenciales aminoácidos (NEAA, 1%) + penicilina / estreptomicina (1%) + β mercaptoetanol (0,1 mM) + factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, añaden fresco en la alimentación, 10 ng / ml) + ácido ascórbico (añadido en fresco de alimentación, 50 g / ml).
3. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 12 ml de Medio de reprogramación. De pipeta 2 ml por pocillo de la suspensión celular enla placa de 6 pocillos de células de alimentación (como se ha preparado en la Sección 3). Centrifugar la placa a 50 xg durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O _2, 5% de CO _2, y 90% N ₂₎ para el crecimiento. Cambie la Reprogramación Medio cada dos días hasta que las colonias IPSC comienzan a aparecer (1-2 semanas).
5. Preparar hESC Medio: DMEM / F12 1: 1 + Knockout suero sustitución (20%) + penicilina / estreptomicina (1%) + NEAA (1%) + no animal L-glutamina (1 mM) + piruvato de sodio (1%) + bicarbonato de sodio (0,12%) + β-mercaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (añadidos fresco en la alimentación, 10 ng / ml)
6. Prepare los inhibidores de HDAC: butirato sódico (añadido a la alimentación fresca, 100 M), ácido suberanilohydroxamic (SAHA, añadió fresca en la alimentación, 200 nM). Una vez que aparecen colonias IPSC, comienzan a alimentarse de las células con inhibidores de células madre Mediana + HDAC, el cambio de medio cada día.
   NOTA: butirato de sodio es una pequeña molécula que se adsorbe a tubos de plástico, tor lo tanto guárdelo en un tubo de vidrio de borosilicato a 4 ° C.

5. Aislamiento de clones IPSC

1. Una vez que las colonias IPSC son lo suficientemente grandes como para ser aislado (20-25 células), ellos recoger con una pipeta P20.
2. Preparar los inhibidores de HDAC: butirato de sodio (añadido en fresco de alimentación, 100 mM), SAHA (añadido en fresco de alimentación, 200 nM)
3. Coloque las colonias aisladas en iMEFs en platos individuales de 35 mm que contienen inhibidores de la HDAC hESC Medio + + La clonación y recuperación del Suplemento.
4. El día después de recoger las colonias, cambie el medio a los inhibidores de células madre Mediana + HDAC.
5. Cambie el medio todos los días hasta que las colonias IPSC están listos para los pases.
6. Eliminar los inhibidores de HDAC del medio de colonias una vez estabilizan en el paso 2-3.

Results

Tres días después de nucleofection y de las placas, las células nucleofected en iMEFs, la eficiencia de nucleofection exitoso debe ser estimado por microscopía de fluorescencia para eGFP. La Figura 1 muestra un experimento de nucleofection típico con aproximadamente 5-10% de la población total de células que expresan eGFP.

Colonias reprogramado IPSC comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de nucleofection. Las colonias son generalmente circular con bordes b...

Discussion

Para exitosa generación de IPSC cuando se utiliza este protocolo, hay varias advertencias importantes que deben ser considerados. Durante la fase de expansión eritroblasto, el programa de cambio de los medios de comunicación debe ser estrictamente seguida, como desviaciones pueden conducir a la estimulación ineficiente de la población de células progenitoras diana y una menor eficiencia de la generación de IPSC. Es importante hacer nuevo medio de expansión con dexametasona fresca con cada cambio de los medios de comunic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Almacene a 4 °C. Caliente a temperatura ambiente antes de usar.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Tienda en 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Tienda en 4 °C.
suero fetal bovino (FBS)	Life Technologies	10437028	Tienda en -20 ° C hasta que sea necesario. Descongelar, alícuota, almacenar a 4 °C.
dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich 154938		Almacenar a temperatura ambiente.
QBSF-60 medio sin suero	Fisher Scientific	50-983-234	Almacene en 4 °C.
penicilina/estreptomicina	Life Technologies 15140122		Tienda en 4 °C.
Kit de nucleofactor de línea celular V	Lonza	VCA-1003	Tienda a 4 °C.
Solución de gelatina al 2%	Sigma-Aldrich	G1393	Almacenar a 4 & deg; C, licuar en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Tienda en 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Tienda en 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Tienda en 4 °C.
L-glutamina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Alícuota, congelación a -20 °C.
aminoácidos no esenciales (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Tienda en 4 & deg; C, lejos de la luz.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Tienda a 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Alícuota, congelar a -20 °C.
piruvato de sodio, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Almacenar a 4 °C.
bicarbonato de sodio, 7.5%	Life Technologies	25080094	Tienda a 4 °C.
factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Hacer un caldo de 10 mg/ml en DPBS, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
butirato de sodio	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Fabrica 2000x stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congelación a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
Clonación de células hES & Suplemento de Recuperación	Stemgent	01-0014-500	Tienda en -20 ° C hasta que sea necesario. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
Matrigel BD calificado por ESC	BD Biosciences	35-4277	Descongele durante la noche en hielo a 4 & deg; C, alícuota en tubos preenfriados utilizando puntas de pipeta preenfriadas. Almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario. Descongele a las 4 & grados; C, úselo inmediatamente.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Alícuota, congelación a -20 °C.
ácido ascórbico, en polvo	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Prepare un caldo de 5 mg/ml en DPBS, filtro estéril, almacene a 4 & C.
factor de células madre humanas recombinante (SCF)	R & D Sistemas	255-SC-010	Marca 100 μ g/m de existencias en SFEM, alícuota, congelación a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
interleucina humana recombinante 3 (IL-3)	R & D Sistemas	203-IL-010	Marca 100 μ g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
eritropoyetina (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Hacer 1000 U/ml de caldo en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
factor de crecimiento similar a la insulina humana recombinante 1 (IGF-1)	R & D Sistemas	291-G1-200	Marca 100 μ g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522	Hacer 1000x stock (100 mM) en DPBS.
dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Hacer 50x stock (50 μ M) en DPBS, filtro estéril, almacenar a 4 & °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Fabrica 2.000 veces el stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congela a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos	Fisher Scientific	08-772-29
tubo cónico de 15 ml	Sarstedt	62553002
tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Fisher Scientific	08-772-1B
placas de cultivo tisue de 35 mm	BD Biosciences	353001
Pipetas serológicas desechables de 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Pipetas serológicas desechables de 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Pipetas serológicas desechables de 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l puntas de pipeta, puntas de barrera	Genessee	24-404
vidrio pipetas Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
ayuda para pipeta	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624