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Artículo de método

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

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DOI:

10.3791/52022

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20 de octubre de 2014

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

En este artículo

Resumen

La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Resumen

Las células madre embrionarias (ESC) son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular. Son especialmente útiles para investigar el desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas tempranas (HPC). La expresión génica en las ESC puede manipularse mediante varias técnicas que permiten determinar el papel de las moléculas individuales en el desarrollo. Una dificultad es que la expresión de genes específicos a menudo tiene diferentes efectos fenotípicos dependiendo de su expresión temporal. Este problema puede evitarse mediante la generación de ESCs que expresan induciblemente un gen de interés utilizando tecnología como el sistema transgénico inducible por doxiciclina. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares inducibles es costosa y requiere mucho tiempo. Aquí se describe un método para desagregar cuerpos embrioides (EB) derivados de ESC en suspensiones de una sola célula, infectando retroviralmente las suspensiones celulares y luego reformando las EB mediante gotas colgantes. A continuación, la diferenciación aguas abajo se evalúa mediante citometría de flujo. Utilizando este protocolo, se demostró que la expresión exógena de un gen de microARN al comienzo de la diferenciación de ESC bloquea la generación de HPC. Sin embargo, cuando se expresa en células derivadas de EB después de que se produce el mesodermo naciente, el gen de microARN mejora la diferenciación hematopoyética. Este método es útil para investigar el papel de los genes después de que se deriva el tejido específico de la capa germinal.

Introducción

Las células madre embrionarias (ESC) murinas son pluripotentes, permanecen indiferenciadas y se renuevan automáticamente en presencia de la citocina Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF)1. Al retirarse el LIF, se diferenciarán espontáneamente en estructuras tridimensionales (3D) llamadas cuerpos embrioides (EB)2. La arquitectura 3D permite el desarrollo de las tres capas germinales ectodermo, endodermo y mesodermo, que luego dan lugar a tipos de tejido maduro3. Las ESCs son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular, en particular la investigación del desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas tempranas (HPCs)4.

La expresión génica en las ESCs puede ser manipulada por varias técnicas que permiten determinar el papel de las moléculas individuales en el desarrollo. Una de las técnicas más comunes es el uso de la recombinación homóloga para generar líneas ESC, que carecen de un gen de interés5,6. También hay una serie de técnicas que se han utilizado para sobreexpresar genes. La primera técnica utilizada para modificar la expresión génica en las ESC fue infectarlas con retrovirus recombinantes7,8. Sin embargo, el gen de interés a menudo se silencia a medida que las ESC se diferencian en tipos de células progenitoras y maduras. El uso de lentivirus ha tenido éxito en limitar el silenciamiento de los genes viralmente expresados9. Otros vectores virales utilizados para la sobreexpresión incluyen el adenovirus y el virus adenoasociado10. Además, las técnicas de transfección estándar para introducir plásmidos de expresión de manera estable son ampliamente utilizadas para la expresión de transgenes ESC11. Una dificultad con estos sistemas es que a menudo la expresión de un gen específico tiene diferentes efectos dependiendo de su expresión temporal. Por ejemplo, la proteína Smad1 afecta el desarrollo de las células hematopoyéticas de manera diferente durante las diferentes etapas del desarrollo de la EB12,13.

