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Artículo de método

Expresión de proteínas fluorescentes en Lanceolatum Branchiostoma Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

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DOI:

10.3791/52042

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12 de enero de 2015

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1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

En este artículo

Resumen

Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.

Resumen

Presentamos aquí un protocolo robusto y eficiente para la expresión de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en ovocitos no fertilizados del anfioxo cefalocordado, Branchiostoma lanceolatum. Utilizamos construcciones para membrana y nuclear dirigida a mCherry y eGFP que han sido modificadas para acomodar el uso de codones de anfioxo y secuencias de consenso de Kozak. Describimos el tipo de agujas de inyección que se utilizarán, el protocolo de inmovilización de los ovocitos no fecundados y la configuración general de la inyección. Esta técnica genera embriones marcados con fluorescencia, en los que la dinámica de los comportamientos celulares durante el desarrollo temprano se puede analizar utilizando las últimas estrategias de imagen in vivo. El desarrollo de una técnica de microinyección en esta especie de anfioxo permitirá análisis de imágenes en vivo de los comportamientos celulares en el embrión, así como manipulaciones específicas de genes, incluida la sobreexpresión y el derribo de genes. En conjunto, este protocolo consolidará aún más al anfioxo cordado basal como un modelo animal para abordar cuestiones relacionadas con los mecanismos del desarrollo embrionario y, lo que es más importante, con su evolución.

Introducción

Durante el desarrollo, una sola célula da lugar a un organismo entero en un proceso altamente complejo que implica tanto las divisiones celulares y movimientos. Para entender mejor los principios biológicos que subyacen a la dinámica del comportamiento celular, los biólogos del desarrollo han comenzado a utilizar en las técnicas de imagen in vivo basado en la fluorescencia. Compartimentos específicos de células, tales como las membranas celulares, o bien pueden ser etiquetados por los tratamientos con colorantes fluorescentes, un enfoque obstaculizado por la falta de especificidad y de penetración en el tejido 1, o por la introducción específica en el embrión de mRNAs exógenos que codifican proteínas fluorescentes 2. Diferentes técnicas pueden ser utilizadas para la prestación eficiente de compuestos exógenos, tales como mRNAs. Estos incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, bombardeo con micropartículas, lipofección y la transducción de 3,4. Aunque todos estos enfoques se puede utilizar para introducir compuestos exógeno en unaembrión en desarrollo, sólo microinyección permite la aplicación de cantidades predefinidas y precisas en cada celda 3. Las técnicas de microinyección se han descrito para los principales sistemas modelo de desarrollo 4 (por ejemplo, moscas de la fruta, gusanos nematodos, pez cebra, ranas, ratones), así como para algunos modelos alternativos 4, incluyendo los utilizados para los estudios comparativos destinados a comprender la evolución de los mecanismos de desarrollo (por ejemplo, las anémonas de mar, gusanos anélidos, erizos de mar, tunicados ascidia, la amphioxus cephalochordate).

Cephalochordates, que junto con los tunicados y los vertebrados establecen filo cordados, particularmente modelos muy adecuado para estudiar la evolución de los cordados y la diversificación de los vertebrados de un antepasado de invertebrados 5-8. El linaje cephalochordate divergieron muy temprano durante la evolución cordado; y cephalochordates existentes, que se subdividen en tres géneros (Branchiostoma, Asymmetron y Epigonichthys), se asemejan a los vertebrados, tanto en términos de anatomía general y la arquitectura del genoma 5-8. De los aproximadamente 30 especies de cephalochordates que se han descrito hasta el momento, cinco son disponibles para los estudios y de desarrollo embriológico 6,9: Asymmetron lucayanum (la lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (la amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (la amphioxus Europea), Branchiostoma belcheri (el anfioxo chino) y Branchiostoma japonicum (el anfioxo japonés). Adultos maduros de tres de estas especies (B. lanceolatum, B. belcheri y B. japonicum) pueden ser inducidas a desovar en la demanda durante la temporada de cría 10,11. Además, al menos por B. lanceolatum, el desove eficiente también puede ser inducida en agua de mar artificial 12, con lo que esta especie cephalochordate particulares accesible para laborators que no tienen acceso a agua de mar natural. La combinación, en B. lanceolatum, de un acceso conveniente y confiable para los embriones con un método de entrega eficiente, tales como la microinyección, hasta ahora la única técnica de administración desarrollada en anfioxo (tanto en B. floridae y B. belcheri) 13-15, permitirá el desarrollo de un novela conjunto de técnicas de manipulación, incluyendo tracing- linaje y los enfoques basados ​​en el comportamiento de células dinámico.

