La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Summary

Se describe cómo visualizar macrófagos C. neoformans (Cn) interacciones en tiempo real, con especial énfasis en el proceso de exocitosis no lítico usando microscopía de luz digital. Usando esta técnica de forma individual los macrófagos infectados se puede estudiar para determinar varios aspectos de este fenómeno.

Abstract

Muchos aspectos de la infección de macrófagos por Cryptococcus neoformans han sido ampliamente estudiados y bien definido. Sin embargo, una interacción particular que no se entiende claramente es la exocitosis no lítico. En este proceso, las células de levadura se liberan en el espacio extracelular mediante un mecanismo mal entendido que deja tanto el macrófago y Cn viable. Aquí se describe cómo seguir un gran número de macrófagos infectados individualmente para un período de infección 24 h por microscopía de tiempo transcurrido. Macrófagos infectados se encuentran en una cámara de calentamiento con una atmósfera de CO ₂ unido a un microscopio que ofrece las mismas condiciones que una incubadora de cultivo celular. Microscopía digital de vivo puede proporcionar información acerca de las interacciones dinámicas entre un huésped y patógeno que no está disponible a partir de imágenes estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada puede proporcionar pistas sobre cómo los macrófagos manejan las infecciones por hongos, y viceversa. Esta técnica isa poderosa herramienta en el estudio de las dinámicas que están detrás de un fenómeno complejo.

Introduction

Las fases de una infección por hongos entre las células criptocócica y macrófagos están bien documentados ^1-3. Después de células de levadura son ingeridos por macrófagos, una variedad de interacciones pueden ocurrir: el macrófago puede lisar liberando su carga fúngica en el espacio extracelular, o podría controlar la infección por el mantenimiento de las células de levadura dentro de los confines de su membrana celular ^4. Sin embargo, hace varios años un nuevo resultado fue descrita independientemente por dos grupos: exocitosis no lítico, un proceso en el que un macrófago borrado algunas o todas de las células criptocócica en el ambiente circundante o una célula vecina y ambos huésped y patógeno se mantienen viables ^{5 -8.} Varios estudios han tratado de comprender los mecanismos moleculares detrás de esta interacción, pero todavía no tienen una comprensión completa de lo que impulsa a este fenómeno.

La capacidad para capturar imágenes en tiempo real y luego analizar posteriormente múltiples Infected macrófagos permite responder a muchas preguntas sobre las propiedades físicas que rodean la exocitosis no lítico en cuanto a tiempo, la capacidad espacial, el cambio en la morfología e incluso el estrés de los macrófagos durante una infección por hongos. Al permitir que las células que se encuentran en un entorno que sea comparable a la de una incubadora, podemos vislumbrar la naturaleza dinámica de las interacciones de células de tipo macrófago por hongos. Los investigadores han utilizado esta técnica para estudiar diversos componentes de este proceso. El papel del fagosoma en este proceso se hizo evidente mediante la tinción de actina fluorescente y agentes de bloqueo ^9, mientras que otro grupo utilizó este método para mostrar que la exocitosis no lítico fue bloqueada en las células que han tenido la nucleación WASH dominios de la proteína suprime ^10. El efecto de la señalización de citoquinas también ha sido comprobada mediante microscopía en tiempo real ^11. Este proceso no se limita a C. neoformans como también se ha observado con Candida albicans, another patógeno fúngico que tiene la capacidad de infectar a los macrófagos ^12. Estos hallazgos son ejemplos de cómo este método puede proporcionar una gran cantidad de información a un área que sabemos tan poco.

Protocol

Todo el trabajo de los animales se realizó de conformidad con los reglamentos y directrices del Instituto de Estudios en animales en el Albert Einstein College of Medicine.

1. Crecimiento Condiciones de C. neoformans H99 (serotipo A)

1. Crecer individuo C. neoformans (CN) colonias sobre placas de agar Sabouraud.
2. Un día antes del experimento, seleccione una colonia e inocular 10 ml de caldo de Sabouraud.
3. Permitir que la cultura de crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a una velocidad de 250 rpm.