Este problema puede evitarse mediante la generación de ESCs que expresan induciblemente un gen de interés. El sistema más común para expresar transgenes de forma inducible en ESCs utiliza el operón de resistencia a la tetraciclina de E. Coli (Escherichia coli). Se han desarrollado varios sistemas diferentes de tetraciclinas. Una de las estrategias más populares fue desarrollada por Kyba y colaboradores14. Generaron una línea ESC (Ainv15), que tiene el gen transactivador de tetraciclina inversa insertado en el locus ROSA26 constitutivamente activo. Se introdujeron un elemento de respuesta a tetraciclina (TRE), un sitio LoxP aguas abajo (locus de X-over P1 del bacteriófago P1) y un casete de neomicina sin promotor en el locus HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa) en el cromosoma X. Utilizando un enfoque de recombinación de CRE, se puede insertar en el sitio LoxP un gen de interés, junto con un promotor eucariota para impulsar la expresión del gen de resistencia a la neomicina. Los ESC correctamente dirigidos se aíslan mediante la selección G418. A continuación, estos clones específicos deben someterse a pruebas para determinar la expresión inducible del transgén mediante doxiciclina (o tetraciclina). Este enfoque ha generado con éxito líneas ESC que expresan induciblemente HoxB4, Stat5, SCL y Smad714-17. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares inducibles lleva mucho tiempo. Aquí se describe un método para desagregar los cuerpos embrioides (EB) derivados de ESC en suspensiones de una sola célula, infectar retroviralmente las suspensiones celulares en diferentes días de desarrollo y luego reformar las EB colgándolas. La diferenciación aguas abajo se evalúa posteriormente mediante citometría de flujo. En este artículo se muestra un ejemplo de cómo la expresión de miRNA en células derivadas de EB afecta a la diferenciación hematopoyética. Este método es útil para investigar el papel de los genes después de que se deriva el tejido específico de la capa germinal.

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Protocolo

1. embrioide Cuerpo (EB) Formación

  1. Gelatina-ADAPT CES que se han mantenido en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs). CES Passage 3 veces en 6 así placa de cultivo tisular recubiertas con gelatina al 0,1% para eliminar MEFs.
    1. Se cultivan las células en medio de mantenimiento con ESC LIF para mantener las células no diferenciadas (Tabla 1). Hacer seguras las células nunca exceden el 80% de confluencia. Utilice el paso bajo (10 o menos pasajes después de la eliminación de los MEF) para la diferenciación de las células.
  2. En el día antes de los CES se cultivan durante la diferenciación EB, el paso de las células para que sean aproximadamente 50-70% de confluencia el día siguiente. Continuar el cultivo de células en un medio de mantenimiento ESC para mantener la pluripotencia celular.
  3. En el día de la diferenciación, los medios de mantenimiento aspirado de ESC y se lava con 1 ml de tampón fosfato salino (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, y 11,9 mM de tampón de fosfato, pH 7,4) por pocillo de una placa de 6 pocillos.
    1. Añadir 200 l de 0,25% trypsen / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
    2. Inactivar la tripsina / EDTA, con 800 l de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo en un 2 ml pipeta serológica con una punta de p200 a ruptura de las células en una suspensión de células individuales. Asegúrese de que la punta p200 encaje perfectamente en el extremo para medios de comunicación no suben entre la pipeta y la interfaz de punta.
    3. Pipet arriba y abajo aproximadamente 5-10 veces. Tenga cuidado de no crear burbujas durante el pipeteado.
  4. Células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Abra el volumen a 10 ml con PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Aspirar el sobrenadante. Lavar dos veces con 5 ml de PBS para eliminar residuos de medios que contienen LIF. Centrifugar como en el paso 1.4 para cada lavado.
    1. Resuspender el sedimento celular final en 2 ml de medio de diferenciación (Tabla 2).
  6. Contar las células con un hemocitómetro o contador de células y la placa 6.000-10.000 células / ml en una placa de Petri de 10 cm(Cultura no tejido tratado).
    1. Determinar las exactas células / ml empíricamente para cada línea de ESC. Utilice placas de Petri estériles normalmente utilizados para el trabajo bacteriana o placas de baja adherencia.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados de la diferenciación, los EBS deben formar esferas que permanecen en suspensión sin conectar a la placa. Pruebe varias marcas de placas para encontrar que tienen la menor adherencia.
    2. Incubar los CES diferenciadores en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5% de CO 2.
Reactivo Stock Concentración final Volumen Empresa Número de catálogo
DMEM 1x 410 ml S igma / Aldrich D5796
FBS (ES apantallado) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Los ácidos no esenciales Amino 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamina 100x 1x 5 ml Life Technologies 35050
Penncillin / estreptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanol 14,3 M 114 M 4 l Sigma / Aldrich M3148
Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) 10 7 unidades / ml 1000 unidades / ml 50 l Millipore ESG1107
ontenido "> Tabla 1: ESC Mantenimiento Media.