Un protocolo para la microinyección eficiente de mRNAs para expresar proteínas fluorescentes en la B. lanceolatum embrión se desarrolla, por lo tanto. Además, para proporcionar un conjunto de herramientas básica para imágenes en vivo de B. embriones lanceolatum, sistemas de vectores se desarrollaron que permiten asociada a la membrana y la expresión nuclear de proteínas fluorescentes. Para la orientación de la membrana, el aumento de la proteína verde fluorescente (EGFP) se fusionó a la caja CAAX HRAS humano y la localización nuclear de mCherry y EGFP seobtenido por fusión a la exón 2B histona pez cebra (H2B) (Figura 1, Archivo 1). Además, con el objetivo de optimizar la traducción de proteínas, las secuencias Kozak y los codones de las construcciones se han modificado y adaptado para el uso en B. lanceolatum. Tomados en conjunto, los vectores de método y de expresión inyección presentados aquí servirán como base para la generación de nuevos enfoques experimentales para cephalochordates, los análisis en particular utilizando la última fluorescencia basada en técnicas de imagen in vivo.

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Protocolo

1. Elaboración de Instrumentos y Reactivos

  1. Traslado pipetas Pasteur
    1. Generar una serie de pipetas Pasteur de transferencia con diferentes diámetros de punta tirando de 230 mm de largo pipetas Pasteur por encima de una llama a diferentes velocidades. Asegúrese de que la conicidad es tan larga como sea posible para un control suave y fino de la aspiración.
    2. Con una punta trazadora de diamante, rayar la pipeta a lo largo de una línea perpendicular a la longitud de la pipeta. Con las dos manos, tire de la pipeta en paralelo a su longitud para generar un corte romo. Rápidamente llama a pulir la pipeta sin sellar la punta.
    3. Variar el diámetro de la punta con la etapa de los ovocitos / embriones que se debe verter: 300-400 micras de ovocitos no fecundados (alrededor de 150 micras de diámetro), a 600 m para los huevos fertilizados (alrededor de 500 micras de diámetro), 200-400 micras para neurulae rayada. Utilizar pipetas con un tubo de aspiración boca supervisado para transferir los ovocitos / embriones de un platoa otro.
  2. Agujas de inyección
    1. Manipular los capilares con guantes para garantizar condiciones RNasa libre. Utilice vidrio borosilicato con capilares de filamentos con dimensiones de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longitud 10 mm.
    2. Si capilares se tiran en el tipo de calentamiento de filamentos aguja extractor descrito en la Lista de materiales, utilice los siguientes ajustes: Heat 600, Pull 50, Velocidad 80, Hora 60, presión 200 o 300. De lo contrario, asegúrese de que la forma, que es crucial para inyecciones exitosas, es como se muestra en la Figura 2 con las siguientes propiedades: 4-8 m de diámetro exterior de la punta, 2 cm de longitud de forma cónica.
      NOTA: Las agujas se puede tirar antes de la temporada de desove y se utiliza durante toda la temporada.
  3. Solución de rojo fenol almacén 5% (4x)
    1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
    2. En un tubo de micras de filtración de 0,22, pesar 25 mg de polvo rojo fenol.
    3. Añadir 0,5 ml de DNasa y RNasa libre de agua parael tubo que contiene el polvo.
    4. Girando durante 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente para filtrar esterilizar la solución y eliminar cristales que puedan obstruir la aguja de inyección.
    5. Almacenar a 4 ° C o almacenar 250 ml de alícuotas a -20 ° C.
  4. 0,25 mg solución de poli lisina / ml
    1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
    2. Disolver 5 mg de poli-L-lisina en 20 ml de agua destilada. Tienda alícuotas de 5 ml a -20 ° C.
    3. Utilice una alícuota descongelada inmediatamente y sólo una vez para asegurar la adhesión reproducible y robusto de los ovocitos a el plato de poli-lisina.
  5. la síntesis de ARNm
    1. Preparar fresca antes de cada temporada de desove.
    2. Linealizar 5 g de ADN de interés con la enzima adecuada (por lo general de 2 horas, a 37 ° C). Para verificar la integridad de la digestión, ejecute un 2% en volumen de la mezcla de digestión en un gel de agarosa-TBE 1% en tampón TBE a 150 W durante 20 minutos.
    3. Se extrae la lineaADN AUTORIZADO con 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, se centrifuga 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa (superior).
    4. Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
    5. Precipitar el ADN linealizado con 100: 10: 300 DNA linealizado: acetato de sodio 3 M (pH 5,2): 100% de etanol durante la noche a -20 ° C.