2 Aislamiento y preparación de Primaria hueso macrófagos de C57 / Bl6 Ratones

1. La eutanasia a los ratones mediante la colocación de los animales en una cámara de CO ₂ hasta que no la respiración por más tiempo. Como segunda medida, cervical dislocar el cuello antes de comenzar la disección. Esterilizar todo el cuerpo con un 70% de alcohol etílico.
2. Retire ambos fémures y los huesos de tibia y colocar en DMEM estéril.
3. Retire el exceso de tejido y músculo de usolicate limpia hasta que los huesos están completamente limpias.
4. Coloque los huesos intactos sólo en una placa de Petri que contiene 70% de alcohol etílico y se incuba durante 3 min para matar los microorganismos asociados. Quitar los huesos y el lugar en el plato de Petri con DMEM estéril.
5. Corte cuidadosamente los extremos de los huesos. Mantenga el hueso largo de un tubo cónico de 50 ml vacías colocado en hielo y enjuague cuidadosamente 10 ml de DMEM frío utilizando una aguja de 25 G a través de cada hueso.
   NOTA: Cada ratón producirá 4 huesos (2 fémures, tibias 2). Por lo tanto un ratón debe producir aproximadamente 40 ml de suspensión celular.
6. Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 650 x g.
7. Durante esta centrifugación, preparar y esterilizar por filtración macrófagos de médula ósea alimentación de los medios de comunicación que consiste en DMEM suplementado con 20% L929, 10% de suero de ternera fetal, 10% NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% HEPES, 1% de L-glutamina , 1% de aminoácidos no esenciales, 0,1% de 2-mercaptoetanol.
8. Resuspender el sedimento resultante con 10 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Pase suspens celularesiones a través de un colador de 70 micras de células para alterar grupos de células y eliminar los residuos de gran tamaño.
9. Placa 1 ml de la suspensión celular en 10 ml de medio de alimentación en placas de Petri que se especifican para el uso de cultivo de tejidos (para un total de 10 placas).
10. Permitir que las células se adhieran a 37 ° C con 10% de CO _2. Añadir 5 ml de medio de alimentación fresca en el día 3 En el día 7, reemplazar por completo los medios de alimentación y los macrófagos están listos para ser utilizados.
11. El día antes del experimento, separar los macrófagos de la placa mediante la eliminación de los medios de alimentación y añadir 5 ml de una célula suave extracción de reactivos a la placa.
12. Incubar durante 5-10 minutos a 37 ° C y retirar los macrófagos con pipeteo suave.
13. Precipitar las células por centrifugación a 650 xg durante 10 min.
14. Resuspender pellet en 1 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Uso de una dilución 1:20, calcular la concentración de los macrófagos pipeteando 10 l de suspensión de células en un hemocitómetro.
15. El uso de 14 mm con fondo de cristal cajas de Petri, plato unconcentración de 1 x 10 ⁵ macrófagos directamente sobre el pozo interior que tiene una capacidad máxima de 200 l, así que tome precauciones para no exceder este volumen, como se muestra en la Figura 4.
16. Permitir que las células se adhieren a la placa de Petri de vidrio mediante la colocación de los platos en un 37 ° C incubadora durante 1 hr.
17. Añadir 1-2 ml de la alimentación de medio suplementado con LPS a 1 mg / ml y IFNg en 500 u / ml y permiten a las células se incuban durante la noche.

