La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.
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Artículo de método
Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética
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Resumen
Resumen
Las células madre embrionarias (ESC) son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular. Son especialmente útiles para investigar el desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas tempranas (HPC). La expresión génica en las ESC puede manipularse mediante varias técnicas que permiten determinar el papel de las moléculas individuales en el desarrollo. Una dificultad es que la expresión de genes específicos a menudo tiene diferentes efectos fenotípicos dependiendo de su expresión temporal. Este problema puede evitarse mediante la generación de ESCs que expresan induciblemente un gen de interés utilizando tecnología como el sistema transgénico inducible por doxiciclina. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares inducibles es costosa y requiere mucho tiempo. Aquí se describe un método para desagregar cuerpos embrioides (EB) derivados de ESC en suspensiones de una sola célula, infectando retroviralmente las suspensiones celulares y luego reformando las EB mediante gotas colgantes. A continuación, la diferenciación aguas abajo se evalúa mediante citometría de flujo. Utilizando este protocolo, se demostró que la expresión exógena de un gen de microARN al comienzo de la diferenciación de ESC bloquea la generación de HPC. Sin embargo, cuando se expresa en células derivadas de EB después de que se produce el mesodermo naciente, el gen de microARN mejora la diferenciación hematopoyética. Este método es útil para investigar el papel de los genes después de que se deriva el tejido específico de la capa germinal.
Introducción
Las células madre embrionarias (ESC) murinas son pluripotentes, permanecen indiferenciadas y se renuevan automáticamente en presencia de la citocina Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF)1. Al retirarse el LIF, se diferenciarán espontáneamente en estructuras tridimensionales (3D) llamadas cuerpos embrioides (EB)2. La arquitectura 3D permite el desarrollo de las tres capas germinales ectodermo, endodermo y mesodermo, que luego dan lugar a tipos de tejido maduro3. Las ESCs son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular, en particular la investigación del desarrollo de células progenitoras ....
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Protocolo
1. embrioide Cuerpo (EB) Formación
- Gelatina-ADAPT CES que se han mantenido en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs). CES Passage 3 veces en 6 así placa de cultivo tisular recubiertas con gelatina al 0,1% para eliminar MEFs.
- Se cultivan las células en medio de mantenimiento con ESC LIF para mantener las células no diferenciadas (Tabla 1). Hacer seguras las células nunca exceden el 80% de confluencia. Utilice el paso bajo (10 o menos pasajes después de la eliminación de los MEF) para la diferenciación de las células.
- En el día antes de los CES se cultivan durante la diferenciación EB, el paso de las células par....
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Resultados
En estos estudios gelatinizadas RW4 (derivada de la cepa de ratón 129X1 / SvJ) CES se utilizaron. EBS se aislaron a los 3 días de la diferenciación. Para obtener los mejores resultados los OC deben estar esférica y no adherente (Figura 1A, B). Después de la espinoculación con el virus de co-expresión de la GFP marcador fluorescente junto con un gen de interés, EBS se reformó por el método de la gota colgante. EBS se reformaron con éxito a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de 2,0, 2,5 .......
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Discusión
Como se discutió anteriormente, los clones que expresan induciblemente ESC un gen de interés se pueden generar utilizando sistemas de doxiciclina, sin embargo, la generación de estas líneas es mucho tiempo y mano de obra intensiva. Descrito en este protocolo es un método para expresar un gen de interés en suspensión de células individuales preparado a partir de ESC derivado EBS. Estas células infectadas son luego reformaron en EBS en la horca caída examinar posterior diferenciación. En el ejemplo (Figura 3),
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una Beca Piloto y de Factibilidad del Centro de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana (IUSM) para la Excelencia en Hematología Molecular (NIDDK, 5P30DK090948). Se proporcionaron fondos adicionales a través de una subvención para el mejoramiento biomédico del IUSM. Nos gustaría agradecer a la Dra. Karen Cowden Dahl por comentar sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Definido) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Aminoácidos no esenciales Life | Technologies | 11140 | |
| L-Glutamina | Life Tecnologías | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Tripsina/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Tripsina/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Placas de cultivo de tejidos Falcon 6- pozo | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Placas no tratadas 6 pocillos | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Placa de Petri Falcon 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Placa de Petri Falcon 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml con tapón de filtro de células | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Resinas estériles blancas | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rata anti-ratón CD41 PE-conjugado | Biolegend | 133906 | |
| Rata anti-ratón CD117 APC/CY7-conjugado | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESC ATCC | CRL-12418 |
Referencias
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of....
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Reimpresiones y permisos
