El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

Resumen

Se presenta un protocolo para cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales, que permite reproducir muchos aspectos de la lesión cerebral isquémica. Al estudiar los cambios en la neurovasculatura además de los cambios en las neuronas, este protocolo es una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión.

Resumen

La lesión cerebral isquémica es una de las afecciones más comunes y devastadoras que compromete la función cerebral adecuada y, a menudo, conduce a déficits funcionales persistentes en los pacientes afectados. A pesar de los intensos esfuerzos de investigación, todavía no existe una opción de tratamiento eficaz disponible que reduzca la lesión neuronal y proteja las neuronas de las áreas isquémicas de la muerte secundaria tardía. La investigación en esta área suele implicar el uso de modelos animales elaborados y problemáticos. Los cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales desafiados con privación de oxígeno y glucosa (OGD) se establecen modelos in vitro que imitan la isquemia cerebral. El aspecto novedoso de este estudio es que se estudian los cambios en los vasos sanguíneos cerebrales además de los cambios neuronales y se puede comparar y correlacionar la reacción tanto del compartimento neuronal como del compartimento vascular. Los métodos presentados en este protocolo amplían sustancialmente las aplicaciones potenciales del enfoque de cultivo de cortes organotípicos. La inducción de OGD o hipoxia por sí sola puede aplicarse por medios bastante sencillos en cultivos de cortes organotípicos y conduce a un daño fiable y reproducible en el tejido neural. Esto contrasta con los complicados y problemáticos experimentos con animales que inducen accidentes cerebrovasculares e isquemia in vivo. Al ampliar el análisis para incluir el estudio de la reacción de la vasculatura, se podrían proporcionar nuevas formas de preservar y restaurar las funciones cerebrales. El enfoque de cultivo en cortes presentado aquí podría convertirse en una herramienta atractiva e importante para el estudio de la lesión cerebral isquémica y podría ser útil para probar posibles medidas terapéuticas dirigidas a la neuroprotección.

Introducción

El sistema nervioso central es particularmente sensible a la pérdida o reducción del suministro de oxígeno y glucosa por parte de la vasculatura. Incluso una interrupción bastante breve del suministro de sangre al cerebro puede inducir una pérdida permanente de la función de las áreas cerebrales relevantes, lo que conduce a los síndromes típicos de accidente cerebrovascular. Además de la pérdida neuronal en las áreas primarias afectadas, generalmente hay una pérdida neuronal tardía adicional a través del daño secundario. Desafortunadamente, hasta ahora no se disponía de un tratamiento neuroprotector para la reducción de la muerte neuronal secundaria¹. Los esfuerzos de investigación para estudiar los mecanismos del daño secundario se basan en el uso de modelos animales de isquemia cerebral como la oclusión de la arteria cerebral media y varias técnicas de oclusión trombótica (para una revisión reciente, ver²). Paralelamente, también debido a las limitaciones y preocupaciones éticas con el uso de modelos animales, se ha utilizado el cultivo de cortes organotípicos de varios tejidos del SNC que permiten el estudio de las reacciones neuronales a diversos tipos de lesiones^3-5.

Para estudiar la reacción neuronal en condiciones que imitan la lesión cerebral isquémica, se ha desarrollado el sistema modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD). En este modelo, los cultivos en rodajas se exponen temporalmente a un medio que carece de glucosa y que se ha equilibrado con nitrógeno gaseoso en ausencia de oxígeno. Con este tratamiento, es posible inducir una lesión y pérdida neuronal bastante similar a la observada después de una lesión isquémica in vivo^{6, 7}. En el hipocampo, este tratamiento induce una pérdida neuronal específicamente en el CA1, pero no en el área CA3 ni en el giro dentado del hipocampo. Por el contrario, el estudio de las reacciones vasculares en los cultivos de cortes hasta ahora no se ha llevado a cabo de manera generalizada. Una razón obvia es la falta de circulación y perfusión de los vasos sanguíneos en el modelo de cultivo en cortes. Sin embargo, hemos demostrado previamente que es posible mantener los vasos sanguíneos en cultivos de corte del SNC durante varios días^{8, 9}.

