Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Resumen

Los ensayos de placa son el estándar de oro para la cuantificación viral, ya que utilizan superposiciones atrapantes en las monocapas celulares del huésped para determinar los títulos virales. Si bien tradicionalmente se han utilizado varias superposiciones semisólidas, aquí demostramos técnicas de placa que comparan las superposiciones semisólidas con una nueva celulosa microcristalina líquida entre varias familias de virus.

Resumen

Ensayos de placas siguen siendo uno de los métodos más precisos para la cuantificación directa de los viriones infecciosos y sustancias antivirales a través del conteo de placas discretas (unidades infecciosas y zonas muertas celulares) en el cultivo de células. Aquí se demuestra cómo realizar un ensayo de placa de base, y cómo superposiciones y técnicas diferentes pueden afectar la formación de placa y la producción. Típicamente sustratos de superposición sólidos o semisólidos, tales como agarosa o celulosa carboximetil, se han utilizado para restringir la propagación viral, prevención de la infección indiscriminada a través del medio de crecimiento líquido. Superposiciones inmovilizados restringen la infección celular para la monocapa que rodea inmediatamente, lo que permite la formación de focos contable discreto y formación de la placa posterior. Para superar las dificultades inherentes en el uso de recubrimientos tradicionales, una novela superposición de líquido que utiliza celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio se ha utilizado cada vez más como un sustituto en la normala placa de ensayo. Ensayos de placa de superposición líquidas se pueden realizar fácilmente en 6 o 12 formatos de placas, así como estándar por las técnicas tradicionales y no requieren equipo especial. Debido a su estado líquido y la posterior facilidad de aplicación y remoción, formatos de placas de microcultivo, alternativamente, se pueden utilizar como una rápida, precisa y de alta alternativa rendimiento para titulaciones virales de mayor escala. El uso de un polímero líquido viscoso climatizada no ofrece la oportunidad de racionalizar el trabajo, conserve los reactivos, espacio incubador, y aumenta la seguridad operativa cuando se utiliza en los laboratorios de contención tradicionales o altos como ningún calentamiento del reactivo o material de vidrio son obligatorios. Superposiciones líquidas también pueden ser más sensibles que los recubrimientos tradicionales para ciertos virus lábiles al calor.

Introducción

El aislamiento y la cuantificación exacta de las muestras virales viables ha sido siempre un objetivo de la investigación en curso en virología. No fue sino hasta el advenimiento de la placa de ensayo en 1952 que un medio para calcular cuantitativamente y cualitativamente los títulos virales de los animales fue desarrollado por primera vez ^1,2. Esta técnica se ha adaptado y modificado a partir de ensayos de fagos, que previamente habían sido utilizados para calcular los títulos de los bacteriófagos de valores en biología vegetal ^1,2 en primer lugar. Mientras que medios alternativos para la cuantificación viral Desde entonces se han desarrollado y adaptado, tales como inmunoensayos, fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión, la detección de impulsos resistiva sintonizable (TRPS), citometría de flujo, sistemas indicadores recombinantes, y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) , estos métodos no logran identificar y cuantificar de replicación de viriones competentes ^1,3. Si bien los avances en las tecnologías y técnicas continúan refinando y alterar el paisaje; handensayos e siguen representando el estándar de oro en la determinación de las concentraciones virales de viriones infecciosos líticas ^1,4.

Durante un ensayo de placa, una monocapa confluente de células huésped está infectado con un virus lítico de una concentración desconocida que se ha diluido en serie a una gama contable, típicamente entre 5-100 viriones. Las monocapas infectadas se cubren con un medio de recubrimiento de inmovilización para prevenir la infección viral de forma indiscriminada difusión a través de ya sea el flujo de convección mecánica o del medio líquido durante la propagación viral. Mientras que se han utilizado tradicionalmente superposiciones sólidos o semisólidos tales como agarosa, celulosa de metilo o carboximetil celulosa (CMC), superposiciones de líquidos se han convertido en una alternativa cada vez más atractiva con el desarrollo de nuevos recubrimientos líquidos tales como Avicel ^{5- 7.} Ensayos de placas que utilizan líquido frente superposiciones tradicionales tienen varias ventajas como la superposición puede ser aplied a temperatura ambiente, y la aplicación y la eliminación es mucho más fácil. Como superposiciones líquidos no requieren calentamiento, virus lábiles delicados y de calor también pueden resultar más fáciles de placa.

