En este artículo mostramos un método para preparar cortes agudos de cerebro a temperatura fisiológica, utilizando una solución fisiológica convencional sin modificaciones especiales para el corte (como la adición de sacarosa) y sin perfusión intracardíaca del animal antes de la preparación del corte.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Slice It Hot: Agudo cerebrales en adultos rebanar en la temperatura fisiológica
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí se presenta un protocolo para la preparación de cortes de cerebro agudas. Este procedimiento es un elemento crítico para los experimentos de patch-clamp electrofisiológicos que determina en gran medida la calidad de los resultados. Se ha demostrado que la omisión de la etapa de enfriamiento durante el procedimiento de corte es beneficioso en la obtención de rebanadas y las células sanas, especialmente cuando se trata de estructuras cerebrales altamente mielinizadas de animales maduros. Aunque el mecanismo exacto por el que la temperatura elevada favorece la salud de los nervios sólo puede especular sobre, es lógico pensar que, siempre que sea posible, la temperatura en la que se realiza el corte debe estar cerca de las condiciones fisiológicas para evitar los artefactos relacionados con la temperatura. Otra ventaja importante de este método es la simplicidad del procedimiento y por lo tanto el tiempo de preparación corto. En el método demostrado se utilizan ratones adultos pero el mismo procedimiento se puede aplicar con ratones más jóvenes, así como las ratas. También, las siguientes cl parcheamp experimento se realiza en rebanadas horizontales cerebelosos, pero el mismo procedimiento se puede utilizar también en otros planos, así como otras áreas posteriores del cerebro.
Introducción
El objetivo del método presentado es conseguir cortes de cerebro agudos de alta calidad para experimentos electrofisiológicos in vitro, especialmente cuando se utiliza adulto o incluso los animales de edad.
El método de corte cerebral agudo, tal como se describe por Skrede y Westgaard 1 en dos frases elegantes, se ha convertido en uno de los fundamentos de la investigación de la neurociencia moderna y está empleado en innumerables variaciones en todo el mundo. La calidad de las rodajas se refleja en el número de neuronas por rebanada viviente, el período de tiempo durante el cual las células mantienen sus propiedades electrofisiológicas y morfológicas, así como en la integridad del tejido. Además, la duración máxima para las grabaciones estables depende de la calidad de las rodajas. Por lo tanto, a lo largo de las décadas, el método de la división original ha sido desarrollado por los grupos individuales de investigación para mejorar la recuperación después de cortar la rebanada 2-10, a menudo por modificaciones complejas de la composición de corte osoluciones de recuperación r (tales como la adición de ascorbato, tiourea o incluso H 2 O 2), así como pre-perfusión intra-cardiaca del animal con soluciones fisiológicas enfriado.
Como se ha demostrado recientemente 11, temperatura fisiológica durante el corte parece ser más beneficiosa que la refrigeración para la salud neuronal; la mejora es más notable cuando se trabaja con adultos (2-8 meses) los roedores. Evitar cambios drásticos de temperatura evita artefactos debido a los procesos dependientes de la temperatura en las células, tales como la plasticidad y 13 canales de iones cinética de 13,14. Tales cambios podrían influir en la tensión de la membrana y la señalización del calcio intracelular, el umbral de pico y pico de forma.
El método "caliente" rebanada aguda preparación que aquí se presenta es un procedimiento general para la obtención de cortes de cerebro agudos de alta calidad desde cualquier región del cerebro, incluyendo el cerebelo, la corteza y el hipocampo, núcleos de helio tronco cerebral 16 </ Sup> así como el bulbo olfatorio, tanto en ratas y ratones.
En particular, el procedimiento de corte en lonchas temperatura fisiológica requiere que la cuchilla de corte vibra casi perfectamente horizontal y es sin defectos estructurales. Tal precisión podría no ser alcanzable con los modelos de máquina de cortar de edad avanzada; en tales casos, se recomienda la realización de la preparación rebanada en condiciones de congelación frío como la temperatura baja parece tener el tejido más resistente a los daños mecánicos, aunque a costa de las aberraciones metabólicas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo fueron aprobados por Cuidado de Animales de la Universidad Hebrea y el empleo.