    6. Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague en etanol al 70%.
    7. Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje secar y volver a suspender en agua libre de RNasa a una concentración final de 0,5 mg / l.
    8. Transcribir 1 g de ADN linealizado utilizando un kit de síntesis de ARNm con la polimerasa apropiada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    9. Extraer el ARNm con 5: 1 de fenol (pH 4,7): solución de parada cloroformo y acetato de amonio proporcionado con el kit.
    10. Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
    11. Se extrae la fase acuosa de nuevo con 24: 1 de cloroformo: alcohol isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18.000 xg y recoger la fase acuosa.
    12. Precipitar el ARNm con 100% de isopropanol durante la noche a -20 ° C.
    13. Centrifugar 20 minutos a 18.000 xg a 4 ° C. Enjuague con etanol al 80%.
    14. Centrifugar 10 minutos a 18.000 xga 4 ° C. Deje que el sedimento seco a temperatura ambiente durante no más de 5 a 10 minutos, ya que entonces será difícil para volver a suspender. Resuspender en DNasa y RNasa libre de agua a una concentración final de al menos 2 g / l para asegurar una concentración final de mRNA decente en la mezcla de inyección.
    15. Para comprobar la calidad y el tamaño del producto de transcripción, ejecute 0,5 l de la ARNm en un 1% de gel de agarosa-TBE RNasa libre en tampón TBE a 150 W durante 20 min. Tienda 2 alícuotas a -80 ° C.
  6. Platos poli-lisina
    NOTA: Poli-lisina coaplatos TED se utilizan para inmovilizar los ovocitos durante la inyección.
    1. Para cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), cubrir la parte inferior de la placa de Petri con 1 ml de la solución de poli-lisina descongelado 0,25 mg / ml. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Por cada 35 mm de cultivo celular placa de Petri (5 en total), transferir la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml en otro 35 mm de cultivo celular placa de Petri. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Deseche la solución de poli-lisina 0,25 mg / ml.
    4. Deje que los platos de Petri seca, boca abajo a temperatura ambiente durante 2 hr.
    5. Guarde los platos poli-lisina recubierto envueltas en una envoltura de plástico a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo.
  7. Platos de agarosa recubiertas de
    NOTA: Se utilizan para la cultura inyectado embriones. La agarosa proporciona un cojín para los embriones inyectados y evita que se pegue al fondo del plato.
    1. Hacer agua de mar artificial (ASW), utilizando 37 a 38 g / L commsales erciales + 0,25 mM NaHCO3 en agua de ósmosis inversa.
    2. Disolver agarosa a una concentración del 1% en 0,22 micras ASW filtrada por calentamiento de la solución en un microondas.
    3. Rápidamente se vierte la solución de agarosa caliente de una placa de Petri de 35 mm en otro a fin de garantizar un recubrimiento de agarosa muy delgada del plato.
    4. Almacenar los platos de agarosa recubiertas de envueltos en Saran Wrap a 4 ° C para evitar la contaminación durante una semana como máximo.
  8. Mezcla de inyección y la carga de las agujas de inyección
    1. Acerca de 2 hr antes de comenzar las inyecciones, hacer una mezcla de inyección de 2 l en RNasa y agua libre de DNasa con concentraciones finales de 1-1,8 g / l de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de rojo fenol.
      NOTA: Los colores rojo fenol La solución, que permite el seguimiento de la eficacia de la inyección y la identificación de los embriones inyectados con éxito. El glicerol favorece la difusión de ARNm dentro del ovocito.
    2. Centrifugar 4 min a 18.000 xg acristales de pellets. Mantener en hielo hasta su uso.
    3. Con una pipeta de 10 l, recoger 0,5 l de la mezcla de inyección, evitando la parte inferior del tubo, donde se han sedimentado los cristales.
    4. Rellene al menos dos agujas de inyección (en caso de que se rompe durante la inyección) pipeteando la caída de 0.5 l de la mezcla de inyección en la abertura grande de la aguja.
    5. Instalar las agujas en un frasco de almacenamiento de líquido en la parte inferior a 4 ° C para evitar la evaporación de la mezcla de inyección. Deje que la mezcla de inyección lentamente viajar a la punta de la aguja de inyección durante al menos 1 hr para reducir al mínimo la creación de burbujas.
    6. Tienda mezcla adicional de inyección a -80 ° C para un máximo de tres usos adicionales, después de lo cual se deteriora la calidad de ARNm (datos no mostrados).