Después de la infección inicial y la aplicación de la superposición de inmovilización, las placas individuales, o zonas de muerte celular, comenzará a desarrollar una infección viral y la replicación como se ven limitados a la monocapa circundante. Las células infectadas continuarán el ciclo de replicación-lisis-infección, propagación aún más la infección, lo que resulta en placas cada vez más distintas y discretas. Dependiendo de la cinética de crecimiento y célula huésped viral usado, una placa visible normalmente formar dentro de 2-14 días. Monocapas celulares pueden entonces ser contadas con un microscopio de campo claro estándar, o más típicamente fijos y counterstained por el rojo o cristal violenta neutral con el fin de identificar fácilmente las placas con el ojo desnudo. Hay una amplia variedad de manchas de contador de placa disponibles, cada uno con ésimoEIR ventajas y desventajas específicas. Violeta cristal se añade típicamente en el punto de recogida y después de la fijación / extracción de la superposición, proporcionando una mancha contador rápido y distinto que permite la identificación de placas muy pequeñas cuando morfología mixta está presente. El rojo neutro tiene la ventaja de la aplicación temprana y el contacto constante con la superposición, lo que permite el seguimiento en vivo de desarrollo de la formación de placa, que es particularmente útil cuando se trabaja con un desconocido cinética de virus o de replicación. Sin embargo, hemos encontrado que la tinción normalmente no es tan distinta cuando se utiliza rojo neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-tetrazolio bromuro de difenil (MTT) ofrece varias ventajas, como las manchas de tinte de color amarillo viven células placas azules oscuras y virales pueden contarse sin eliminación de la superposición como con rojo neutro. El alto contraste entre células vivas y muertas que ofrece el MTT también permite la detección de pequeñas placas en una infección punto anterior post tiempo, Aunque el almacenamiento seguiría exigiendo la eliminación de la superposición de ^8. Como cristal violeta se puede simplemente hizo en una solución de agua y alcohol, y ofrece un alto grado de sensibilidad para la morfología de la placa mixta, hemos elegido como una mancha counter preferente y simplificado para el protocolo demostró como estamos utilizando varias familias de bien virus caracterizados.

Después de la fijación y tinción de la monocapa celular infectada, las placas se cuentan en orden para titular muestras de valores virales en términos de unidades formadoras de placa (pfu) por mililitro. Una gota de registro debe señalar entre diluciones en serie y, dependiendo del tamaño de la placa, entre 5-100 placas contadas, con un control negativo utilizado como referencia. Muestras estadísticamente variarán en un 10% por cada 100 placas contadas al comparar la muestra replica ^3. La ventaja de usar ensayos de placas para determinar los títulos virales reside en su capacidad para cuantificar el número real de partículas virales infecciosas wentro de la muestra. Como múltiples viriones podrían potencialmente infectar una sola célula, se utiliza la terminología de las unidades frente a viriones durante titulaciones de placa ^1,2.

Morfología de la placa puede variar enormemente en condiciones de crecimiento diferentes y entre las especies virales. Tamaño de la placa, la claridad, la definición de fronteras, y la distribución deben tenerse en cuenta todos, ya que pueden proporcionar información valiosa sobre los factores de crecimiento y virulencia del virus en cuestión.

