Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

Resumen

Aquí describimos un ensayo biológico robusto para cuantificar la tasa relativa de proteólisis por el sistema ubiquitina-proteasoma. La lectura del ensayo es la tasa de crecimiento de la levadura en cultivo líquido, que depende de los niveles celulares de una proteína reportera que comprende una señal de degradación fusionada con un marcador metabólico esencial.

Resumen

La degradación de proteínas por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es un mecanismo regulador importante para la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El enfoque estándar para la determinación de la degradación intracelular de proteínas se basa en ensayos bioquímicos para el seguimiento de la cinética de disminución de la proteína. Tales métodos son a menudo laborioso y consume mucho tiempo y por lo tanto no susceptible de experimentos dirigidos a evaluar múltiples sustratos y condiciones de degradación. Como alternativa, los ensayos basados ​​en el crecimiento de células se han desarrollado, que son, en su formato convencional, ensayos de punto final que no puede determinar cuantitativamente los cambios relativos en los niveles de proteína.

Aquí se describe un método que determina fielmente los cambios en las tasas de degradación de proteínas mediante el acoplamiento a la cinética de crecimiento celular de la levadura. El método se basa en un sistema de selección establecido donde uracilo auxotrofía de URA3 -deleted células de levadura es rescatado por una proteína reportera expresada exógenamente, Compuesto de una fusión entre el gen URA3 esencial y determinante de degradación (degron). La proteína indicadora está diseñado de manera que su tasa de síntesis es constante mientras que su velocidad de degradación se determina por la degron. Como el crecimiento de células en medio sin uracilo deficiente es proporcional a los niveles relativos de Ura3, la cinética de crecimiento dependen enteramente de la degradación de la proteína reportera.

Este método mide con precisión los cambios en la cinética de degradación de proteínas intracelulares. Se aplicó a: (a) Evaluación de la contribución relativa de los factores de ubiquitina-conjugación conocidos a la proteolisis (b) la conjugación de la enzima E2 estructura-función analiza (c) Identificación y caracterización de nuevos degrons. La aplicación del sistema basado en URA3 degron- trasciende el campo de la degradación de proteínas, ya que también se puede adaptar a los cambios de monitorización de los niveles de proteína asociadas con las funciones de otras vías celulares.

Introducción

El sistema de degradación ubiquitina-proteasoma es una máquina reguladora importante, que ha sido implicado en el mantenimiento de la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El UPS conjuga inicialmente múltiples moléculas de ubiquitina a una proteína diana después de lo cual la proteína poli-ubiquitina-etiquetado es degradada por el proteasoma 26S. En la mayoría de los casos, el paso limitante de la degradación mediada por ubiquitina es ubiquitylation sustrato, mediada por la conjugación de enzimas E2 y E3 ligando enzimas (E3 ligasas) ^1. En consecuencia, la estabilidad intracelular de proteínas específicas refleja su susceptibilidad a la ubiqui....

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Transforme las células de levadura auxótrofa apropiadas, como Try467 (Tabla 2), con un plásmido que contenga (a) una fusión URA3-degron y (b) un marcador metabólico adicional para la selección y el mantenimiento >YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1-UV). Se trata de un plásmido integrador de levadura que contiene una proteína de fusión compuesta por Deg1, un degron derivado del factor de transcripción de levadura Mat2¹⁷, epítopo FLAG, para su detección por inmunotransferencia, Vma12, una proteína ....

Resultados

Investigando el papel de las enzimas de la vía Doa10 en la degradación de un sustrato reportero

Para probar la validez del método GiLS, se comparó con un ensayo de degradación tradicional. Este experimento evalúa la contribución relativa de los componentes del complejo^20,21 Doa10 E3-ligasa localizado en la membrana ER a la degradación del sustrato indicador de control de calidad de proteínas Deg1-VU (Figura 3A). El plásmido Deg1-VU

Discusión

Aquí describimos un ensayo basado en el crecimiento celular para determinar las tasas relativas de degradación de proteínas, denominado 'Cinética de crecimiento en cultivo líquido en condiciones selectivas' (GiLS). El ensayo GiLS tiene varias ventajas: es fácil de configurar, la adquisición y el análisis de datos son sencillos y es extremadamente modular. En consecuencia, GiLS se puede aplicar simultáneamente a múltiples muestras en un formato de placa de pocillos múltiples fácil de usar que se puede adaptar a la automat.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio	BD Biosciences	233520	Para el crecimiento de levadura en medios mínimos SD. Los aminoácidos a suministrar son: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptófano
Sulfato de amonio	Sigma - Aldrich	A4418
Glucosa	Sigma - Aldrich	16325
Adenina	Sigma - Aldrich	A8626
Uracilo	Sigma - Aldrich	U0750
Aminoácidos	Más Altos pureza disponible
Placas de 96 pocillos	Nunc	167008	Se puede utilizar cualquier otra marca compatible
Ciclohexamida	Sigma - Aldrich	C7698	Conc. de trabajo 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO series	Tecan		Para la incubación de levaduras y mediciones de OD600. Se puede utilizar cualquier otro lector de temperatura compatible.
MDTcalc			Software experimental