Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Resumen

Los modelos de proteinopatía de levadura son herramientas valiosas para evaluar la toxicidad y la agregación de proteínas implicadas en la enfermedad. Aquí, presentamos métodos para la detección de supresores de toxicidad en bibliotecas de variantes de Hsp104. Este protocolo podría adaptarse para analizar cualquier biblioteca de proteínas en busca de supresores de toxicidad de cualquier proteína que sea tóxica en la levadura.

Resumen

Muchos trastornos de mal plegamiento de proteínas se pueden modelar en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Proteínas como TDP-43 y FUS, implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica, y α-sinucleína, implicadas en la enfermedad de Parkinson, son tóxicas y forman agregados citoplasmáticos en la levadura. Estas características recapitulan las patologías proteicas observadas en pacientes con estos trastornos. Por lo tanto, las levaduras son una plataforma ideal para aislar los supresores de toxicidad de las bibliotecas de variantes de proteínas. Estamos interesados en la aplicación de disagregases proteicos para eliminar los conformadores de proteínas tóxicos mal plegados. Específicamente, estamos diseñando Hsp104, una proteína hexámera AAA+ de levadura que es capaz de solubilizar tanto agregados desordenados como amiloide y devolver las proteínas a sus conformaciones nativas. Si bien Hsp104 está altamente conservado en eucariotas y eubacterias, no tiene un homólogo metazoario conocido. Hsp104 solo tiene una capacidad limitada para eliminar agregados desordenados y fibras amiloides implicadas en enfermedades humanas. Por lo tanto, nuestro objetivo es diseñar variantes de Hsp104 para revertir el mal plegamiento de proteínas implicado en los trastornos neurodegenerativos. Hemos desarrollado métodos para cribar grandes bibliotecas de variantes de Hsp104 para la supresión de la proteotoxicidad en levaduras. Dado que las levaduras son propensas a la supresión espontánea e inespecífica de la toxicidad, se ha desarrollado un proceso de cribado de dos pasos para eliminar los falsos positivos. Utilizando estos métodos, hemos identificado una serie de variantes potenciadas de Hsp104 que suprimen de forma potente la toxicidad y la agregación de TDP-43, FUS y α-sinucleína. Aquí, describimos este protocolo optimizado, que podría adaptarse a bibliotecas de cribado construidas utilizando cualquier columna vertebral de proteínas para la supresión de la toxicidad de cualquier proteína que sea tóxica en la levadura.

Introducción

Modelos proteinopatía de levadura se han desarrollado para los trastornos de proteínas misfolding incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y la enfermedad de Parkinson (PD) ^1-3. Expresión de las proteínas TDP-43 y FUS, que se pliegan inadecuadamente en pacientes con ELA, son tóxicos y mislocalize para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^1,2. Del mismo modo, la expresión de α-sinucleína (α-syn), que está implicado en la EP, es tóxico y mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^3. Estas características recapitulan fenotipos en los pacientes con estos trastornos ^4,5. Por lo tanto, los modelos de levadura proporcionan una plataforma útil para la detección de proteínas o moléculas pequeñas que prevenir o revertir estos fenotipos ^2,6-13. Estamos interesados ​​en el desarrollo de las proteínas que son capaces de revertir la agregación y la toxicidad debido a la TDP-43, FUS, y α-syn. Nos centramos en Hsp104, un AAA + proteína de la levadura que es el único capaz de desagregar las proteínas tanto fragregados amorfos om y amiloide en la levadura, sin embargo, no tiene homólogo humano ^14,15. Hsp104 está bien afinado para desagregar los priones de levadura endógenos y sólo tiene una capacidad limitada para desagregar sustratos implicados en enfermedades neurodegenerativas humanas, que nunca encuentra con ordinariamente ^16,17. Por lo tanto, nuestro objetivo es diseñar versiones mejoradas de Hsp104 que son capaces de desagregar eficazmente estos sustratos humanos. Para ello, construimos grandes bibliotecas de variantes Hsp104 usando PCR propensa a errores; estas bibliotecas se pueden cribar utilizando los modelos proteinopatía levadura ^17. Hemos adoptado un enfoque de dominio orientados a la construcción y selección de bibliotecas, como Hsp104 es muy grande ^17. Al principio nos centramos en el dominio del medio (MD) de Hsp104 ^17, aunque los enfoques similares pueden ser empleados para detectar otros dominios. Estos modelos permiten la detección de la actividad disaggregase directamente, en contraposición a las técnicas alternativas tales como la presentación en superficie, que es el descansoricted utilizar para el seguimiento de la unión ^18.