Principios ensayo de placa de base también se pueden adaptar y modificar en un número de maneras diferentes, tales como en el uso de ensayos de formación de enfoque (AGL). AGL no se basan en la lisis celular y la contratinción para detectar la formación de placa, sino más bien inmunotinción emplean técnicas para detectar directamente las proteínas virales intracelulares a través de anticuerpos etiquetados. Aumento de la sensibilidad, la disminución de los tiempos de incubación después de la infección, y lo más importante la capacidad para cuantificar los virus no lítico son todos distintosventajas cuando se emplean ácidos grasos libres. Aunque se usan ampliamente, los factores limitantes críticos en AGL frente a un ensayo de placa tradicional se encuentra en la necesidad de anticuerpos apropiados y la capacidad de sólo sonda para subunidades de proteínas virales frente a viriones infecciosos reales ^4.

A los efectos de este estudio, vamos a limitar nuestra discusión a ensayos de placas clásicos y describir el uso de superposiciones de sólidos y semisólidos tradicionales (agarosa y CMC), junto con superposiciones de celulosa microcristalina líquido novedosos.

Protocolo

1. Preparación de Células y Reactivos

1. El día antes del ensayo, la placa de células huésped apropiadas para el virus en cuestión (Tabla 1 y 2) a 90 - 100% de confluencia.
2. Preparar la solución de fijación de formaldehído al 10% en dH ₂ O. En el ejemplo, la mezcla 5,56 ml de 36% de la formaldehído con 14,44 ml de H ₂ O destilada _(dH2O).
   NOTA: Use las prácticas de manejo seguro apropiado y ventilación cuando se utiliza formaldehído.
3. Preparar mancha cristal violeta: 1% de cristal violeta (CV) en etanol al 20% y DH ₂ O.
4. Preparar los medios de comunicación de la placa 2x (tipo celular dependiente a la concentración 2x; véase la Tabla 2). Filtrar sobre un filtro de 0,2 micras si cualquier reactivo no son estériles.
5. Preparación de las placas de inmovilización (Tabla 3)
   1. Para superposiciones de líquidos, hacer una solución de 2,4% estéril de Avicel en dH ₂ O. Para evitar la formación de grumos, añadir el polvo a un matraz que contiene agua ªen que se mezcla rápidamente con una barra de agitación, se vierte lentamente en Avicel y revolver rápidamente a temperatura ambiente (TA). Cuando la solución resulta demasiado viscoso para una barra de agitación para homogeneizar, cambiar a un agitador de matraces para> 30 min con agitación fuerte para asegurar una homogeneización.
      NOTA: Las soluciones madre se pueden hacer a concentraciones más bajas, pero las soluciones pueden separar y tendrán que ser remezclado para asegurar la homogeneización. Las soluciones de trabajo de Avicel pueden utilizarse van desde 0,6 hasta 3%.
   2. Después de la homogeneización, autoclave la solución y tienda sellada a temperatura ambiente.
   3. Para agarosa y carboximetilcelulosa (CMC) superposiciones, preparar una solución de reserva en dH ₂ O de 2% de CMC o agarosa al 0,6%. Mezclar con una barra de agitación y autoclave o microondas para poner en solución.

