Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

Resumen

Hemos desarrollado un modelo de lesión pulmonar en ratón mediante inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo imita la lesión pulmonar durante la neumonía y es clínicamente relevante.

Resumen

Con el fin de estudiar la lesión pulmonar aguda humana y la neumonía, es importante desarrollar modelos animales para imitar varias características patológicas de esta enfermedad. Aquí hemos desarrollado un modelo de lesión de pulmón de ratón mediante inyección intra-traqueal de bacterias Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizando este modelo, hemos sido capaces de mostrar la inflamación pulmonar en la fase temprana de la lesión. Además, la barrera epitelial alveolar leakiness se observó mediante el análisis de lavado broncoalveolar (BAL); y la muerte celular alveolar se observó mediante el ensayo Tunel utilizando tejido preparado a partir de pulmones lesionados. En una fase posterior después de una lesión, se observó la proliferación de células requerido para el proceso de reparación. La lesión se resolvió 7 días desde el inicio de P. inyección aeruginosa. Este modelo imita el curso secuencial de la inflamación pulmonar, daño y reparación durante la neumonía. Este modelo animal clínicamente relevante es adecuado para el estudio de la patología, el mecanismo de reparación, fespués de la lesión pulmonar aguda, y también puede ser utilizado para probar agentes terapéuticos potenciales para esta enfermedad.

Introducción

Los pulmones están expuestos a los patógenos ambientales y son susceptibles a la inflamación y lesión de ^1-3. Durante condiciones patológicas tales como la neumonía o síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), patógenos, así como los factores inflamatorios liberados por los leucocitos inducen lesiones y la muerte de las células alveolares ^1-3. Es importante desarrollar modelos animales de lesión pulmonar aguda para facilitar el estudio de la patología de la lesión, así como mecanismo de reparación.

En la actualidad, la mayoría de las personas utilizan modelos de lesión pulmonar hyperoxia y bleomicina ratón inducida ^4. Sin embargo, los mecanismos de hiperoxia causaron daño no son los mismos que la mayoría de las lesiones pulmonares comunes que se producen durante la neumonía o el SDRA ^5. La bleomicina lesión aguda inducida es raro en un contexto clínico ^4. Aquí mostramos un modelo de lesión pulmonar de ratón utilizando la inyección intra-traqueal de P. aeruginosa ^6,7. Este modelo es clínicamente relevante, e imita el procesos que suceden después de la neumonía ^8.

Como un patógeno oportunista, nosocomial de individuos inmunocomprometidos, P. aeruginosa típicamente infecta el tracto pulmonar, tracto urinario, quemaduras, heridas, y también causa otras infecciones de sangre ^6. Las bacterias liberan factor de virulencia exotoxina A, se multiplican y desencadenan respuestas inmunes ^6. Administración intra-de la tráquea de P. aeruginosa refleja la situación en la exposición humana a las bacterias que causan la neumonía y la patología es probable que sea diferente del modelo de lesión informado recientemente de virus de la gripe H1N1 pulmonar inducida ^9. Desde P. aeruginosa es un patógeno oportunista, es relativamente seguro de manejar en comparación con algunos de los patógenos más virulentas. Aquí hemos utilizado la inyección intra-traqueal para administrar las bacterias porque se observó que este método introduce más bacterias en la región distal alvéolos del pulmón en comparación conalgunos otros procedimientos, tales como el uso de un catéter a través de la boca.

En comparación con otros modelos de lesión pulmonar aguda, la P. aeruginosa modelo aquí descrito es adecuado para el estudio de la lesión pulmonar inducida por bacterias y por la inflamación excesiva. A diferencia de otros modelos animales que utilizan P. aeruginosa para inducir la sepsis ^10,11, aquí utilizamos la inyección intra-traqueal de estas bacterias para inducir la lesión pulmonar aguda localizada.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales y de los Comités Institucionales de Bioseguridad de la Universidad de Illinois en Chicago.

NOTA: Todos los procedimientos que involucran pseudomonas deben realizarse con nivel de bioseguridad 2 (BSL2) prácticas, que incluyen pero no se limitan a: la máscara, protección para los ojos, bata o mono, y guantes dobles. Trabajar en la certificación de Bioseguridad gabinete. Tratar a los instrumentos en contacto con las bacterias con desinfectante a base de lejía o cloro dióxido. Use una caja sellada para muestras de transporte.

1. P. aeruginosa cultura y Crecimiento

1. Tienda P. aeruginosa PA103 como una acción bacteriana en un tapón de rosca criovial a -80 ° C.
2. Coloque el vial en un estante en una caja con un 70% de etanol mojado toallas de papel y llevarlo al laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2).
3. Racha de las bacterias sobre placas de agar sangre de oveja y crecen a 37 ° C durante ~ 15 horas en una incubadora.
4. En una campana BSL2, rayar las bacterias de la placa con el lazo bacterias y volver a suspender en 5 ml de PBS.
5. Guarde el archivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. Sin embargo, determinar el título cada 2 semanas.
6. En serie diluir las bacterias en PBS (por lo general de 1:10 a 1:10 ^{4 7)} y la placa de la dilución conocida en placas de agar sangre de oveja.
7. Incubar las placas durante ~ 15 h. Recuento de las colonias y calcular formadoras de colonias Unidad (CFU) para determinar la concentración de bacterias.
8. Resuspender las concentraciones apropiadas (~ 5 x 10 ³ UFC / l) en 0,5 ml de PBS en 1,5 ml crioviales estériles con tapón de rosca. Selle los crioviales y colocarlos en un estante criovial en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión.
9. Transporte el cuadro de instalación para animales BSL2. Una vez allí, abrir la caja en el armario BSL2.

