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Artículo de método

Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

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DOI:

10.3791/52021

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6 de noviembre de 2014

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1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un ensayo biológico robusto para cuantificar la tasa relativa de proteólisis por el sistema ubiquitina-proteasoma. La lectura del ensayo es la tasa de crecimiento de la levadura en cultivo líquido, que depende de los niveles celulares de una proteína reportera que comprende una señal de degradación fusionada con un marcador metabólico esencial.

Resumen

La degradación de proteínas por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es un mecanismo regulador importante para la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El enfoque estándar para la determinación de la degradación intracelular de proteínas se basa en ensayos bioquímicos para el seguimiento de la cinética de disminución de la proteína. Tales métodos son a menudo laborioso y consume mucho tiempo y por lo tanto no susceptible de experimentos dirigidos a evaluar múltiples sustratos y condiciones de degradación. Como alternativa, los ensayos basados ​​en el crecimiento de células se han desarrollado, que son, en su formato convencional, ensayos de punto final que no puede determinar cuantitativamente los cambios relativos en los niveles de proteína.

Aquí se describe un método que determina fielmente los cambios en las tasas de degradación de proteínas mediante el acoplamiento a la cinética de crecimiento celular de la levadura. El método se basa en un sistema de selección establecido donde uracilo auxotrofía de URA3 -deleted células de levadura es rescatado por una proteína reportera expresada exógenamente, Compuesto de una fusión entre el gen URA3 esencial y determinante de degradación (degron). La proteína indicadora está diseñado de manera que su tasa de síntesis es constante mientras que su velocidad de degradación se determina por la degron. Como el crecimiento de células en medio sin uracilo deficiente es proporcional a los niveles relativos de Ura3, la cinética de crecimiento dependen enteramente de la degradación de la proteína reportera.

Este método mide con precisión los cambios en la cinética de degradación de proteínas intracelulares. Se aplicó a: (a) Evaluación de la contribución relativa de los factores de ubiquitina-conjugación conocidos a la proteolisis (b) la conjugación de la enzima E2 estructura-función analiza (c) Identificación y caracterización de nuevos degrons. La aplicación del sistema basado en URA3 degron- trasciende el campo de la degradación de proteínas, ya que también se puede adaptar a los cambios de monitorización de los niveles de proteína asociadas con las funciones de otras vías celulares.

Introducción

El sistema de degradación ubiquitina-proteasoma es una máquina reguladora importante, que ha sido implicado en el mantenimiento de la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El UPS conjuga inicialmente múltiples moléculas de ubiquitina a una proteína diana después de lo cual la proteína poli-ubiquitina-etiquetado es degradada por el proteasoma 26S. En la mayoría de los casos, el paso limitante de la degradación mediada por ubiquitina es ubiquitylation sustrato, mediada por la conjugación de enzimas E2 y E3 ligando enzimas (E3 ligasas) 1. En consecuencia, la estabilidad intracelular de proteínas específicas refleja su susceptibilidad a la ubiquitina-conjugación y la actividad de sus enzimas ubiquitylation afines.

Ligasas E3 son los principales componentes de reconocimiento de sustrato de la UPS. Como tal, estas enzimas reconocen degrons dentro de sus sustratos que están ausentes o no expuestos en sus contrapartes estables 2. Por ejemplo, muchos reguladores del ciclo celular mUST ser sintetizado y degradado de manera temporal específica, a fin de mantener la progresión del ciclo celular en orden. La degradación de estas proteínas a menudo se controla por fosforilación, mediada por quinasas reguladas de señalización celular 3,4. Por otro lado, las proteínas plegadas de forma aberrante, se reconocen a través de degrons crípticos. Se trata de regiones que normalmente están ocultos en la estructura nativa y están expuestos a la estructura de la perturbación. Tales degrons incluyen dominios hidrofóbicos 5-7 y segmentos intrínsecamente desordenados 8.