2. Las diluciones e Infecciones

1. El día después de la siembra, compruebe visualmente la confluencia y la viabilidad de las células antes de comenzar el ensayo. Asegurar un estándar celular morfologíaencontrar una monocapa confluente ~ 90% está presente.
2. Realizar una dilución en serie de diez veces de las muestras infecciosas. Utilice el medio de crecimiento celular para la propagación viral como el diluyente (Tabla 2). Variar el número de diluciones requeridas basado en el título esperado del virus en cuestión, y siempre utilizar una muestra de control no infectado para asegurar de forma independiente la viabilidad celular y ayuda en la identificación de la placa.
3. De las diluciones en serie, infectar las células durante 45 min a 1 h (Tabla 1). Utilice un volumen suficiente de inóculo para cubrir las células, mientras que manteniendo el volumen lo más bajo posible para maximizar el contacto con la monocapa viral (Tabla 4). Placas de roca suavemente cada 20 minutos para asegurar una cobertura uniforme y evitar la monocapa celular se seque.
4. Después de la infección, superponer un volumen apropiado de medio de inmovilización directamente a los inóculos en el pozo (Tabla 2) usando una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x y la immobilizing superposición de elección (CMC, agarosa o Avicel). Agite suavemente para mezclar.
   1. Para superposiciones de líquidos, mezclar 1: 1 con los medios de placa 2x calentado y 1.2 a 2.4% de RT Stock Avicel para obtener una solución de trabajo de 0,6 a 1,2% de medio de superposición Avicel.
   2. Para una capa de agarosa, utilice una mezcla 1: 1 de los medios de placa 2x calentado y una solución madre de 0,6% de agarosa climatizada, lugar en un baño de agua 56 ° C durante 30 min para equilibrar la temperatura de la obtención de una concentración de agarosa / superposición final de 0,3 %.
   3. Para CMC, preparar una solución de 2% y el tratamiento que el descrito para la capa de agarosa.
   4. Cuando se aplica el recubrimiento a la monocapa, siempre equilibrar agarosa caliente o CMC en un 56 ° C el agua para evitar daños a la monocapa. Asegúrese de que la solución es cálido, pero no caliente al tacto para evitar la muerte de las células y los títulos virales reducidos. La mayoría de las superposiciones de agarosa comenzarán a solidificarse por debajo de 42 ° C, trabajar de forma rápida y / o preparar pequeños lotes para evitar la solidificación durante la manipulación.
5. Después de la adición de la superposición, incubar las placas para producir placas distintas que son claramente contable. La formación de placas puede tomar 2-14 días dependiendo del virus que se analizaron, la Tabla 1.
   NOTA: Una vez que las placas superpuestas líquidos se colocan en la incubadora, no moverlos. Movimiento de las superposiciones de líquidos durante el período de incubación se traducirá en placas untadas. Agarosa y CMC superposiciones son semisólido y se pueden mover o revisados ​​periódicamente bajo un microscopio de luz para controlar el desarrollo de la placa.

3. Fijación y tinción de las células

1. Para fijar las células, verter o aspirar la superposición Avicel, y fijar las células utilizando la solución de formaldehído al 10% durante 30 min a durante la noche (<1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos).
   1. Para agarosa o CMC, añadir directamente la solución de formaldehído a la superposición durante 1 hora a toda la noche.
      NOTA: Las muestras pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo en el fijador siempre lo haceno se evapore y seque ya que esto puede distorsionar la monocapa.
2. Antes de la tinción y después de la fijación, deseche el formaldehído y quitar los tapones semisólidos para la agarosa y CMC, ya sea con agua corriente o manualmente con una espátula. Enjuague Avicel placas con agua para eliminar residual superposición / fijador antes de la tinción.
3. Para la tinción, cubrir las células con una cantidad mínima de solución de cristal violeta durante ~ 15 min. Placas de roca si es necesario para asegurar una cobertura uniforme.
4. Lavar suavemente la mancha violeta cristal con agua. Una vez fijado, manchado, y se seca, almacenar las placas de forma indefinida para futuros análisis.

4. Determinación de títulos virales

1. Cuente las placas en cada pocillo, tomando el promedio de los técnicos repeticiones de la misma dilución. Para los grandes formatos de placas, pozos de descuento con menos de 5 o mayor de 100 placas. Tome nota del tamaño de la placa y la morfología. El control negativo debe tener una monocapa uniforme yse puede utilizar como un control de referencia.
2. Determinar el título viral de la muestra de stock de tomar el número medio de placas para una dilución y la inversa del factor de dilución total.

NOTA: Como un ejemplo, 30 y 32 placas contada por repeticiones de la 1 x 10 ^-7 dilución [31 (promedio) / 10 ^-7 (dilución) x 0,4 ml (inóculo)] produciría un título de 7,75 x 10 ⁸ pfu / ml.

Resultados

La capacidad de los ensayos de placa de evaluar con precisión los títulos virales depende de numerosos factores: la selección de células huésped apropiado, medios y condiciones de crecimiento adecuadas para la viabilidad celular y viral, la propagación viral inmovilizado, y una determinación exacta del período de incubación viral para permitir un tiempo adecuado para distinta y la formación de placa contable.