2. P. aeruginosa instilación

1. Lleve a cabo la cirugía aséptica supervivencia (guantes estériles, instrumentos estérilesy técnicas asépticas). Utilice un paño estéril para proporcionar una superficie de trabajo para (autoclave) los instrumentos quirúrgicos estériles. Esterilizar los instrumentos utilizando un esterilizador de cuentas caliente entre cada procedimiento de instilación traqueal.
2. Pesar los ratones antes de la anestesia. Anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), en 0,1-0,2 ml de PBS por vía intraperitoneal (ip). Determinar la eficacia de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie. Use un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
3. Restringir los ratones en un tablero quirúrgico en el gabinete BSL2.
4. Identificar el área para el corte hacia abajo. Afeitado esta área y preparar la piel con 3 veces alternando con el alcohol y povidona hisopos de yodo.
5. Tratar el área de la incisión con anestesia local (lidocaína), ya que la anestesia es suficiente para una cirugía menor, tales como una incisión en la piel para acceder a la tráquea.
6. Haga una pequeña incisión (aproximadamente 5 mm) en la línea media del cuello, y el uso de f romaorceps para mover suavemente el músculo para el acceso a la tráquea. Exponer la tráquea por la disección quirúrgica.
7. Dibuje solución de bacterias en una jeringa desechable de 1 ml con aguja 27 G. Para cada ratón, administrar 20-30 l de bacterias a la concentración apropiada (hasta 10 ⁵ CFU cada ratón).
8. Insertar la aguja en la tráquea. Inyectar la solución lentamente en el traqueal.
9. Asegúrese de que los jadeos de los animales, que por lo general indica que la solución ha alcanzado en el pulmón.
10. Cierre la herida con suturas estériles (6-0 monofilamento) en condiciones asépticas.
11. Utilice 0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección subcutánea como post-op analgesia para controlar el dolor post-quirúrgico.
12. Asegúrese de que el tiempo requerido desde la inducción anestésica inicial a la incisión de cierre es inferior a 15 min.
13. Después de la inyección, desechar las jeringas y agujas en un recipiente previsto apropiado.
14. Tratar a los instrumentos quirúrgicos con DISI basado dióxido de cloronfectant durante 15 minutos, enjuagar y volver al laboratorio para su esterilización y reutilizar cuando sea necesario.
15. La casa de los ratones individualmente en jaulas limpias en ambiente cálido.
16. Compruebe en el animal cada 30 minutos hasta que se recupera la conciencia y empieza a moverse; y posteriormente a intervalos de 12 h durante los primeros 3 días después de la cirugía.
17. Mantener los ratones en las instalaciones de BSL2 animales durante todo el experimento. Asegúrese de que sólo el tejido contenido en la caja sellada salgan de la instalación BSL2 animal. Si los ratones expresan cualquiera de los comportamientos moribundas (definido como dificultad respiratoria, letargo, falta de deambular en respuesta a la estimulación suave) en cualquier punto en el estudio, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de _CO2 de una fuente embotellada seguido por dislocación cervical.
18. La eutanasia el sujeto experimental por desangrado bajo anestesia.
    1. Recoger el tejido pulmonar de los ratones sacrificados. Llevar a cabo estos procedimientos en una capucha BSL2. Si es necesario, transferir la muestra utilizando tubos sellados colocados en un rack en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión para su posterior proceso.

Resultados

A partir de 24 a 72 h después de P. inyección aeruginosa, aumento de la celularidad se observó en secciones de pulmón (Figura 1A-D). El pulmón comenzó a recuperarse a partir de 96 horas después de la lesión (Figura 1E). A los 7 días después de la P. aeruginosa, la morfología normal de los alvéolos fue restaurada en gran medida (Figura 1F). Tinción Túnel secciones usando pulmonares prepararon a 24 h después de P. aeruginosa mostró la m...

Discusión

El modelo de lesión pulmonar por Pseudomonas ratón que describimos aquí imita todo el proceso de la inflamación, lesión pulmonar, la reparación, y la resolución que se producen después de una lesión pulmonar aguda o neumonía. Tiene ventajas únicas en comparación con varios otros modelos de lesión, ya que es clínicamente relevante y relativamente seguro y fácil de manejar.

El paso crítico en el procedimiento es que la inyección de solución de bacterias tiene que ser muy lenta. Si la inyección...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anestésico: Ketamina, xilacina, lidocaína, buprenorfina			aguja de grado farmacéutico
de 27 G	Jeringa de	1482648
	Fisher Tijeras 14823434		1 ml
pinzas de herramientas
	Science Herramientas
sutura	Fisher	19-037-526
Medidor de ojos, guante, bata
Gabinete de bioseguridad desinfectante
		a base de dióxido de cloro	Clidox
	Suministro Medex	HL-1160

de Finede Fine Science Placas de agar sangre de oveja