Se presenta un protocolo para cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales, que permite reproducir muchos aspectos de la lesión cerebral isquémica. Al estudiar los cambios en la neurovasculatura además de los cambios en las neuronas, este protocolo es una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión.
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Artículo de método
El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales
En este artículo
Resumen
Resumen
La lesión cerebral isquémica es una de las afecciones más comunes y devastadoras que compromete la función cerebral adecuada y, a menudo, conduce a déficits funcionales persistentes en los pacientes afectados. A pesar de los intensos esfuerzos de investigación, todavía no existe una opción de tratamiento eficaz disponible que reduzca la lesión neuronal y proteja las neuronas de las áreas isquémicas de la muerte secundaria tardía. La investigación en esta área suele implicar el uso de modelos animales elaborados y problemáticos. Los cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales desafiados con privación de oxígeno y glucosa (OGD) se establecen modelos in vitro que imitan la isquemia cerebral. El aspecto novedoso de este estudio es que se estudian los cambios en los vasos sanguíneos cerebrales además de los cambios neuronales y se puede comparar y correlacionar la reacción tanto del compartimento neuronal como del compartimento vascular. Los métodos presentados en este protocolo amplían sustancialmente las aplicaciones potenciales del enfoque de cultivo de cortes organotípicos. La inducción de OGD o hipoxia por sí sola puede aplicarse por medios bastante sencillos en cultivos de cortes organotípicos y conduce a un daño fiable y reproducible en el tejido neural. Esto contrasta con los complicados y problemáticos experimentos con animales que inducen accidentes cerebrovasculares e isquemia in vivo. Al ampliar el análisis para incluir el estudio de la reacción de la vasculatura, se podrían proporcionar nuevas formas de preservar y restaurar las funciones cerebrales. El enfoque de cultivo en cortes presentado aquí podría convertirse en una herramienta atractiva e importante para el estudio de la lesión cerebral isquémica y podría ser útil para probar posibles medidas terapéuticas dirigidas a la neuroprotección.
Introducción
El sistema nervioso central es particularmente sensible a la pérdida o reducción del suministro de oxígeno y glucosa por parte de la vasculatura. Incluso una interrupción bastante breve del suministro de sangre al cerebro puede inducir una pérdida permanente de la función de las áreas cerebrales relevantes, lo que conduce a los síndromes típicos de accidente cerebrovascular. Además de la pérdida neuronal en las áreas primarias afectadas, generalmente hay una pérdida neuronal tardía adicional a través del daño secundario. Desafortunadamente, hasta ahora no se disponía de un tratamiento neuroprotector para la reducción de la muerte neuronal secundaria1. Los e....
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Protocolo
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas del 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas.
1. Configuración de cultivos organotípicos de cortes entorinino-hipocampos
- Preparar cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales (EHOSC) a partir de crías de ratón del día postnatal 4 (P4) utilizando el método de incubación estática4,11. En este caso, utilice ratones C57Bl6 y CB6F1.
- Tome aproximadamente 30 minutos por cachorro de ratón para la preparación de los cultivos en roda....
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Resultados
La privación de oxígeno y glucosa y la hipoxia inducen la muerte neuronal y la reducción de vasos sanguíneos específicamente en la región CA1 del hipocampo.
La privación de oxígeno y glucosa (OGD) o la falta de oxígeno por sí sola durante 15 minutos indujo una marcada muerte celular, evidenciada mediante tinción con yoduro de propidio, específicamente en el área CA1 del hipocampo (Figura 3), de manera similar a lo descrito previamente7. Al utilizar marcadores para visualizar la re.......
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Discusión
Con los métodos presentados aquí, los cultivos de cortes organotípicos del hipocampo se pueden utilizar como una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión. Si bien los cultivos de cortes organotípicos se han utilizado en el pasado para estudiar las reacciones neuronales después de la isquemia6, 7 , el nuevo aspecto del estudio simultáneo de los cambios vasculares mejora significativamente las aplicaciones potenciales de este método. La inducción de OGD o.......
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Divulgaciones
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas. Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Basilea, Departamento de Biomedicina, y la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (31003A_141007). Markus Saxer proporcionó soporte técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio esencial mínimo MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | forma estabilizada de L-glutamina |
| Insertos de cultivo celular | Millicell Millipore | PICM03050 | |
| Medio basal Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Suero para caballos | Gibco | 26050-088 | |
| Medio neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 suplemento | Gibco | 17504-044 | |
| Tiras anaeróbicas | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Solución de yoduro de propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R& Sistemas D | 0169-10 | |
| CNQX | R& Sistemas D | 0190/10 | |
| TTX | R& D systems | 1078/1 | |
| antilaminina policlonal | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-ratón 350 | Sondas moleculares | A11045 | |
| Alexa anti-ratón 488 | Sondas moleculares | A11001 | |
| Alexa anti-conejo 350 | Sondas moleculares | A11046 | |
| Alexa anti-conejo 488 | Sondas moleculares | A11008 | |
| Software estadístico | GraphPad Software | GraphPad Prisma | |
| McIlwain picadora de tejidos | Ted Pella | 10180 | |
| Cámara de hipoxia | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
Referencias
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M.
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Reimpresiones y permisos