Para este estudio, se eligieron tres familias de virus representativos para demostrar diferencias en: la selección de superposición, períodos de incubación, y morfología de la placa a través de diferentes tipos de muestras. La encefalitis equina venezolana (VEEV) fue seleccionado como un modelo viral (+) ARN de cadena simple, que puede causar enfermedad significativa en las especies y seres humanos equinos y representa la familia Togaviridae. Influenza B cepa Taiwán, una segmentado (-) de virus ARN de cadena simple que infecta principalmente los seres humanos, representa a la familia Orthomyxoviridae. Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), a - virus de ARN de cadena simple artrópodo nacido infectando principalmente artrópodos, ()rumiantes y los seres humanos, fue seleccionado como representante de la familia Bunyaviridae.

Para RVFV (Figura 1), los títulos se determinaron a partir de una solución madre de una cepa viva atenuada recombinante MP12 de RVFV en un formato de placa de 12 pocillos utilizando CMC, agarosa, o Avicel superposiciones que se incubaron de lado a lado para después de la infección 72 hr (HPI). Un plato representativo que muestra diluciones que van desde 10 ^{-4-10 -7} se puede ver en el panel A. Las placas utilizando CMC y superposiciones de agarosa mostró placas pequeñas, claras y distintas, con un borde circular bien definida. Las placas con una capa de líquido fueron ligeramente más abundantes y de mayor tamaño en comparación con las placas de agarosa y CMC, y proporcionaron una frontera menos distintas. Los títulos virales se compararon en el Panel B con todas las superposiciones realizar comparable.

Con el fin de obtener una comparación visual más clara entre las superposiciones de MP12, junto con un tamaño de muestra mayor para determinar reproduccibilidad, una placa de 6 pocillos también se probó por triplicado (Figura 2). En el formato de placa de 6 pocillos, el uso de una superposición de CMC mostró placas más pequeño que cualquiera superposiciones de agarosa o líquidos, que eran comparables en tamaño a la otra. Mientras que los títulos virales fueron similares entre los tres superposiciones (Panel D), placas formadas en las capas de agarosa y líquidos resultaron más fáciles de contar debido a su mayor tamaño.

En contraste con RVFV, los títulos de VEEV y morfología de la placa entre las superposiciones de diferentes variaron notablemente (Figura 3A). Placas formadas en las capas de CMC demostraron una morfología clara y distinta cuando se utiliza un formato de placa de 12, a expensas de tamaño y sensibilidad de la placa (Panel B). En contraste con CMC, el uso de agarosa y líquidos superposiciones resultó en placas significativamente más grandes, lo que indica la inhibición viral más baja y aumento de la sensibilidad a la replicación VEEV. Esto fue confirmado previamente cuando se comparan exclusivamente agarosa frente a CMC en apaper publicado por Juárez et al. ^4. Mientras agarosa y líquidos superposiciones producen placas más grandes que CMC, las placas habían bordes mal definidos y eran difíciles de contar en un formato de 12 pocillos, con superposiciones de líquidos que proporcionan la mayor difusión frontera. Cuando las placas se probaron en placas de 6 pocillos (Figura 4), ​​el más grande formato de 6 pocillos negada la cuestión de la abiertamente grandes placas que eran difíciles de diferenciar en el formato de 12 pocillos, con agarosa y superposiciones de líquidos que demuestren superior a las superposiciones de CMC en términos de definición placa y sensibilidad (Figura 4D).

En comparación con RVFV o VEEV, influenza proporciona varios desafíos únicos cuando formación de placas, tales como el requisito de una proteasa externa. La sensibilidad de los virus de la influenza a las diferentes selecciones de superposición también ha sido bien documentado en el pasado ya que se han observado cambios significativos cuando las modificaciones de menor importancia como como diferentes marcas de agarosa tienen seres usado ^9.