Desde el descubrimiento seminal del sistema-ubiquitina para la degradación de proteínas y la caracterización de sus fundamentos en lisados ​​de reticulocitos 9, la genética de la levadura fue instrumental en el descubrimiento de muchos de los componentes del sistema de ubiquitina 10. El éxito de la levadura como organismo modelo para el análisis sistemático de la degradación de proteínas por el UPS se debe principalmente al hecho de que el SAI es altoLy conserva en todos los eucariotas 4, junto con su amenability como un sistema experimental. De hecho, los sistemas basados ​​en levaduras se emplean comúnmente para descifrar los mecanismos de acción de la maquinaria de ubiquitinación.

El estudio de la degradación de proteínas por medios bioquímicos por lo general requiere la preparación de extractos celulares. Mientras que las proteínas de células animales pueden ser extraídos en condiciones relativamente suaves que conservan las interacciones proteína y la función, la presencia de una pared celular de levadura robusto en condiciones de interrupción 11 requiere considerablemente más severas que pueden afectar a la recuperación de proteínas. De hecho, diferentes procedimientos para la interrupción de la célula de levadura varían considerablemente en su capacidad para recuperar las proteínas intactas en cantidades que representan correctamente su abundancia relativa celular. Además inexactitud inherente a los diferentes métodos utilizados para la determinación de las tasas de degradación de proteínas específicas: experimentos metabólicos basado etiquetado 'pulso-caza' seguido de immunoprecipitation, para aislar proteínas específicas 12, a menudo no es estrictamente cuantitativo. Por lo tanto, cuando la degradación de proteínas se compara con este método, la precaución adicional debe tener precaución en la interpretación de los resultados. Para evitar este inconveniente, una alternativa cicloheximida (CHX) ensayo de persecución se puede emplear 12. En este ensayo, se añade el inhibidor de la traducción a cultivos de células y los cambios temporales en los niveles de estado estable de proteínas son monitoreados posteriormente. Sin embargo, el uso de CHX se limita a las proteínas con vidas medias relativamente cortas (<90 min), como la inhibición a largo plazo de la síntesis de proteínas es citotóxico. En particular, tanto de los ensayos mencionados anteriormente requieren el uso de anticuerpos específicos para la proteína, que no siempre están disponibles.

Para superar estas limitaciones técnicas, los investigadores han desarrollado varios enfoques que no requieren la extracción de células y la manipulación directa de proteínas. Un enfoque se basa en el establecimiento de sí auxotróficocepas del st, obtenidos mediante la supresión de los genes que codifican las enzimas metabólicas esenciales. Tales genes incluyen HIS3, LEU2, LYS2 y TRP1, que codifica para las enzimas necesarias para la biosíntesis de aminoácidos, así como URA3 que codifica OMP descarboxilasa (Ura3), una enzima esencial de la biosíntesis de pirimidina ribonucleótido. Ura3 ha sido ampliamente utilizado en estudios de degradación de proteínas. En estos ensayos, la expresión constitutiva de Ura3 rescata crecimiento de las células ura3 en medio sin uracilo deficiente 13. En consecuencia, desestabilizando Ura3 a través de la fusión de un degron puede disminuir el crecimiento de células en medio mínimo carente de uracilo. Este método se ha utilizado en varios estudios de degradación de proteínas, incluyendo la identificación de determinantes de la degradación de 5, ligasas E3 14 y ubiquitylation auxiliar factores de 15 y el descubrimiento de nuevos UPS degrons 16. Todos estos métodos empleados crecimiento de las células en placas de agar como lectura del ensayo. Sin embargo, tque el criterio de crecimiento (crecimiento positivo / negativo), mientras robusta y eficiente, es sobre todo cualitativo y no proporciona información cuantitativa que es importante para evaluar la potencia de un degron o la contribución relativa de los diversos factores de degradación auxiliares.