Reactivo Stock Concentración final Volumen Empresa Número de catálogo
DMEM 1x 410 ml Sigma / Aldrich D5796
FBS (User Proyectado para la diferenciación óptima) 100% 15% 75 ml Hyclone SH30070.03E
Los ácidos no esenciales Amino 100x 1x 5 ml Life Technologies 11140
L-Glutamina 100x 1x 5 ml Vida Technologías 35050
Penncillin / estreptomicina 100x 1x 5 ml Life Technologies 15070
β-mercaptoetanol 14,3 M 114 M 4 l Sigma / Aldrich M3148

Tabla 2: Diferenciación Media.

2. preparar células EB para la infección del Virus

  1. En la fase de desarrollo deseado (entre el día 2 y el día 3), transferir los EBS de la placa de 10 cm Petri a 15 ml tubo cónico. Lavar la placa con 5 ml de PBS y añadir el lavado al tubo cónico.
  2. Sedimentar las EBS a 315 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Lávese las EB células con 5 ml de PBS.
  3. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular descongelado (proteolítica que contiene enzimas y colagenolíticas) y colocar los tubos en un baño de agua a 37 ° C (o incubadora) durante 30 minutos con occagitación asional (de parpadeo o la luz agitación).
  4. Añadir 1 ml de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 2 ml con una punta de pipeta p200. Se coloca el tubo en el baño a 37 ° C de nuevo por 30-60 min.
  5. Centrifugar las células a 315 xg durante 5 min y se lavan las células con PBS.

Infección 3. Virus

  1. Resuspender las células en 1,5 ml de medio de diferenciación. Transferir la suspensión celular a una placa de cultivo no tisular de 6 pocillos tratada.
  2. Preparar el retrovirus mediante técnicas estándar de anticipación. Añadir 5 a 100 l de sobrenadante viral a las células en función de la titulación viral. No agregue polibrene para mejorar la infección, ya que inhibe la posterior reforma de EBS.
  3. Spinoculate las células con virus por centrifugación a 2120 xg durante 90 min a temperatura ambiente.

4. Diferenciar virales EB células infectadas en gotas colgantes

  1. Añadir 2 ml de medio de diferenciación a cada pocillo de infected EB suspensión celular.
  2. Pipetear 3,5 ml de suspensión celular infectado EB en un depósito de reactivo estéril para multipipettors. Utilice la multipipettor pipetear 15-20 filas de ocho 20 l cae sobre la tapa invertida de la placa de Petri de 15 cm.
  3. Añadir 10 ml de PBS estéril o agua a la mitad inferior de la placa de Petri. Luego invierta la tapa con las gotas y el lugar en la placa de Petri. Asegúrese de que los cuelguen gotas boca abajo de la tapa con PBS o agua por debajo para mantener la cámara húmeda.
  4. Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5,0% de CO 2.
  5. Después de 2 días, recoger EBS formados en el ahorcamiento gotas por invertir la tapa y el lavado con 4,5 ml de medio de diferenciación.
    1. Medios de transferencia y EB a una nueva cultura de 10 cm no tejido placa Petri. Lavar la tapa una vez más con 3 ml de medio de diferenciación y la transferencia a la placa de 10 cm.
  6. Cosecha células para el análisis por citometría de flujo después de un total de 8días de cultivo a partir de la transferencia inicial de las células a medio de diferenciación (-LIF).

5. células Preparación para el Análisis citómetro de flujo

  1. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta de 10 ml. Lavar la placa con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo cónico.
  2. Células de pellets a 315 x g. Lavar pellets con 10 ml de PBS.
  3. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células descongeladas y se colocan los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min con agitación ocasional. Para la detección de algunos antígenos de la superficie celular, la tripsina puede usarse en su lugar.
  4. Añadir 1 ml de medio de diferenciación y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 2 ml. Utilice una punta de p200 a la final de la pipeta para ayudar a romper-up digiere EB en suspensión de células individuales.
    1. Se coloca el tubo en un baño a 37 ° C de nuevo durante 60 minutos para que las proteínas integrales de membrana para reciclar a la superficie celular.
  5. Pellet células a 315 xg durante 5 min.
  6. Lave el wi célulasº 0,1% albúmina de suero bovino fracción V (BSA) preparado en PBS (PBS / BSA) y se incuban las células con anticuerpos específicos marcados con fluorescencia.

