Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Resumen

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Resumen

Bicapas lipídicas soportadas (SLBS) son ampliamente utilizados como modelo para el estudio de propiedades de la membrana (separación de fases, la agrupación, la dinámica) y su interacción con otros compuestos, como los fármacos o péptidos. Sin embargo las características SLB difieren dependiendo del soporte utilizado.

Técnicas utilizadas comúnmente para SLB óptica y mediciones son microscopía de fluorescencia de una sola molécula, de FCS y microscopía de fuerza atómica (AFM). Debido a que la mayoría de los estudios de formación de imágenes ópticas se llevan a cabo en un soporte de vidrio, mientras que AFM requiere una superficie extremadamente plana (generalmente de mica), los resultados de estas técnicas no se pueden comparar directamente, ya que las propiedades de carga y la suavidad de estos materiales influyen fuertemente en la difusión. Desafortunadamente, el alto nivel de destreza manual necesaria para el corte y pegado de láminas finas de mica para el portaobjetos de vidrio presenta un obstáculo para el uso rutinario de la mica para la preparación SLB. Aunque esto sería el método de elección, tales mica preparadosuperficies con frecuencia terminan siendo desigual (ondulado) y difícil de la imagen, especialmente con la pequeña distancia de trabajo, lentes de alta apertura numérica. Aquí presentamos un método simple y reproducible para la preparación de superficies planas delgadas de mica para la deposición de vesículas de lípidos y preparación SLB. Además, nuestra cámara por encargo requiere sólo pequeñas cantidades de vesículas para la formación de SLB. Los resultados del procedimiento general en la producción eficiente, simple y barato de superficies bicapa de lípidos de alta calidad que son directamente comparables a los utilizados en los estudios de AFM.

Introducción

El objetivo general del presente protocolo es mostrar un método para la preparación de superficies de mica de alta resolución de imagen de mica apoyados bicapas lipídicas (SLBS) mediante microscopía óptica total de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) o microscopía confocal, que también se podría combinar con la fuerza atómica microscopía (AFM).

SLBS son un modelo ampliamente utilizado para numerosos estudios de la agrupación de lípidos, la separación de fases, la dinámica de componentes de la bicapa o sus interacciones con péptidos, proteínas u otros compuestos ^1-5. Diferentes sustratos pueden ser utilizados para la form....

Protocolo

1. Mica y Preparación Diapositivas

1. Lugar N º 1 ½ (0,17 mm) en cubreobjetos gradilla de tinción.
2. Someter a ultrasonidos durante 30 min en 2% de detergente a 60 ° C.
3. Lavar 20 veces con agua desionizada.
4. Retirar los portaobjetos usando pinzas y secar con aire comprimido o nitrógeno.
5. Cortar la hoja de mica en 10 x 10 mm piezas cuadradas con unas tijeras o cuchilla de afeitar.
6. Corte cada pedazo de mica en 2-3 foliolos delgados utilizando una hoja de afeitar.
   NOTA: Este paso requiere el uso de la hoja afilada.

2. Asamblea Mica y la Cámara de montaje

1. Limpio port....

Resultados

El comportamiento de la difusión de sondas fluorescentes de lípidos en SLBS es diferente dependiendo del sustrato. TIRFM combinado con la técnica SMT es un método valioso para la visualización de movimientos de partículas y la extracción de sus coeficientes de difusión. Señales de moléculas individuales de una sonda de esfingomielina-ATTO647N de difusión en un DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) bicapa apoyado sobre el vidrio y mica se muestran en la figura animada adjunto. La superficie de la mica se .......

Discusión

Este protocolo describe un método para la preparación de superficies lisas y finas de mica para la deposición de bicapa de lípidos y formación de imágenes de alta resolución. La técnica requiere habilidades manuales mínimas, limitadas principalmente a la desmontaje cuidadoso de la sándwich de vidrio-mica y vidrio (paso 2.8), que es crítico para la obtención de una superficie de mica de alta calidad. Inspección de la mica recién escindido siempre se requiere en este punto, ya que es posible para la mica se desprenda del .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sonicador	de baño Fisher Scientific	FB15051
cubreobjetos 24 x 50 mm - Nº H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Lípidos polares	850357
Hellmanex III (detergente)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grado	SPI Proveedores	1872-CA
Adhesivo óptico (alto viscosidad)	Norland Products	NOA63
Adhesivo óptico (baja viscosidad)	Norland Products	NOA60
Esfingomielina-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
Lámpara UV	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	La lámpara se configuró al 100% de potencia