Nuestro protocolo se basa en dos pasos de detección (Figura 1). En primer lugar, se seleccionan variantes Hsp104 que suprimen la toxicidad del sustrato enfermedad en la levadura. Para ello, la Hsp104 variantes y la enfermedad asociada sustrato se cotransformación de la levadura Hsp104 Δ. Empleamos Δ Hsp104 levadura para explorar Hsp104 secuencia espacio en ausencia de tipo salvaje (WT) Hsp104 ^17. Es importante destacar que, la supresión de Hsp104 no afecta α-syn, FUS, o TDP-43 toxicidad en la levadura, y la expresión de Hsp104 ^WT proporciona mínima de rescate ^1,13,17. La levadura está chapada a continuación, en la inducción de los medios de comunicación para inducir la expresión de ambas proteínas. La levadura que alberga variantes Hsp104 que suprimen la toxicidad del crecimiento confieren sustrato asociado a la enfermedad de la colonia. Estas variantes se seleccionan para su posterior análisis, mientras que el mantenimiento de colonias variantes que no suprimen troquel toxicidad. Sin embargo,falsos positivos son un problema importante en esta pantalla. Expresión de TDP-43, FUS, y α-syn son altamente tóxicos, que crea una fuerte presión selectiva para la aparición de supresores genéticos espontáneos de la toxicidad no relacionada con la variante de Hsp104 ser expresado. Por lo tanto, hemos utilizado una pantalla secundaria que es también relativamente de alto rendimiento para eliminar estos supresores de toxicidad no específica ^17. En esta pantalla secundaria, levadura seleccionada se tratan con Fluorootic 5-ácido (5-FOA) para contrarrestar seleccione para el plásmido Hsp104 ^19. Las cepas se evaluaron entonces por el sustrato (TDP-43, FUS, o α-syn) toxicidad a través de la detección de ensayo para asegurarse de que la toxicidad del sustrato se restaura después de la pérdida del plásmido Hsp104. Por lo tanto, la levadura en la que la toxicidad se restaura en esta pantalla secundaria presumiblemente originalmente muestra la supresión de toxicidad debido a la presencia de la variante de Hsp104. Estas levaduras se designan como "hits" y el plásmido Hsp104 debe entonces serrecuperado y secuenciado para identificar las mutaciones en el gen Hsp104 ¹⁷ (Figura 1). Cualquier resultado debe entonces ser reconfirmados mediante la construcción de la mutación de forma independiente mediante mutagénesis dirigida al sitio y luego volver a probar para la supresión de la toxicidad. Las aplicaciones potenciales de este protocolo son amplias. Usando estos métodos, las bibliotecas de cualquier tipo de proteína podrían ser examinados para variantes que suprimen la toxicidad de cualquier proteína sustrato que es tóxico en la levadura.

Protocolo

1. Biblioteca Generación

1. Para construir bibliotecas de Hsp104 utilizando PCR propensa a error de dominio específico, primero amplificar el dominio de interés con un error de ADN polimerasa propensa ^20.
2. Se purificó el producto de PCR mediante extracción en gel.
3. Realizar un paso de extensión megacebador utilizando un protocolo estándar de mutagénesis dirigida al sitio: combinar plásmido molde 50 ng, 250 ng megacebador, 200 mM dNTPs, y de alta fidelidad de ADN polimerasa en un tampón de PCR, y diluir a 50 l volumen total con agua de grado PCR ²⁰ . Ejecutar un programa de PCR estándar.
   NOTA: cebadores específicos usados ​​variará dependiendo de la región particular del gen que se va a amplificar.
   1. Tras la PCR, digerir ADN molde parental con 1 l de enzima de restricción Dpn I durante 2 horas a 37 ° C.
4. Transformar la biblioteca por electroporación u otros medios en Ultracompetent E. coli y purificarla por miniprep.
   NOTA: generación Bibliotecavaría dependiendo sustancialmente a los objetivos de un determinado experimento. Hsp104 es una proteína muy grande, por lo que es poco práctico para aleatorizar todo el gen, por lo que utilizamos error de dominio específico PCR propensa. Además, la estructura de Hsp104 sigue siendo poco conocida, por lo que el diseño de bibliotecas dirigidas desafiantes ^21. Las bibliotecas pueden ser construidos usando enfoques dirigidos o aleatorios a mutagénesis, con la única restricción es que el esqueleto plasmídico plantilla debe contener el gen URA3 para permitir la 5-FOA selección del contador en medios de dextrosa.