6. Flow Analysis Citometría de Progenitores Hematopoyéticas

  1. Coloque 10 6 células EB derivados en un 5 ml 12 x 75 mm ronda tubo inferior. Para ajustar la compensación de citómetro de flujo, utilizar cuentas de compensación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Células de pellets a 315 x g. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en solución de PBS / BSA residual en el tubo.
  3. Para la detección de ESC HPC, incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia: anti-ratón CD41-PE (R-ficoeritrina) y anti-CD117 de ratón (cKit) -APC / CY7 (aloficocianina Cyanine 7).
    1. Diluir los anticuerpos 1: 100 en PBS / BSA. Añadir 100 l de anticuerpo diluido a cada muestra. Determinar la correcta dilución de anticuerpo para cada proveedor, clon, y mucho o anticuerpo. Determinar dilución óptima para el etiquetado de las células individualmente.
  4. Incubar las muestras en hielo en la oscuridad durante 30 min.
  5. Añadir 2 ml de células PBS / BSA y pellets a 315 g durante 5 min.
  6. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 300 l de PBS u otro tampón isotónico.
  7. Filtro resuspendieron las células a través de una tapa de filtro de células (0,35 M) para eliminar grandes agregados de células.
  8. Analice las células en un citómetro de flujo.

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Resultados

En estos estudios gelatinizadas RW4 (derivada de la cepa de ratón 129X1 / SvJ) CES se utilizaron. EBS se aislaron a los 3 días de la diferenciación. Para obtener los mejores resultados los OC deben estar esférica y no adherente (Figura 1A, B). Después de la espinoculación con el virus de co-expresión de la GFP marcador fluorescente junto con un gen de interés, EBS se reformó por el método de la gota colgante. EBS se reformaron con éxito a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de 2,0, 2,5 ...

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Discusión

Como se discutió anteriormente, los clones que expresan induciblemente ESC un gen de interés se pueden generar utilizando sistemas de doxiciclina, sin embargo, la generación de estas líneas es mucho tiempo y mano de obra intensiva. Descrito en este protocolo es un método para expresar un gen de interés en suspensión de células individuales preparado a partir de ESC derivado EBS. Estas células infectadas son luego reformaron en EBS en la horca caída examinar posterior diferenciación. En el ejemplo (Figura 3),

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una Beca Piloto y de Factibilidad del Centro de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana (IUSM) para la Excelencia en Hematología Molecular (NIDDK, 5P30DK090948). Se proporcionaron fondos adicionales a través de una subvención para el mejoramiento biomédico del IUSM. Nos gustaría agradecer a la Dra. Karen Cowden Dahl por comentar sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMSigma/AldrichD5796
β-mercaptoetanolSigma/AldrichM3148
FBS (ES Screened)HycloneSH30070.03E
FBS (Definido)HycloneSH30070.03
Aminoácidos no esenciales LifeTechnologies11140
L-GlutaminaLife Tecnologías35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Tripsina/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Tripsina/EDTALife Technologies25200
Placas de cultivo de tejidos Falcon 6- pozoFisher Scientific08-772-1B
Falcon Placas no tratadas 6 pocillosFisher Scientific08-772-49
Placa de Petri Falcon 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Placa de Petri Falcon 15 cmFisher Scientific08-757-148
Falcon Tube 5 mlFisher Scientific14-959-11A
Falcon Tube 5 ml con tapón de filtro de célulasFisher Scientific08-771-23
Resinas estériles blancasU.S.A. Scientific111-0700
Rata anti-ratón CD41 PE-conjugadoBiolegend133906
Rata anti-ratón CD117 APC/CY7-conjugadoBiolegend105826
RW4 ESC ATCCCRL-12418

Referencias

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