1. Preparación de las soluciones y herramientas para rebanar
- Preparar 1 L de solución fisiológica estándar (SPS) que contiene los iones descritos en la Tabla 1.
- Preparar una solución madre que contiene las sales en 10 veces la concentración final de antemano en una botella de vidrio de almacenamiento lleno de 1000 ml de agua desionizada (conductancia de 0,055 mS / cm). Añadir sales (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, y MgSO4), y revuelva hasta que se disuelva por completo. Guarde la solución madre en 4 ° C.
- Hacer la solución final MSF en el día del experimento. Añadir 100 ml de la solución madre a 700 ml de agua purificada, disolver la glucosa (3,6 g) y NaHCO3 (2,18 g) usando una barra de agitación magnética y luego añadir agua purificada hasta 1 L.
- Equilibrar los solutien por gaseamiento con 95% O2 / 5% de CO 2 durante ~ 20 min. Después de esto, añadir 2 ml de solución M CaCl 2 1.
- Montar las herramientas siguientes (Figura 1).
- Prepare grandes tijeras u otra herramienta para la decapitación, pequeñas tijeras quirúrgicas para abrir el cráneo, fórceps de punta fina para levantar el cráneo para exponer el cerebro, con hoja de bisturí para diseccionar la parte deseada del cerebro para ser cortado en lonchas y una pequeña espátula para manipular la partes del cerebro disecados.
- Además, preparar pequeños trozos de papel de filtro para eliminar el exceso de líquido del cerebro, dos pequeñas placas de Petri para el cerebro para ser diseccionados en dos vasos de precipitados de vidrio de 500 ml para contener agua caliente y MSF purificado, y el pegamento de cianoacrilato para pegar el cerebro a la etapa de corte.
- Preparar un pequeño cepillo para el manejo de las rebanadas durante el corte en lonchas y una pipeta Pasteur de vidrio de boca ancha para mover las rebanadas del baño de corte para el cha recuperaciónmbre. Desinfectar las herramientas para prevenir el crecimiento de bacterias en los baños rebanada cálidos. Por otra parte, el uso de guantes de laboratorio limpios.
- Preparar una cámara de recuperación rebanada sumergida tal como se describe por Gibb y Edwards 15. Continuamente gas del SPS en ella con un 95% de O 2/5% de CO 2 y mantener a 36 ° C. Asegúrese de que el gaseamiento no da lugar a pequeñas burbujas atrapadas en el baño que podría dañar las rebanadas.
- ~ Caliente de 300 ml de la MSF a 36 ° C en una placa de calefacción con agitador magnético o en un baño de agua. Si se utiliza una placa de calefacción, tenga cuidado para evitar que la solución de un sobrecalentamiento, lo que puede dar lugar a la precipitación de iones. En caso de que suceda, cálidos MSF frescas en lugar de enfriar la antigua.
- Llevar ~ 500 ml de agua purificada a ebullición usando un hervidor de agua eléctrico y, en un vaso de precipitados, se combinan 300 ml de la misma con agua fría para obtener agua ligeramente más caliente que la temperatura de corte. Utilice esta calentó agua purificada durante la decapitación y el uso de la RemaiNing del agua hervida posteriormente para mantener la temperatura fisiológica del baño de corte.
- Anestesiar el ratón mediante la inyección de 0,1 ml de pentobarbital (60 mg / ml) por vía intraperitoneal. Después de unos minutos comprobar que el animal no responde a los fuertes de los pies o la cola pellizcos para determinar la falta de sensación.
2. Disección del cerebro
- Decapitar el ratón rápidamente cortando el cuello con las grandes tijeras cerca de la parte posterior del cráneo, y dejó que la cabeza caiga en el vaso con agua purificada caliente para enjuagar el exceso de sangre.
- Exponer el agujero occipital en el cráneo debajo de los músculos del cuello y la piel, posiblemente, la eliminación de más del cuello con las tijeras pequeñas.
- Tire de la piel en la parte superior del cráneo para ser capaz de ver claramente las suturas del cráneo con el fin de guiar la abertura del cráneo.
- Cortar el cráneo abierto mediante la inserción de la punta inferior de las tijeras pequeñas a través del agujero magno y de inmediato convertirlos haciael lado lateral. Cortar suavemente a lo largo del borde lateral del hueso parietal hasta un lugar detrás de los ojos y la sutura frontoparietal; a continuación, girar hacia el centro del cráneo y cortar a través de la línea media al otro lado del cráneo (véase la línea discontinua verde en la Figura 2A).