Por ello, hemos desarrollado y utilizado los vectores de levadura y los métodos de detección que permite un análisis sistemático y cuantitativo de la degradación de proteínas por el URA3 -degron sistema de fusión. El protocolo se basa en un ensayo fácil de manejar que mide la cinética de crecimiento en cultivo líquido bajo condiciones selectivas (GILS) y en la generación de curvas de crecimiento estándar. Cinética de crecimiento de la levadura se caracterizan por tres fases principales - el desfase, la exponencial (de registro) y la fase estacionaria. Cálculo de la cinética de replicación de levadura durante la fase de registro en condiciones selectivas, que se determina por los niveles de expresión de la Ura3-degron, proporciona una medición cuantitativa o imparcialf degradación de proteínas. Este método se puede aplicar a la medición y la comparación de las tasas de degradación de múltiples sustratos UPS simultáneamente en múltiples cepas y bajo diversas condiciones.

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Protocolo

1. Cultivo celular

  1. Transforme las células de levadura auxótrofa apropiadas, como Try467 (Tabla 2), con un plásmido que contenga (a) una fusión URA3-degron y (b) un marcador metabólico adicional para la selección y el mantenimiento >YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1-UV). Se trata de un plásmido integrador de levadura que contiene una proteína de fusión compuesta por Deg1, un degron derivado del factor de transcripción de levadura Mat217, epítopo FLAG, para su detección por inmunotransferencia, Vma12, una proteína ER estable, y Ura315,18 (Figura 3A). (Consulte la Tabla 3 para ver los plásmidos utilizados en este estudio y para ver ejemplos adicionales de plásmidos adecuados).
  2. Para la selección y el mantenimiento de plásmidos, mantenga las células en placas de agar bajo un medio sintético definido (SD) adecuado que carezca de marcadores de selección de aminoácidos19 (por ejemplo, Deg1-UV se selecciona y mantiene bajo un medio selectivo SD-LYS).
  3. Cultive las células O/N a 30 °C en un medio SD selectivo adecuado para el mantenimiento del plásmido hasta que se alcance una fase estacionaria. Cultive las células en tubos de ensayo o en una placa de 96 pocillos, dependiendo del número de muestras a examinar (sección 2).

2. Preparación de la célula para el análisis

  1. Cuando se vaya a analizar un pequeño número de muestras (N≤15), diluir las células y sustituir el medio de la siguiente manera:
    1. Diluir 50 μl de células de un cultivo O/N con 150 μl de medio SD por pocillo en una placa de 96 pocillos (fondo transparente). Tenga en cuenta que la primera muestra se designa como blanco y contiene solo medio.
    2. Determine los valores de OD600 de las muestras en la placa de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas.
    3. Calcule el DE600 real en cada pozo multiplicando la lectura de DE600 por el factor de dilución (x4), del cual se resta el valor de la lectura en blanco. Normalice los valores resultantes dividiendo por 0,55 para obtener una longitud de trayectoria calculada de 1 cm según la ley de Beer-Lambert. Tenga en cuenta que este valor es constante cuando se mide el diámetro exterior de600 de 200 μl de células en una placa estándar de 96 pocillos.
    4. Calcule el volumen exacto necesario para obtener células de levadura en una cantidad equivalente a OD600 de 0,25 y transfiéralo a un tubo Eppendorf.
    5. Gire las celdas a alta velocidad (12.000 x g) durante 1 min.
    6. Extraer el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml del medio selectivo adecuado (ver sección 3.1) para obtener una DO600 de 0,25.
    7. Transfiera 200 μl de las cepas diluidas a un nuevo pocillo en una placa de 96 pocillos.
  2. Cuando se vaya a analizar un gran número de muestras (N>15), diluir las células y reemplazar el medio sin la medición previa de OD600, de la siguiente manera:
    1. Transfiera 10 μl de células estacionarias cultivadas O/N en una placa de 96 pocillos a una nueva placa de 96 pocillos que contenga 190 μl (dilución 1:20) del medio selectivo apropiado (ver sección 3.1).

