Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Resumen

Los modelos de proteinopatía de levadura son herramientas valiosas para evaluar la toxicidad y la agregación de proteínas implicadas en la enfermedad. Aquí, presentamos métodos para la detección de supresores de toxicidad en bibliotecas de variantes de Hsp104. Este protocolo podría adaptarse para analizar cualquier biblioteca de proteínas en busca de supresores de toxicidad de cualquier proteína que sea tóxica en la levadura.

Resumen

Muchos trastornos de mal plegamiento de proteínas se pueden modelar en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Proteínas como TDP-43 y FUS, implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica, y α-sinucleína, implicadas en la enfermedad de Parkinson, son tóxicas y forman agregados citoplasmáticos en la levadura. Estas características recapitulan las patologías proteicas observadas en pacientes con estos trastornos. Por lo tanto, las levaduras son una plataforma ideal para aislar los supresores de toxicidad de las bibliotecas de variantes de proteínas. Estamos interesados en la aplicación de disagregases proteicos para eliminar los conformadores de proteínas tóxicos mal plegados. Específicamente, estamos diseñando Hsp104, una proteína hexámera AAA+ de levadura que es capaz de solubilizar tanto agregados desordenados como amiloide y devolver las proteínas a sus conformaciones nativas. Si bien Hsp104 está altamente conservado en eucariotas y eubacterias, no tiene un homólogo metazoario conocido. Hsp104 solo tiene una capacidad limitada para eliminar agregados desordenados y fibras amiloides implicadas en enfermedades humanas. Por lo tanto, nuestro objetivo es diseñar variantes de Hsp104 para revertir el mal plegamiento de proteínas implicado en los trastornos neurodegenerativos. Hemos desarrollado métodos para cribar grandes bibliotecas de variantes de Hsp104 para la supresión de la proteotoxicidad en levaduras. Dado que las levaduras son propensas a la supresión espontánea e inespecífica de la toxicidad, se ha desarrollado un proceso de cribado de dos pasos para eliminar los falsos positivos. Utilizando estos métodos, hemos identificado una serie de variantes potenciadas de Hsp104 que suprimen de forma potente la toxicidad y la agregación de TDP-43, FUS y α-sinucleína. Aquí, describimos este protocolo optimizado, que podría adaptarse a bibliotecas de cribado construidas utilizando cualquier columna vertebral de proteínas para la supresión de la toxicidad de cualquier proteína que sea tóxica en la levadura.

Introducción

Modelos proteinopatía de levadura se han desarrollado para los trastornos de proteínas misfolding incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y la enfermedad de Parkinson (PD) ^1-3. Expresión de las proteínas TDP-43 y FUS, que se pliegan inadecuadamente en pacientes con ELA, son tóxicos y mislocalize para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^1,2. Del mismo modo, la expresión de α-sinucleína (α-syn), que está implicado en la EP, es tóxico y mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^3. Estas características recapitulan fenotipos en los pacientes con estos trastornos ^4,5. Por lo tanto, los....

Protocolo

1. Biblioteca Generación

1. Para construir bibliotecas de Hsp104 utilizando PCR propensa a error de dominio específico, primero amplificar el dominio de interés con un error de ADN polimerasa propensa ^20.
2. Se purificó el producto de PCR mediante extracción en gel.
3. Realizar un paso de extensión megacebador utilizando un protocolo estándar de mutagénesis dirigida al sitio: combinar plásmido molde 50 ng, 250 ng megacebador, 200 mM dNTPs, y de alta fidelidad de ADN polimerasa en un tampón de PCR, y diluir a 50 l volumen total con agua de grado PCR ²⁰ . Ejecutar un programa de PCR estándar.
   NOTA: cebadores específico....

Resultados

Hemos construido una biblioteca de variantes Hsp104 aleatorios en el dominio medio y se tamiza para la supresión de la TDP-43 toxicidad. La biblioteca se transformó y colocó en placas sobre placas de glucosa y galactosa (Figura 2) para evaluar la severidad de la pantalla. Se seleccionaron colonias individuales y las cepas se seleccionaron usando contador de 5-FOA para eliminar el plásmido Hsp104. Estas cepas se evaluaron entonces para confirmar que la toxicidad era debido a la TDP-43 solo, sin las varia.......

Discusión

Aquí presentamos nuestro enfoque para aislar variantes Hsp104 potenciadas que suprimen la toxicidad de los sustratos de las enfermedades asociadas que utilizan modelos proteinopatía levadura. Usando este enfoque, las grandes bibliotecas de variantes se pueden cribar en alto rendimiento, con la única limitación es el número de variantes que pasan la pantalla secundaria 5-FOA. Mediante la realización de estos pasos en formato de 96 pocillos, se examinan habitualmente hasta 200 hits en un momento en el paso 5-FOA en el tra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Placas de Petri	Falcon	351058
5-Ácido fluorótico	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Placas	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicador tool	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200