El objetivo general de este método es no solo monitorear el destino de las neuronas después de la OGD, sino también extender el estudio al destino y la remodelación de la vasculatura, que es una parte importante de la respuesta a la lesión. Hasta ahora, estos estudios han requerido el uso de experimentos con animales (De Jong et al., 1999; Cavaglia et al., 2001). En el protocolo que aquí se presenta, detallaremos cómo se pueden realizar estos estudios en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales desafiados con hipoxia o por lesiones excitotóxicas, seguidos de un análisis de la supervivencia neuronal y de las reacciones de los vasos sanguíneos. Este protocolo se basa en un estudio publicado previamente sobre este tema¹⁰ y puede ser útil para cualquier laboratorio interesado en las interacciones neurovasculares en el SNC.

Protocolo

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas del 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas.

1. Configuración de cultivos organotípicos de cortes entorinino-hipocampos

1. Preparar cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales (EHOSC) a partir de crías de ratón del día postnatal 4 (P4) utilizando el método de incubación estática^4,11. En este caso, utilice ratones C57Bl6 y CB6F1.
   1. Tome aproximadamente 30 minutos por cachorro de ratón para la preparación de los cultivos en rodajas, es decir, 3 horas para una camada de 6 cachorros de ratón. Lleve a cabo todos los pasos en condiciones estériles en un banco de trabajo de flujo laminar con instrumentos quirúrgicos esterilizados.
   2. Para evitar una posible interferencia de la posición de la rebanada a lo largo del eje septo-temporal, utilice únicamente rebanadas del hipocampo de la mitad septal. Si no se indica lo contrario, lleve a cabo todos los pasos en RT.
2. Corta la cabeza de un cachorro de ratón P4 con unas tijeras quirúrgicas. No se requiere anestesia para este paso.
   1. Extirpa el cráneo alrededor del cerebro e identifica la fisura entre el extremo caudal de los hemisferios cerebrales y el mesencéfalo. Retire con cuidado la parte del cerebro rostral al mesencéfalo del cráneo y colóquelo en un medio de preparación helado que consista en MEM suplementado con una forma estabilizada de L-glutamina.
3. Continúe la disección bajo un microscopio estereoscópico con el cerebro sumergido en el medio de preparación helado. Extirpa las meninges restantes de los hemisferios corticales. Identificar el hipocampo en la superficie caudal medial del hemisferio y separarlo junto con la corteza entorrinal adyacente del resto del cerebro.
   1. Transfiera el tejido a una picadora de tejidos y corte en rodajas de 400 μm de espesor en condiciones asépticas transversales al eje septotemporal del hipocampo.
4. Colocar los rodajas en insertos de cultivo celular (aproximadamente 6 rodajas por inserto) e incubarlas en placas de 6 pocillos con 1 ml por pocillo de medio de incubación (47 ml de MEM, 25 ml de Eagle Medium, 25 ml de suero de caballo, 1 ml de glutamax I, 1 ml de una solución estéril de glucosa al 10%, pH 7,3) en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días hasta 1 semana.