3. Cinética de crecimiento en cultivo líquido bajo condiciones selectivas (GiLS)

  1. Utilice los siguientes medios para las mediciones de crecimiento utilizando el indicador Ura3-degron :
    1. Para controles positivos del crecimiento de levaduras en condiciones no restrictivas, utilice medios SD selectivos de plásmidos (ver sección 1.2). Si no se requiere selección de plásmidos, por ejemplo, cuando se utiliza un plásmido integrador como Deg1-UV, se puede utilizar un medio SD que contenga todos los aminoácidos necesarios (SD completo).
    2. Para muestras experimentales que miden el crecimiento en condiciones restrictivas, utilice el medio SD-URA.
  2. Ajuste un lector de microplacas multimodo a: una temperatura de incubación de 30 °C, intervalos de medición OD600 de 15 min y ciclos de agitación orbitales y lineales de 1 min cada siete min.
    NOTA: Este agitado de modo dual se optimizó para obtener una distribución homogénea de las células; Sin embargo, otros modos de agitación o incluso ningún temblor pueden funcionar también.
  3. Incubar las células a 30 °C en un lector de microplacas O/N o hasta que las células hayan alcanzado la fase estacionaria (12-24 horas).
  4. Exporte los datos sin procesar a un archivo de hoja de cálculo.
  5. Determine la cinética de crecimiento de la levadura utilizando MDTcalc, un programa de software personalizado que calcula el tiempo mínimo (en horas) para que las células dupliquen el tamaño de su población (Tiempo Mínimo de Duplicación (MDT); para más detalles, consulte la sección 4).

4. Cálculo del Tiempo Mínimo de Duplicación (MDT): Principios del Algoritmo MDTcalc

NOTA: Los principios del algoritmo MDTcalc, utilizando una muestra representativa de células de levadura Try467 (Tabla 2) cultivadas en medios completos SD, se ilustran en la Tabla 1 y la Figura 1, mostrando una hoja de cálculo de datos y gráficos de crecimiento, respectivamente.

  1. Reste los valores de OD600 en blanco, obtenidos en el pocillo respectivo, de cada una de las lecturas obtenidas en el pocillo de muestra. Divida las diferencias resultantes por 0,55 (para placas de 96 pocillos) para corregir la longitud de la trayectoria de la luz. Traza los valores finales (Tabla 1, Trans.) en función del tiempo para producir la curva de crecimiento real de la levadura (OD600/h) (Figura 1A).
  2. Calcule log2 (OD600) para cada uno de los valores transformados para convertir la fase de crecimiento logarítmico en una curva lineal (Figura 1B).
  3. Calcule la pendiente de un intervalo de 10 puntos de tiempo (N = 10) comenzando en el tiempo 0 y moviéndose un punto de tiempo a la vez hasta N<10 (Tabla 1, Pendiente; Figura 1C).
  4. Calcule el valor inverso de cada pendiente para obtener el tiempo necesario para que la población de celdas se duplique (Tabla 1, 1/Pendiente; Figura 1C). Calcule el valor mínimo de 1/Pendiente para determinar el MDT (Tabla 1, rectángulo negro; Figura 1C). Extraiga el MDT calculado para las celdas de la muestra (Tabla 1, 1/Pendiente, rectángulo negro) del intervalo de tiempo seleccionado (Tabla 1, delineado por un rectángulo rojo, Figuras 1B, 1D).
    NOTA: La tasa de crecimiento celular en el medio SD-URA es inversamente proporcional al MDT.

