Se describe cómo visualizar macrófagos C. neoformans (Cn) interacciones en tiempo real, con especial énfasis en el proceso de exocitosis no lítico usando microscopía de luz digital. Usando esta técnica de forma individual los macrófagos infectados se puede estudiar para determinar varios aspectos de este fenómeno.
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Artículo de método
La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos aspectos de la infección de macrófagos por Cryptococcus neoformans han sido ampliamente estudiados y bien definido. Sin embargo, una interacción particular que no se entiende claramente es la exocitosis no lítico. En este proceso, las células de levadura se liberan en el espacio extracelular mediante un mecanismo mal entendido que deja tanto el macrófago y Cn viable. Aquí se describe cómo seguir un gran número de macrófagos infectados individualmente para un período de infección 24 h por microscopía de tiempo transcurrido. Macrófagos infectados se encuentran en una cámara de calentamiento con una atmósfera de CO 2 unido a un microscopio que ofrece las mismas condiciones que una incubadora de cultivo celular. Microscopía digital de vivo puede proporcionar información acerca de las interacciones dinámicas entre un huésped y patógeno que no está disponible a partir de imágenes estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada puede proporcionar pistas sobre cómo los macrófagos manejan las infecciones por hongos, y viceversa. Esta técnica isa poderosa herramienta en el estudio de las dinámicas que están detrás de un fenómeno complejo.
Introducción
Las fases de una infección por hongos entre las células criptocócica y macrófagos están bien documentados 1-3. Después de células de levadura son ingeridos por macrófagos, una variedad de interacciones pueden ocurrir: el macrófago puede lisar liberando su carga fúngica en el espacio extracelular, o podría controlar la infección por el mantenimiento de las células de levadura dentro de los confines de su membrana celular 4. Sin embargo, hace varios años un nuevo resultado fue descrita independientemente por dos grupos: exocitosis no lítico, un proceso en el que un macrófago borrado algunas o todas de las células criptocócica en el ambiente circun....
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Protocolo
Todo el trabajo de los animales se realizó de conformidad con los reglamentos y directrices del Instituto de Estudios en animales en el Albert Einstein College of Medicine.
1. Crecimiento Condiciones de C. neoformans H99 (serotipo A)
- Crecer individuo C. neoformans (CN) colonias sobre placas de agar Sabouraud.
- Un día antes del experimento, seleccione una colonia e inocular 10 ml de caldo de Sabouraud.
- Permitir que la cultura de crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a una velocidad de 250 rpm.
2 Aislamiento y preparación de Primaria hueso macrófagos d....
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Resultados
Las imágenes que esta técnica produce pueden ser analizados en una variedad de maneras de recoger información en torno a lo que sucede después de las células han fagocitado C. neoformans. Como se ve en la Figura 1, hay aproximadamente 100 macrófagos que están infectados o no infectados. Cada uno de estos macrófagos da al espectador la oportunidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno en un nivel muy microscópico. Como muestran las figuras 2 y 3 muestra.......
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Discusión
Aquí hemos descrito un método por el cual las interacciones fúngicas macrófagos pueden ser registradas y analizadas en tiempo real durante un período de 24 h. Nuestro laboratorio ha utilizado este protocolo para estudiar muchos de los aspectos temporales de la exocitosis no lítico y seguirá utilizando microscopía en tiempo real para determinar los componentes morfológicos que rodean este proceso.
Para esta técnica para producir resultados ideales, especial atención se debe dar a ciertos paso.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tenemos que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada en parte por los premios NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sabouraud Agar Dextrosa | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Caldo de Dextrosa | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Berf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Tampón HEPES | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Aminoácidos no esenciales | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoetanol | Invitrogen | 21985-023 | Tóxico |
| 3003 Placas de Petri de cultivo de tejidos | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Placas de cultivo con fondo de vidrio | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Ratón IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Anticuerpo no comercial producido en nuestro laboratorio | ||
| Axiovert 200M Microscopio con cámara de incubación | Zeiss |
Referencias
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal p....
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Reimpresiones y permisos