Es interesante para la cepa de la influenza B Taiwán, el uso de la CMC como una superposición dio lugar a placas notablemente más pequeños que eran difíciles de contar y resultaron difíciles de marcar de forma fiable (Figura 5A). El uso de una capa de agarosa proporcionó las mejores placas (Panel C), y resultó en una mancha de fondo más oscuro (probablemente debido a un aumento de la viabilidad monocapa), y mostró placas más claras y nítidas en comparación directa con el uso de la superposición de líquido (Panel B ).

Una clara ventaja de polímeros líquidos más de superposiciones sólidas y semisólidas, tales como agarosa y CMC, se encuentra en la facilidad de eliminación y aplicación. Superposiciones semiduros requieren calefacción, y la solidificación puede ser problemático cuando la manipulación y eliminación. Con el fin de sacar provecho de estas ventajas y determinar la viabilidad de la utilización de Avicel en forma de alto rendimiento para RVFV, un formato de placa de 96 pocillos se probó en diferentes concentrati superposicióncomplementos (Figura 6). Para RVFV MP-12, las diluciones se realizaron por cuadruplicado en ambos 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel. Aplicación de superposición y la eliminación demostraron simple, sin diferencias aparentes entre repeticiones o entre las concentraciones observadas, lo que demuestra un alto grado de reproducibilidad. Al puntuar, las placas eran distintos y contable a simple vista, lo que demuestra la viabilidad de la utilización de superposiciones de líquidos en un alto rendimiento para RVFV manera.

Figura 1: Placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron a Veros 2,5 x 10 ⁵ células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC (c definitivaoncentrations), se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostrado en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B.

Figura 2: placa RVFV comparaciones de superposición utilizando placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 ⁵ células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de MP12.. Tres ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A, B, y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe para paneles de AC, con las placas se contaron y se titularon en el Panel D (N = 3).

Figura 3: placa VEEV comparaciones de superposición utilizando placas de 12 pocillos se sembraron Veros. a 2,5 x 10 ⁵ células en placas de 12 pocillos y se infectaron con 200 l utilizando la misma muestra diluido en serie a partir de la cepa de la vacuna VEEV TC-83. Después de la infección 1,5 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se demuestra en el Panel A. Las placas se contaron y se titularon en el Panel B.

Figura 4: V EEV comparaciones de superposición de la placa que utilizan placas de 6 pocillos Veros se sembraron a 5 x 10 ⁵ células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l usando la misma muestra de partida diluido en serie de VEEV TC-83.. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o un 1% de CMC, se aplicaron con el fin de comparar directamente las superposiciones como se ha demostradoen los Paneles A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica a la descrita para Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3).

Figura 5: INFLUENZA placa comparaciones de superposición de las células MDCK se sembraron a 5 x 10 ⁵ células en placas de 6 pocillos y se infectaron con 400 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de Influenza B Taiwan.. No suero bovino fetal (FBS) se utilizó en el medio de crecimiento o superposiciones, como FBS puede inhibir la propagación de la influenza mediante la inhibición de ciertas proteasas que son necesarios para la fusión viral. TPCK-tripsina se añadió a todas las superposiciones antes de la aplicación con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada con las células huésped. Después de la infección, 3 ml superposiciones de agarosa al 0,3%, 0,6% Avicel, o 1% de CMC se aplicaron con el fin de comparar directamentelas superposiciones como se demuestra en el Panel A, B y C. experimentos separados se llevaron a cabo de forma idéntica como se describe en los Paneles A - C, con placas contadas y tituladas en el Panel D (N = 3). Mientras que en promedio fue tomada por placas CMC que resultaron difíciles de contar de forma fiable, ya que demostraron fronteras difusas y tamaños muy pequeños de placa.