5. Uso de MDTcalc

  1. Copie los archivos de programa complementados en una carpeta designada en el equipo.
  2. Asegúrese de que el archivo de hoja de cálculo que contiene los datos de crecimiento esté guardado y cerrado. Abra el programa de aplicación MDTcalc para ver que aparece la pantalla de inicio.
    1. Inserte la información requerida, como se muestra en la Figura 2:
      1. En 'Ruta del archivo', haga clic en el rectángulo de la derecha para ubicar el archivo de la hoja de cálculo.
      2. En "Nombre de la hoja", escriba el nombre de la hoja de cálculo donde se encuentran los datos sin procesar.
      3. En 'Posición inicial', inserte la coordenada de la hoja de cálculo del tiempo 0 de la primera muestra.
      4. En 'Columna de tiempo', inserte la letra que define la ubicación de la columna de punto de tiempo (el tiempo debe proporcionarse en segundos).
      5. En 'Columna en blanco', inserte la letra que define la ubicación de la columna en blanco (generalmente, pero no necesariamente, en el pocillo A1 de la placa de 96 pocillos).
      6. En "Valor OD", elija el valor mínimo transformado de OD600 necesario para iniciar el cálculo de MDT (normalmente 0,15-0,25). El establecimiento de este valor impide los cálculos de MDT para cultivos en fase de retraso debido a una dilución excesiva, de modo que MDT se calcula solo para muestras que alcanzan el valor de OD600 definido o superior.
    2. Una vez introducido el último valor, pulse el botón "calcular" situado en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que la barra de progreso de la derecha cambie gradualmente a verde. No abra el archivo de hoja de cálculo durante el proceso de cálculo.
    3. Exporte los dos conjuntos de datos que aparecen automáticamente en la pantalla al finalizar el cálculo de MDT a una hoja de cálculo. Asegúrese de que los datos incluyan: (a) el valor de MDT para cada pozo que pase la prueba del valor mínimo de DO (como se establece en la sección 5.2.1.6) y (b) el punto de tiempo inicial del intervalo a partir del cual se calculó el MDT (hora de inicio).

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Resultados

Investigación del papel de las enzimas de la vía Doa10 en la degradación de un sustrato informador

Para evaluar la validez del método GiLS, este se comparó con un ensayo de degradación tradicional. Este experimento evalúa la contribución relativa de los componentes del complejo de la ligasa E3 Doa10 localizada en la membrana del retículo endoplásmico20,21 en la degradación del sustrato informador del control de calidad de proteínas Deg1-VU (Figura 3...

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Discusión

Aquí describimos un ensayo basado en el crecimiento celular para determinar las tasas relativas de degradación de proteínas, denominado 'Cinética de crecimiento en cultivo líquido en condiciones selectivas' (GiLS). El ensayo GiLS tiene varias ventajas: es fácil de configurar, la adquisición y el análisis de datos son sencillos y es extremadamente modular. En consecuencia, GiLS se puede aplicar simultáneamente a múltiples muestras en un formato de placa de pocillos múltiples fácil de usar que se puede adaptar a la automat...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Yuval Reiss y al Dr. William Breuer por revisar críticamente el manuscrito y a Omri Alfassy por ayudar en el desarrollo del ensayo de pantalla Ura3-GFP. También agradecemos al Dr. M. Hochstrasser y al Dr. R. Kulka por los plásmidos y las cepas. Este trabajo fue financiado por la Academia Israelí de Ciencias (subvención 786/08) y por la Fundación Científica Binacional Estados Unidos-Israel (subvención 2011253).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonioBD Biosciences233520Para el crecimiento de levadura en medios mínimos SD. Los aminoácidos a suministrar son: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptófano
Sulfato de amonioSigma - AldrichA4418
GlucosaSigma - Aldrich16325
AdeninaSigma - AldrichA8626
UraciloSigma - AldrichU0750
AminoácidosMás Altos pureza disponible 
Placas de 96 pocillosNunc167008Se puede utilizar cualquier otra marca compatible
Ciclohexamida Sigma - AldrichC7698Conc. de trabajo 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO seriesTecanPara la incubación de levaduras y mediciones de OD600. Se puede utilizar cualquier otro lector de temperatura compatible.
MDTcalcSoftware experimental

Referencias

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