- Con unas pinzas de punta fina, levante el cráneo desde la esquina frontoparietal y tire de ella en diagonal hacia arriba y hacia los lados para exponer el cerebro (ver flecha amarilla discontinua en la Figura 2A). Asegúrese de que el cráneo no está conectado a ningún hueso o la piel de la cabeza, por lo que el cerebro se mantendrá en su lugar cuando se levantó el cráneo. En caso de que el cerebro se está moviendo con el cráneo, utilizar las tijeras pequeñas para retirar cualquier tejido conectivo entre el cráneo y el cerebro.
- Cuando se expone el cerebro, no permita que el cerebro esté bien seco. Por lo tanto, lleve a cabo los siguientes pasos mientras se mantiene el cráneo y el cerebro en una placa de Petri llena de calentado, gaseados MSF.
- Separe la parte del cerebro que se utiliza para el correoXperiment del resto del cerebro usando un escalpelo y una espátula. En caso de utilizar el cerebelo, desprenda del cerebro anterior por un solo corte a través del mesencéfalo y protuberancia (a lo largo de líneas rojas en las figuras 2B-D) y moverlo a una pequeña placa de Petri que contiene frescos, gaseados MSF.
- Retire el tronco cerebral para formar una base recta y ancha para pegar el cerebro para cortar etapa al rebanar el cerebelo en el plano horizontal. Brevemente colocar el cerebelo en un trozo de papel de filtro húmedo de manera que el lado que fue cortado de la prosencéfalo esté orientada hacia abajo.
- Cortar el tallo cerebral con un bisturí para formar la base (como se indica con la línea azul en la Figura 2B), y devolver el cerebelo a la MSF. Cuando se necesitan otros planos de corte, recorte el bloque cerebelo en consecuencia (líneas azules en las figuras 2C y D).
3. Cortando el Cerebro
- Preparar la etapa de corte determinando que es dry, antes de aplicar una pequeña gota de pegamento en el centro del escenario.
- Levante el bloque de cerebro de la SPS utilizando una espátula con correcto hacia arriba, y eliminar el exceso de líquido del cerebro utilizando pequeños trozos de papel de filtro. Luego, con un solo movimiento, deslice el cerebro de la espátula sobre la gota de pegamento en el escenario.
- Para evitar que el cerebro de secado y el pegamento de corriendo hacia arriba en los lados del tejido, se aplican unas pocas gotas de SPS con una pipeta Pasteur y colocar la etapa de corte en la cámara de corte. Alinear el bloque de cerebro, de modo que las regiones de interés (por ejemplo, la corteza cerebelar) se enfrentan a la hoja y por lo tanto serán sometidos a menor cantidad de presión mecánica antes de ser cortado.
- Cortar cada rebanada de acuerdo con las instrucciones del fabricante mientras que constantemente gasificación al SPS en la cámara de corte, así como manteniendo la temperatura a 34-37 ° C. Mantener la temperatura de la cámara de corte en este rango llenando el external cámara de la máquina de cortar con agua purificada calentada y reemplazar el agua cuando la temperatura baja demasiado.
NOTA: Los parámetros de corte en lonchas deben ser encontrados experimentalmente para cada tipo de tejido y las neuronas que están siendo examinadas. En el caso de la máquina de cortar Campden SMZ 700 con cuchillas de cerámica y células de Golgi del cerebelo, utilice 0,75 mm amplitud de la vibración a 65 Hz y velocidad de avance de 0,05 mm / seg; para las neuronas cerebelosas nucleares mayor amplitud y frecuencia (1 mm y 90 Hz, respectivamente) y velocidad de avance más lenta (0,01-0,02 mm / seg) se recomienda. Por tanto Golgi y las neuronas cerebelosas nucleares, grosor de corte debe ser de 300 micras. - Durante el corte, no permita que las rebanadas se plieguen sobre sí mismos. Para prevenir esto, apoyando suavemente con un cepillo suave, tocando preferentemente la rebanada sólo en regiones que no son de interés para el experimento. Tenga cuidado para evitar que el cepillo toque la cuchilla vibratome; especialmente en el caso de las hojas de cerámica, incluso un ligero contactopuede dañar la hoja.