2. Transformación de la Biblioteca Hsp104

1. Integrar el sustrato asociado a la enfermedad en W303aΔ Hsp104 levadura utilizando un / protocolo de transformación PEG acetato de litio estándar ^22. Seleccione colonias individuales y detectar ellos para la toxicidad para aislar una cepa con alta toxicidad de la enfermedad sustrato ²³ asociados.
   NOTA: Utilice una cepa integrado y isolaTé a sola colonia para garantizar la igualdad de expresión en todas las células. Clonar el sustrato de la enfermedad en un plásmido que permite la integración del gen bajo cualquier marcador que no sea uracilo (usamos histidina) y la biblioteca Hsp104 en el plásmido pAG416GAL (marcador de uracilo) ^24. Para permitir la 5-FOA contraselección, asegúrese de que la biblioteca se expresa a partir de un plásmido con el marcador de uracilo. Otras cepas de levadura también pueden ser empleados. Hemos tomado nota de un fenotipo de supresión de toxicidad similar usando W303a y BY4741 cepas de levadura en ambos WT y Δ Hsp104 fondos (MEJ y JS, observaciones no publicadas).
2. Transformar la biblioteca Hsp104 en esta cepa usando la misma acetato de litio / protocolo de transformación PEG ^22. Aumentar la escala de la transformación apropiada para mantener el espacio de secuencia de la biblioteca y para preservar el tamaño de la biblioteca predicho.
3. Placa de la mezcla de transformación en noninducing, placas selectivas (por ejemplo, SD-Su-Ura) con suficientes platos aasegurar el crecimiento de un gran número de colonias. El uso de grandes placas de Petri (150 mm) para minimizar el número de placas necesarias. La recuperación de los transformantes utilizando placas permite la eficiencia de transformación que deben evaluarse.
4. Transformar Hsp104 ^WT y controles negativos vector en paralelo.

3. La detección de represión de Proteotoxicity

1. Lávese las colonias de las placas utilizando rafinosa complementado los medios de comunicación de abandono (por ejemplo Sraff-Su-Ura). Utilice una pipeta serológica y aplicadores de madera estériles para aflojar las colonias de las placas. Transferir los lavados líquidos a un tubo cónico de 50 ml y agitar a fondo para separar los grumos de células. Diluir a una cultura ligeramente nublado, OD ₆₀₀ ~ 0,025.
   NOTA: Aquí rafinosa sirve para aliviar las células de la represión mediada por la glucosa de la inducción, las células de cebado por lo tanto para la inducción mediada por galactosa.
2. Mantener el cultivo diluido durante la noche en los medios de comunicación de abandono rafinosa con agitación a 30 ºC. Crecer el Hsp104 ^WT y controles vectoriales en paralelo.
3. A la mañana siguiente, la placa de un rango de concentraciones Onto galactosa individual (por ejemplo SGal-Su-Ura) placas (1 mu l a 2 ml concentrado cultura en 400 l de volumen total). Plating una amplia gama de concentraciones se asegurará de que una placa tendrá colonias individuales. La concentración real requerida depende de la toxicidad del sustrato enfermedad de interés.
4. Normalizar el vector y las culturas Hsp104 ^WT a la OD ₆₀₀ de la biblioteca y la placa volúmenes iguales al comparar el crecimiento de la biblioteca con respecto a los controles.
5. Para evaluar la selección rigor, la placa de la biblioteca en la glucosa (represión) los medios de comunicación. Incubar las placas durante 2-3 días a 30 ° C, hasta que las colonias aparecen (Figura 2). Evaluar las colonias resultantes y comparar con los controles.
   NOTA: A menudo se obtienen ambas colonias grandes y pequeñas, pero no hay correlación entre el tamaño de la colonia y actuarse observa ividad. Pantalla estos posibles éxitos utilizando una técnica de selección de contador 5-FOA (Paso 4) para minimizar los falsos positivos prorrogados para secuenciación.

