Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.
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Artículo de método
Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares
En este artículo
Resumen
Resumen
Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.
Introducción
Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas 1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad 3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facili....
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Protocolo
1. Síntesis de 10 nm nanopartículas de oro (Gold PN) 15
- Preparar la solución A: añadir cloruro de oro acuosa 2 ml 1% en 160 ml Milli-Q, o doblemente destilada, agua.
- Preparar la solución B: añadir 8 ml 1% tri-citrato de sodio x 2 H 2 O y ácido tánico 160 l 1% en 32 ml Milli-Q, o doble destilada, agua.
- Calentar la solución A y B a 60 ° C y se mezclan con agitación. Observar un color azul oscuro de inmediato. Observe el color rojo después de unos 15 minutos. A continuación, calentar hasta 95 ° C, mantener 5 minutos y enfriar la solución a temperatura ambiente.
- Añadir una gota de la suspensión NP en una reji....
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Resultados
NP de oro se han generado a través de un método bien establecido a través de la reducción del ácido cloroaúrico por el citrato y ácido tánico. Como se muestra en la Figura 2A, los NPs de oro sintetizados eran casi de forma esférica con un tamaño de aproximadamente 10 nm. BSA-recubrimiento y rodamina-etiquetado no influyeron en su morfología o tamaño (Figura 2B).
Se ha informado de que NPs de oro pueden ser fácilmente absorbidos por las diversas células de ma.......
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Discusión
El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno 17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, EE.UU.) pa.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft por la subvención Z dentro de Sonderforschungsbereich 944 'Fisiología y Dinámica de los Microcompartimentos Celulares' y HE1964/18 dentro del programa prioritario 1580.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de oro | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Ácido tánico | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Citrato trisódico | Sigma | C8532 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicina | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| Portaobjetos de cámara de 8 pocillos | Ibidi | 80826 | cultivo de tejidos tratado, estéril |
| Imaris Software | Bitplane | versión 7.6 | varias configuraciones disponibles |
Referencias
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62
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Reimpresiones y permisos