2. Hipoxia in vitro y privación de oxígeno-glucosa con reperfusión

1. Consulte la Tabla 1 para obtener un cronograma exacto del procedimiento. Cultive EHOSC durante 5 días (DIV5) antes de la exposición a hipoxia o OGD. En este momento, cambie el medio de un medio de incubación que contiene un 25% de suero de caballo a un medio libre de suero con la siguiente composición: Medio neurobasal con un 2% de suplemento de B27, un 1% de glutamax y un 0,1% de glucosa adicional.
2. Prepare el medio OGD como se detalla en la Referencia 7 . Las concentraciones finales de los componentes serán las siguientes: 0,3 mM CaCl₂, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO₃, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄ y 10 mM sacarosa a pH 6,8. Agregue 1 ml de medio OGD a cada pocillo de dos placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
   1. Perfundir el medio OGD con N₂ durante 1 hora en una cámara de hipoxia y luego sellar y mantener O/N en una incubadora a 37 °C.
   2. Utilice tiras anaeróbicas como indicadores hipóxicos. Considere que el medio está libre de oxígeno cuando el color de las tiras cambió de rosa a blanco.
   3. Para la inducción de la hipoxia, use medio libre de suero con glucosa en lugar de medio OGD. Antes de usar, perfunda el medio con N₂ en una cámara de hipoxia como se detalla anteriormente para el medio OGD.
3. Antes de que las rodajas se expongan a la OGD, vuelva a perfundir el medio OGD con N₂ durante 30 min. Añada 2 μl de una solución de yoduro de propidio (PI) de 1 mg/ml por pocillo (para una concentración final de 2 μg/ml) a las rodajas durante 30 min y seleccione solo las rodajas sanas para la experimentación, según lo indicado por el bajo número de células PI positivas.
4. Utilice el programa de exposición y reperfusión de OGD indicado en la Figura 1. Prive a los cortes de solo oxígeno (hipoxia) o de oxígeno y glucosa (OGD) durante 15 minutos.
   1. Para la inducción de hipoxia o OGD, transfiera los cortes al medio OGD y manténgalos durante 15 minutos en la cámara de hipoxia. Asegúrese de que todos los fluidos que quedan en los lados del inserto se aspiren cuando los cultivos se cambien de medio regular a medio OGD y viceversa.
   2. Después de hipoxia o OGD, se reemplace el medio OGD con medio libre de suero oxigenado y se permite que los cultivos se recuperen durante 3, 24 o 48 horas en medio libre de suero en la incubadora regular a 37 °C con 5% de CO₂. Añadir PI de nuevo antes de la fijación para la determinación de la muerte celular.

3. Tratamientos farmacológicos de cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

1. Cultivo de EHOSCs durante 5 días (DIV5) en medio de incubación antes de la exposición a tratamientos farmacológicos. Iniciar los tratamientos farmacológicos durante la OGD o inmediatamente después de la OGD cuando los cortes se transfieren a un medio libre de suero.
2. Tratamientos para la protección contra la OGD.
   1. Añadir 100 μM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) o 1 μM de tetrodotoxina (TTX) al medio de cultivo durante la inducción de OGD (durante 15 min) o inmediatamente después de la inducción de OGD durante 30 min. A continuación, incubar en medio libre de suero normóxico durante 48 horas antes de la fijación.
3. Tratamientos para la inducción de la muerte excitotóxica.
   1. Después de 5 días en medio de incubación, cambie los cultivos a un medio libre de suero que contenga 100 μM (RS)-α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) durante 30 min.
   2. Retire el medio de cultivo que contiene AMPA por aspiración (tenga cuidado de eliminar cualquier medio residual en los insertos), luego transfiera las rodajas a placas frescas con medio libre de suero normal y manténgalas durante 48 horas hasta la fijación.

4. Fijación e inmunotinción de cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

1. Tinción con yoduro de propidio (PI).
   1. Añada PI durante 30 min al medio de cultivo de rodajas vivas a una concentración de 2 μg/ml. Observe los cultivos vivos con un microscopio invertido equipado con óptica de fluorescencia y seleccione las rodajas para tratamientos posteriores. Para la tinción de PI en combinación con inmunohistoquímica, agregue la solución de PI 30 min antes de la fijación de los cultivos.
2. Fijación de las lonchas.
   1. Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos y agregue 3 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparado a cada pocillo. A continuación, coloque la placa de 6 pocillos en un frigorífico y fije el O/N a 4 °C.
   2. Retire la solución de PFA al día siguiente y lave las rodajas 3-4 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Extracción de los cortes del inserto de cultivo celular y procedimiento de bloqueo para la inmunohistoquímica de secciones flotantes.
   1. Separe y retire con cuidado las rodajas de los insertos de cultivo con un pincel artístico del tamaño 0 o menor. Transfiera cada rebanada individual a un pocillo de una placa de 96 pocillos llena de tampón de bloqueo (PBS con 3% de suero de cabra normal (NGS) y 2% de Triton-X100). Mantenga las lonchas en el tampón de bloqueo durante 2 horas a RT bajo agitación constante por un agitador orbital.
4. Inmunotinción de los cultivos en rodajas
   1. Para el marcaje de los vasos sanguíneos, utilice antilaminina policlonal a una dilución de 1:200 en PBS, que contenga 1% de NGS y 0,5% de Triton-X100.
   2. Para el marcaje de las neuronas, utilice la proteína 2 asociada a los antimicrotúbulos (MAP2) en una dilución de 1:500 en PBS, que contiene un 1% de NGS y un 0,5% de Triton-X100.
   3. Incubar las rodajas con anticuerpos primarios durante 48 h a 4 °C con agitación constante. Después del período de incubación, lávelos en PBS con Triton-X100 al 0,5% durante 3-4 veces.
   4. Diluir anticuerpos secundarios 1:500 en PBS que contengan 1% de NGS y 0,5% de Triton-X100. Incube las rodajas durante 2 horas en RT en la oscuridad con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos Alexa. Utilice el anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón de cabra adecuado conjugado con Alexa 350 o 488.
   5. Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave las rodajas tres veces con solución salina tamponada Tris (TBS); móntelas en portaobjetos de vidrio y cubra los portaobjetos con Mowiol.
5. Microscopía de los cortes teñidos
6. Vea los cortes teñidos en un microscopio estándar con equipo de epifluorescencia o con un microscopio confocal. Tome imágenes con una cámara adecuada. Para algunas imágenes, invierta el contraste de fluorescencia para producir vasos teñidos de oscuridad sobre un fondo brillante (Figuras 5 y 6).