Figura 6:. Superposiciones de placa de alto rendimiento Una placa de 96 pocillos de Veros en placas a 3 x 10 ⁴ células por pocillo, se infectaron con 50 l de inóculo utilizando la misma muestra de partida diluido en serie de RVFV MP12 durante 1 hora, por cuadruplicado. Para las superposiciones, 0,6 y 1,2% concentraciones finales de Avicel se probaron para determinar la viabilidad y reproducibilidad de la utilización de superposiciones de líquidos de una manera de alto rendimiento, paneles A y B.

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de la célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infección	1 hora	1 hora	45 min
El tiempo de incubación	3 días	2 días	3 días

Tabla 1: La placa de ensayo de inoculación condiciones y tipos de células

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de la célula	Vero	Vero	MDCK
Tipo de crecimiento	DMEM 1	DMEM 1	DMEM 2
Placa de Medios	Un 2xEMEM	Un 2xEMEM	2xEMEM B

1. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina.
2. Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / estreptomicina, 0,2% albúmina de suero bovino, HEPES 0,025%, DEAE-dextrano 50 ug / ml.
A. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con FBS al 5% (25 ml), 1% Esencial Mínimo Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato sódico (5 ml), 1% de L-glutamina (5 ml), 2% penicilina / estreptomicina (10 ml).
B. 2x Medio Esencial Mínimo (500 ml) suplementado con 0,2% de albúmina de suero bovino, aminoácidos esenciales 1% mínimo (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dextrano, Tripsina-TPCK *
* Justo antes de la preparación, añadir 1 l por cada 25ml de 2 mg / ml de tripsina-TPCK a la alícuota que va a utilizar para mezclar con agarosa para placas.

Tabla 2: La placa y Viral / Celular Crecimiento Medios

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de la célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infección	1 hora	1 hora	45 min
El tiempo de incubación	3 días	2 días	3 días

Soluciones de superposición no expirarán cuando se hace siempre y cuando se mantenga la esterilidad.

Tabla 3: Superposiciones Stock

	6 así	12 así	96 así
Nº de células / pocillo	5 x 10 5	2,5 x 10 5	3 x 10 4
Volumen de inóculo (l)	400	200	50
volumen de superposición (ml)	3	1.5	0,100

Tabla 4: Formatos de placas

Discusión

El factor más crítico para el éxito de un ensayo de placa se encuentra en la optimización del protocolo para el cultivo viral particular en cuestión ya que las condiciones pueden variar significativamente. Los puntos clave a tener en cuenta son: la sede de la compatibilidad celular con el virus en cuestión, las condiciones de crecimiento viral apropiados, los rangos de dilución suficiente con el fin de diferenciar claramente las placas, y la selección de superposición correcta y tinción de las células y de virus en cuestión.

Mientras VEEV y RVFV tanto crecen bajo condiciones muy similares que utilizan muchos de los mismos tipos de células huésped, las diferencias en la morfología y cinética de crecimiento de placa varían significativamente. Cuando se utilizan células Vero para los ensayos de placa, que se han utilizado tradicionalmente como una línea celular de propagación y el indicador de virus y alfavirus fiebre hemorrágica, VEEV normalmente crece hasta títulos más altos que RVFV y demuestra el aumento de la cinética de replicación, el desarrollo de grandes placas uniformes a 48 hpi ^{4, 10-12.} En contraste con VEEV, RVFV requiere 72 hpi y demuestra placas que son típicamente mucho más pequeño y de tamaño variable.

En oposición a RVFV y VEEV, el virus de la gripe es altamente específica de la célula huésped y puede ser difícil para propagarse a través de cultivo de tejidos. Para el virus de la influenza, la entrada viral y fusión normalmente se inicia por la unión del receptor de la superficie celular con la hamagglutinin glicoproteína viral (HA), que media la entrada en la célula diana mediante la unión con el receptor de superficie de ácido α-siálico de la célula huésped. HA es una glicoproteína trimérico que está presente en la envoltura de la membrana de todos los virus de la gripe y requiere la escisión en el HA1 y HA2 subunidades por una proteasa específica de la célula huésped. Para complicar aún más el asunto, estos sitios de escisión a menudo pueden variar entre cepas virales ^13. Como la expresión de proteasas capaces de escindir HA está restringida a tejidos específicos, proteasas are menudo añadido a medios de cultivo celular con el fin de facilitar la fusión viral y la entrada en la célula huésped seleccionada ^13. TPCK-tripsina es un ejemplo de una proteasa de uso común que se utiliza en el cultivo de células MDCK tanto con y células Vero: facilitar la replicación multi-ciclo (en ausencia de cualquier suero inactivar la tripsina) a través de la activación proteolítica de HA viral ^14,15.