3. Co-incubación de primaria murino macrófagos y C. neoformans

1. En el día del experimento, eliminar 1 ml de células de cultivo de levadura y pellet inoculados durante la noche por centrifugación durante 5 min a 420 x g.
2. Lavar las células 3 veces con PBS estéril para eliminar los medios de comunicación y productos criptocócicas extracelulares como el glucuronoxylomanan polisacárido (GXM) a la velocidad y el tiempo mencionado anteriormente.
3. Resuspender sedimento celular en 1 ml de PBS estéril y crea una dilución 1: 100. Pipeta de 10 l de tél dilución en un hemocitómetro y contar las células. Añadir células de levadura a una MOI de 1: 5. Por ejemplo, si hay 1 x 10 ⁵ macrófagos / bien, hacer una suspensión de células de 5 x 10 ⁶ / ml de Cn y añadir 100 ml de esta solución por un importe total de 5 x 10 ⁵ Cn.
4. Añadir el volumen calculado de suspensión de células criptocócica a 1 ml de medio de alimentación con el anticuerpo mAb 18B7 a una concentración de 10 mg / ml. Incubar suspensión de células a temperatura ambiente durante 5 min.
5. Retire el medio de alimentación de fondo de cristal placa de Petri y se lavan con PBS 1x estéril. Añadir 100 l de opsonizado Cn directamente al bien.
6. Permitir que las células se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 10% de CO _2.
7. Después de co-incubación, comprobar al microscopio que los macrófagos han interiorizado Cn. Para ser considerado interiorizado, células criptocócicas claramente deben ser vistos dentro de los confines de los macrófagos.
8. Lave 3x plato de Petri con PBS estéril para eliminar cualquier y toda extracellular Cn.
9. Añadir 1-2 ml de la alimentación de los medios de comunicación sin la adición de mAb 18B7, y establecer microscopio.

4. Visualizing no lítico exocitosis en Utilizando microscopía de luz digital en tiempo real

NOTA: Para realizar estos experimentos, un microscopio que viene con una cámara de incubación adjunto que incluye CO ₂ y la entrega se requiere una unidad de calentamiento.

1. Antes del experimento, pre-calentar la cámara de incubación durante al menos 30 min a 37 ° C. Asegúrese de que la unidad de CO ₂ lee 5% al inicio del experimento.
2. Lugar con fondo de cristal placa de Petri en la plataforma del microscopio, cubrir con CO ₂ tapa y cierre todas las puertas para asegurar que no escapa el calor.
3. Usando el objetivo de 10X con el microscopio de contraste de fase en, se centran en un claro campo de macrófagos infectados. Basado en el experimento, determinar el objetivo utilizado por el número de macrófagos que ser estudiados.
4. Configure el software de microscopio para take una imagen cada 4 minutos durante un período de 24 horas.
5. Después de 24 horas, el experimento habrá llegado a su conclusión y se habrá recogido un total de 361 imágenes. Exportación de estas imágenes como .jpegs a una compresión del 5%. El uso de la imagen J software, ver las imágenes como una pila Visual a los 5 fotogramas por segundo. Si la película tiene que ser vista para su publicación o una presentación, guardarla como tampoco un avi o mov archivo dependiendo del formato funciona mejor para el espectador.

Results

Las imágenes que esta técnica produce pueden ser analizados en una variedad de maneras de recoger información en torno a lo que sucede después de las células han fagocitado C. neoformans. Como se ve en la Figura 1, hay aproximadamente 100 macrófagos que están infectados o no infectados. Cada uno de estos macrófagos da al espectador la oportunidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno en un nivel muy microscópico. Como muestran las figuras 2 y 3 muestra...

Discussion

Aquí hemos descrito un método por el cual las interacciones fúngicas macrófagos pueden ser registradas y analizadas en tiempo real durante un período de 24 h. Nuestro laboratorio ha utilizado este protocolo para estudiar muchos de los aspectos temporales de la exocitosis no lítico y seguirá utilizando microscopía en tiempo real para determinar los componentes morfológicos que rodean este proceso.

Para esta técnica para producir resultados ideales, especial atención se debe dar a ciertos paso...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Agar Dextrosa	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Caldo de Dextrosa	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Berf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Tampón HEPES	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Aminoácidos no esenciales	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoetanol	Invitrogen	21985-023	Tóxico
3003 Placas de Petri de cultivo de tejidos	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Placas de cultivo con fondo de vidrio	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Ratón IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Anticuerpo no comercial producido en nuestro laboratorio
Axiovert 200M Microscopio con cámara de incubación	Zeiss