- Mueva cada rebanada de la cámara de corte para una recuperación / celebración de cámara utilizando una boca ancha, Pasteur de vidrio pipeta pulida al fuego.
- Deje que las rebanadas de descanso en la cámara durante al menos 1 hora antes de comenzar el experimento. Esto permite la degradación de los tejidos y las células dañadas o moribundas y por lo tanto resulta en una superficie de loncha más limpio. Durante la primera hora, mantener la temperatura de la SPS en la cámara en el intervalo de 34-36 ° C; asegúrese de que las rebanadas no son tocados por las burbujas de aire que pueden dañar las rodajas o hacer flotar.
4. Experimento
- Después de 1 hora, deje que la temperatura de la cámara de recuperación se enfríe a temperatura ambiente (17-25 ° C).
NOTA: Este podría prolongar el período de tiempo durante el cual las rebanadas se pueden utilizar por ralentizar el crecimiento de bacterias, así como el metabolismo celular. Este periodo depende de la región del cerebro y tipo de célula. Por ejemplo, ciertos tipos de células de Golgi se pueden encontrar para estar sano en rodajas8 hr después de cortar mientras que otros tipos durar sólo 6 hr. - Después de 1 hora ha pasado de la corte, utilizar las rodajas de varios experimentos electrofisiológicos.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Rebanadas preparadas en la forma descrita se puede utilizar para diversos experimentos electrofisiológicos y optogenética. En la Figura 3A y 3C, se muestra un ejemplo representativo de una rebanada horizontal cerebelosa cortical y una rebanada coronal cerebral, respectivamente, se observa bajo (DIC) óptica de interferencia diferencial. En el trozo del cerebelo, varios tipos de neuronas del cerebelo pueden ser fácilmente reconocidos por su forma y localización de células del cuerpo, lo q...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Se demuestra un método para la preparación de cortes de cerebro de ratones agudas en lugar de la temperatura fisiológica enfriada con hielo.
Se ha demostrado 11 que la calidad de las rebanadas obtenidas en condiciones de calor es superior en comparación con los preparados con condiciones de frío, a condición de que la cuchilla rebanadora tiene vibración vertical mínima. El rebanar de la temperatura fisiológica puede evitar artefactos fisiológicos causados por la baja temperatura...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer la importante contribución del Dr. Shiwei Huang (Universidad Nacional de Australia) en la validación del método. Además, nos gustaría agradecer a la Sra. Kasia Pietrajtis por sus útiles comentarios sobre las células de Golgi y al Sr. Vitaly Lerner por los datos experimentales de la corteza. Este trabajo contó con el apoyo de PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC e ISF.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentración: 60 mg/ml en solución salina fisiológica. |
| Tijeras grandes | FST | 14001-16 | Cualquier tijera grande o una guillotina con bordes suficientemente afilados se puede utilizar para la decapitación |
| Tijeras de iris | Prestige medical | 48,148 | Se puede usar cualquier tijera de punta fina, siempre que las hojas de las tijeras no sean más largas que 1.5– Pinza |
| punta fina de 2 cm | FST | 11254-20 | |
| Bisturí | FST | 91003-12 | |
| Hoja de bisturí #11 | FST | 10011-00 | |
| Espátula pequeña | Pescador | 2350 | |
| Papel de | Se puede utilizar cualquier marca de laboratorio. | ||
| Placas de Petri | Duroplan | Z231509-1 | |
| Vasos de precipitados de vidrio | Pipeta SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur | Hoja de arce Marca | 14672-029 | |
| Super pegamento | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Cortadora | Campden | 7000-smz | |
| Cuchilla de corte de cerámica | Campden | 7550-1-C | |
| Calentador/agitador | Para calentar el SPS para el procedimiento | ||
| Hervidor | Para calentar agua para el control de temperatura | ||
| Cámara de recuperación de lonchas + unidad de calentamiento | Warner instrumentos | BSC-HT + BSC-BUW | También se pueden utilizar modelos caseros. |
| Termómetro | Para controlar la temperatura SPS durante la disección y el corte |
Referencias
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