2. Recolección de material biológico, microinyección y cultivo de embriones

  1. Ovocitos y espermatozoides colección
    NOTA: Ver Theodosiouet al., 12 para un protocolo detallado para inducir el desove, y de recogida de gametos.
    1. Machos y hembras de Choque en ASW a 23 ° C durante 24 horas.
    2. De una a dos horas antes de la puesta del sol, transferir los adultos en copas individuales en ASW a 19 ° C, ya que la mayoría de los adultos desovan 1-2 horas después de la puesta del sol.
    3. Enjuague 35 mm placas de Petri en ASW se filtró y dejar secar al revés para evitar que los ovocitos se pegue a la parte inferior del plato.
    4. Tras el desove, recoger inmediatamente los espermatozoides y ovocitos con una pipeta 1.000 l.
      1. Mantener esperma y ovocitos separada de amphioxus adulto porque el contacto es perjudicial para la salud de gametos (datos no mostrados).
      2. Además, evitar asustar a los adultos, lo que conduce a movimientos que disipan, y por lo tanto diluir, tanto esperma y ovocitos. Para mantener el esperma activo el mayor tiempo posible y para optimizar la tasa de fertilización, recoger el esperma lo más concentrada posible.
    5. Manteneresperma en hielo en un tubo de 1,5 ml.
    6. Traslado ovocitos en filtrada ASW en los 35 mm platos pre-enjuagado Petri.
    7. Transferencia 100-500 ovocitos con una anterioridad tirado 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur a otro de 35 mm placa de Petri para realizar las inyecciones.
    8. Fertilizar el resto del embrague como un control para el esperma y calidad de los ovocitos o para otros experimentos.
  2. Inyección de ovocitos
    1. Instalar la aguja de inyección en el micromanipulador en un 50 ° ángulo con respecto al plano horizontal.
      NOTA: Los ángulos de menos de 50 ° empujarán los ovocitos alrededor en el plato, mientras que los ángulos de más de 50 ° no permitirán un adecuado seguimiento de la posición de la aguja en relación con el ovocito.
    2. Bajo un microscopio de disección fluorescente con 25X oculares, transferir 30 ovocitos con el 300-400 micras transferencia pipeta Pasteur en un plato de poli-lisina que contiene filtrada ASW.
    3. Deposite los ovocitos largo de una línea para llevarinyecciones a cabo de manera ordenada y distinguir inyectados de oocitos no inyectados. Inyectar pequeños números (30 oocitos) para minimizar el tiempo de exposición de ovocitos a la poli-lisina, que tiende a deformar los embriones en desarrollo (datos no mostrados).
    4. Use la iluminación de campo oscuro para hacer que los ovocitos como translúcido posible.
    5. Con el mando de movimiento grosero del micromanipulador, llevar la aguja de inyección de cerca de un ovocito.
    6. Con unas pinzas finas, cortar y abrir la aguja en el nivel donde la punta comienza a ser curvado. Por pulsante con el inyector, compruebe que la mezcla de inyección de tinta está fluyendo en realidad fuera de la aguja.
    7. En una ampliación de 200X y con el mando de movimiento fino del micromanipulador, mover suavemente la aguja de inyección dentro del núcleo del ovocito.
      NOTA: Si se inserta demasiado superficial, la solución inyectada no va a permanecer en el interior del ovocito. Si se inserta demasiado lejos, se destruirá el ovocito.
    8. Inyectar con 1-3 pulsos de 120 ms Durationes y 1-10 psi de presión. Si la aguja está lo suficientemente fina, inyectar con flujo continuo a presión constante. Asegúrese de que el volumen de inyección corresponde a 1/5 a 1/3 del volumen de un solo ovocito.
    9. Después de la inyección, retire la aguja con rapidez para evitar la fuga de los ovocitos.
    10. Verifique que la solución inyectada permanece dentro del ovocito y que después de unos pocos segundos, la solución inyectada se extiende por todo el ovocito.
    11. Pasar a la siguiente ovocitos en línea.
    12. Mantenga algunos embriones no inyectados de cada serie como control negativo para estimar la fluorescencia de fondo durante la búsqueda de los embriones inyectados.
  3. La fertilización, selección de embriones inyectados y cultivo de embriones
    1. Fecundar los ovocitos tan pronto como se ha inyectado una serie. Dado que la calidad de los ovocitos disminuye con el tiempo, inyectar y fecundar los ovocitos dentro de 1 hora después del desove 12.
    2. Dependiendo de la concentración de espermatozoides, añadir 1-5 gotas de esperma de los ovocitos ygirar el plato.
      NOTA: El sobre fertilización debe ser evidentes en los embriones después de 1 min.
    3. Permitir a los embriones desprenden de la placa de poli-lisina, mientras se inyecta otra serie de ovocitos.
    4. La transferencia de los embriones con la transferencia de 600 micras pipeta Pasteur en un plato de Petri de agarosa-revestido. Eliminar los embriones desde el plato de poli-lisina tan pronto como sea posible, si es posible antes de la etapa de 2 células.
      NOTA: En caso de exposición prolongada a la poli-lisina, los embriones tienden a convertirse en blastulae densamente poblado-aplanada en el lado tocar el fondo del plato.
    5. En la etapa de 2 células de 4 celdas, seleccione con un microscopio de disección fluorescente con filtro DSR los embriones inyectados con éxito, es decir, los que tienen una morfología normal que exhiben una señal fluorescente de color rojo derivado de rojo fenol.
    6. Mantener los embriones en cultivo in filtrada ASW en platos de agarosa recubiertas de Petri a 19 ° C hasta que la fase deseada paraimágenes in vivo.