Como se demuestra en este estudio y otros, las diferencias en los ciclos de vida virales pueden influir en las selecciones de superposición, los formatos de placas, y los tiempos de recogida, con variaciones significativas entre diferentes clases y especies de virus. En nuestro estudio, las superposiciones de agarosa demostraron placas más claras en los títulos más altos que cualquiera de CMC o superposiciones de líquidos, tanto para RVFV y el virus de la influenza B, reforzando su utilidad entre una amplia gama de virus y tipos de células. Usando una concentración final de agarosa de bajo gran medida con la ayuda en la eliminación de los tapones sólidos y tinción simplificado. CMC demostró en general la peficacia oorest como una superposición de los tres virus probadas y producidas placas muy pequeñas y poco definidos para el virus de la influenza B. Aunque en general CMC demostró las características menos deseables, su uso en rápido crecimiento y extremadamente virulentas de virus podrían resultar ventajoso, como lo hizo parece reducir tamaño de la placa con sólo una mínima disminución en el título. La superposición líquido resultó ser el más versátil en que era extremadamente sencillo de preparar, mayor facilidad de uso, y fue comparable a agarosa a través de todos los virus seleccionados. En un formato de placa de un mayor rendimiento de 96 pocillos, aplicación y eliminación no fue inhibida debido a la solidificación como con revestimientos tradicionales, y proporcionado resultados precisos y consistentes. Una consideración cuando se utiliza superposiciones líquidos se encuentra en la coloración opaca y la incapacidad para controlar la formación de placa como las placas no se pueden mover hasta el punto de recogida, limitando esta adaptación a los virus con cinética de replicación previamente caracterizadas.

Pequeñas modificaciones en las condiciones de ensayo de placa pueden alterar significativamente los resultados, y la evaluación y el rendimiento de cualquier nuevo sistema o técnica está siempre garantizado. Mientras que un protocolo de ensayo de placa optimizada y estandarizada no existe para cada situación, nuestro informe demuestra la versatilidad y facilidad de uso en el tradicional, así como nuevos recubrimientos líquidos para ensayos de placa, mientras que proporciona un fondo suficiente para otras modificaciones de usuario.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa CellStar de 6 pocillos para cultivo de tejidos	Greiner Bio-One	658 160
Placa CellStar de 12 pocillos para cultivo de tejidos	Greiner Bio-One	665 180
Placa CellStar de 96 pocillos para cultivo de tejidos	Greiner Bio-One	655 180
placa de pocillos profundos de 96-2 ml	USA Scientific C15046314		Para diluciones en serie
DMEM	Quality Biológicos	112 013 101	Medios Celulares/Diluyente
2x EMEM para placas Biológicos de	Calidad	115 073 101	Cálido a 37 ° C
MEM 100x	Cellgro	25 025 Cl
Piruvato de Sodio	Cellgro	25 000 Cl
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140 122
L-Glutamina	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Inactivación del calor antes de su uso a 62 ° C durante 30 min
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldritch	A7030-50G
Tripsina TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Hacer alícuotas/Evitar la congelación y descongelación
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Dextrano	Sigma Aldritch	D9885-10G
Cristal Violeta	Sigma Aldritch	C3886-25G
Solución de formaldehído	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Etanol desnaturalizado Grado de reactivo	Sigma Aldritch	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Agitar vigorosamente al reconocer  durante >30 min para homogeneizar
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Carboximetilcelulosa, sal de sodio viscosidad media	Sigma Aldrich	C4888