5. Determinación de la densidad regional de vasos en los cultivos

1. Cuantifique la densidad de buques en función de los cruces de buques como se describe en la Referencia 8.
2. Use rodajas teñidas para laminina para estas mediciones. Superponga imágenes grabadas con un aumento de 10X con una cuadrícula de 6 x 6, donde cada cuadrícula es igual a 100 x 100 μm por cuadrado, campo total de 0,25 mm².
3. Superponga tres de estas cuadrículas en la región CA1, CA3, DG y EC (Figura 2). Cuente los vasos que cruzan las líneas de la cuadrícula.
4. Para obtener resultados con una buena relevancia estadística, realice mediciones en al menos 3 experimentos independientes, cada uno de los cuales incluya datos de 3 cachorros de ratón con 3 cortes por cachorro de ratón.
5. Determinar el valor promedio de los cruces de buques a partir de las cuadrículas para cada región y realizar un análisis estadístico por ANOVA con corrección de Bonferroni como prueba post hoc (p<0.05 definida como significativa) utilizando un software estadístico adecuado.

Resultados

La privación de oxígeno y glucosa y la hipoxia inducen la muerte neuronal y la reducción de vasos sanguíneos específicamente en la región CA1 del hipocampo.
La privación de oxígeno y glucosa (OGD) o la falta de oxígeno por sí sola durante 15 minutos indujo una marcada muerte celular, evidenciada mediante tinción con yoduro de propidio, específicamente en el área CA1 del hipocampo (Figura 3), de manera similar a lo descrito previamente⁷. Al utilizar marcadores para visualizar la re...

Discusión

Con los métodos presentados aquí, los cultivos de cortes organotípicos del hipocampo se pueden utilizar como una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión. Si bien los cultivos de cortes organotípicos se han utilizado en el pasado para estudiar las reacciones neuronales después de la isquemia^{6, 7} , el nuevo aspecto del estudio simultáneo de los cambios vasculares mejora significativamente las aplicaciones potenciales de este método. La inducción de OGD o...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio esencial mínimo MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	forma estabilizada de L-glutamina
Insertos de cultivo celular	Millicell Millipore	PICM03050
Medio basal Eagle	Gibco	41010-026
Suero para caballos	Gibco	26050-088
Medio neurobasal	Gibco	21103-049
B27 suplemento	Gibco	17504-044
Tiras anaeróbicas	Sigma-Aldrich	59886
Solución de yoduro de propidio	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R& Sistemas D	0169-10
CNQX	R& Sistemas D	0190/10
TTX	R& D systems	1078/1
antilaminina policlonal	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-ratón 350	Sondas moleculares	A11045
Alexa anti-ratón 488	Sondas moleculares	A11001
Alexa anti-conejo 350	Sondas moleculares	A11046
Alexa anti-conejo 488	Sondas moleculares	A11008
Software estadístico	GraphPad Software	GraphPad Prisma
McIlwain picadora de tejidos	Ted Pella	10180
Cámara de hipoxia	Billups-Rothenberg	MIC-101