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Resultados

El protocolo se detalla más arriba proporciona la base para la microinyección de B. ovocitos lanceolatum y por lo tanto para la introducción en el desarrollo de B. embriones lanceolatum de ARNm que codifica proteínas fluorescentes para formación de imágenes in vivo. Aunque la técnica es ciertamente robusto y fiable, la tasa de inyecciones exitosas que utilizan este protocolo sigue siendo variable (Tabla 1). La explicación muy probable para este hecho intrigan...

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Discusión

En este artículo, presentamos, por primera vez, un protocolo detallado y reproducible para la inyección de B. ovocitos lanceolatum, que, después de B. floridae 13,14 y B. belcheri 15, es, pues, la tercera especie amphioxus, para los que tal técnica se ha descrito. Es importante destacar que el protocolo descrito aquí también incluye la descripción de sistemas de vectores adecuados para la producción de proteínas fluorescentes en B. lanceolatum a partir d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo por el "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para la cría de animales. Este trabajo fue apoyado por fondos de la ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 y ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, por la subvención de la Unión Europea 6PM "Embryomics" y por la subvención ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Proceso "de Jean-François Nicolas y Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho es financiado por una beca de doctorado FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Las solicitudes de los vectores descritos aquí pueden dirigirse directamente a los autores.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Consumibles
35 mm Placas de PetriFalcon353001Unidad de filtración tratada con cultivo
(Stericup 1 L)FisherW217190.22 μ m
Tubos Spin-XCostar81600.22 μ m
Tarro de almacenamiento de agujas para capilares de 1,2 mm de diámetroWPIE212
Pipetasde 230 mm
de largo Tubo de aspiraciónDutscher75056
Capilares para agujas de inyecciónSutterBF 120-94-10Vidrio de borosilicato con filamento, diámetro exterior 1,20 mm, diámetro interior 0,94 mm, longitud 10 mm
Reactivos
Agarosa de bajo punto de fusiónSigmaA9414
Fenol RojoSigma114537
GlicerolSigmaG2025
Hidrobromuro de poli-L-lisinaSigmaP9155
H2O, sin DNasa/RNasaGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 Kitde transcripciónKit desíntesis de ARNmAM1340
Phenol pH 8SigmaP4557
24:1 cloroformo:alcohol isoamílicoSigmaC0549
5:1 fenol pH 4.7:cloroformoSigmaP1944
Reef Crystal sales (200 kg)Europrix Sales comerciales
NaHCO3SigmaS6014
Equipment
Visor de disección fluorescente con aumento de 200X OcularesLeicaMZ16F25X, filtros DSR y GFP2
MicromanipuladorMarzhauzerM-33
InyectorPicospritzermodelo II o III
Tirador de agujasSutterP97Tirador de agujas de filamento calefactor
Pinzas finasFine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
Pasteur Ambion

Referencias

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