4. 5-FOA contraselección y Spotting para eliminar falsos positivos

1. Streak cabo colonias individuales en duplicado sobre doble y una individual (por ejemplo, los medios de comunicación de abandono SD-Su-Ura y SD-Sus placas) y crecer durante la noche a 30 ºC. Repita el procedimiento con los controles vectoriales y Hsp104 ^WT. Plating en SD-His antes de la 5-FOA aumenta la eficacia de la etapa 5-FOA mediante el aumento de la probabilidad de que las células se han perdido el plásmido Hsp104 cuando se sembraron en 5-FOA.
2. Para evitar que las placas se seque, envuelva la placas en parafina Sus-Ura-SD y almacenar a 4 ° C en el desempeño de la pantalla de 5-FOA. Estas placas eventualmente ser utilizados para la secuenciación.
3. Racha de las colonias de la SD-Sus placas a colonias individuales en placas 5-FOA (YPD medios + 1g / L 5-FOA) y se incuba durante 1-2 días a 30 y# 186; C hasta que aparezca colonias individuales. Aquí, 5-FOA se convierte en un producto tóxico (5-fluorodesoxiuridina) en las células que contienen el gen URA3. Por lo tanto, las células que albergan el plásmido todavía Hsp104 morirán.
4. Racha de las colonias aisladas de las placas 5-FOA en duplicado sobre SD-Ura y SD-Sus placas. Prueba 3 colonias para cada golpe para aumentar la probabilidad de que al menos una colonia de cada golpe se habrá perdido el plásmido Hsp104. Incubar durante 1-2 días a 30 ° C. Las colonias que han perdido el plásmido Hsp104 crecerá en SD-Sus placas pero no las placas SD-ura.
5. Crecer las cepas que han perdido los plásmidos Hsp104 para observar los ensayos. Crecer las cepas a la saturación en rafinosa medios de deserción escolar (por ejemplo Sraff-Su) en 96 pozos profundos 2 placas ml durante la noche a 30 ° C con agitación. Asegúrese de incluir las cepas de control de 5-FOA tratados.
6. Preparar placas para la detección de ensayo. Con una pipeta multicanal, alícuota de 200 l rafinosa medios de deserción escolar (por ejemplo Sraff-His) porpocillo de una placa de 96 pocillos, reservando las columnas 1 y 7 para las culturas aseados. Alícuota de 250 l de cada uno de los 16 cultivos saturados en las columnas 1 y 7 de la placa.
7. En serie diluir las culturas 5 veces en cada columna de la placa, mezclando completamente con una pipeta multicanal. Retire 50 l de cultivo diluido de las columnas 6 y 12 para garantizar el volumen final de cada pocillo es de 200 l. Esto es esencial para asegurar una formación de manchas.
8. Con una herramienta de replicador de 96 perno (Frogger), manchar las culturas por duplicado en SD-His y SGal-Sus placas. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-3 días.
9. Seleccionar para secuenciar cepas que exhiben toxicidad en los SGal-His placas similares a la de los controles. Deseche cepas como falsos positivos que no son tan tóxicos como los controles. 5-FOA es también a menudo tóxicos por sí mismo, por lo deseche cepas que exhiben un defecto de crecimiento en SD-Sus placas o que presentan sustancialmente mayor toxicidad que el sustrato (enfermedad por sí sola Figura 3).

5. La secuenciación del Hsp104 variantes mediante PCR de colonias

1. Raspe ~ 10 l de levadura de las placas SD-His-ura en NaOH 3 l 20 mM en tubos de PCR de tira y lisar las células por congelación-descongelación. Colocar los tubos de la tira en un congelador -80 ºC durante 10 min o en nitrógeno líquido, a continuación, se incuba a 99 ºC en un termociclador durante 10 min. Diluir las cepas de 100 l con agua de calidad PCR.
2. Prepare las reacciones de PCR: 5 l plantilla de PCR, 0,5 mu l de 100 mM de cada cebador, 0,5 l de 10 mM dNTPs, DNA polimerasa 0,25 l en tampón de PCR, y completar hasta 25 l volumen total con agua grado PCR. Diseño cebadores para amplificar la región aleatorizada más aproximadamente 100 pb en cada extremo. Minimizar el tamaño de la región amplificada para aumentar la probabilidad de éxito de la amplificación. Ejecutar un programa de PCR estándar.
3. Analizar las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar la amplificación de un producto de PCR de la siz apropiadoe. Repita la PCR si hay producto está presente.
   NOTA: el fracaso de PCR suele ser debido a un exceso de levadura que se utiliza en el paso 5.1.
4. Preparar las muestras para la secuenciación de ADN. Retire cebadores de PCR, ya sea por purificación de PCR o usando un reactivo de limpieza producto de PCR tales como exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón enzima (ExoSAP-IT) para degradar el ADN de cadena sencilla. Este reactivo degrada enzimáticamente los cebadores no incorporados y dNTPs, lo que permite un mayor rendimiento.
5. Secuenciar los productos de PCR. Asegúrese de analizar a fondo cromatogramas de secuenciación para detectar mutaciones. Las mutaciones pueden ser observadas como una mezcla de dos nucleótidos en un sitio dado (Figura 4), ​​como la levadura a menudo albergar múltiples plásmidos.

Resultados

Hemos construido una biblioteca de variantes Hsp104 aleatorios en el dominio medio y se tamiza para la supresión de la TDP-43 toxicidad. La biblioteca se transformó y colocó en placas sobre placas de glucosa y galactosa (Figura 2) para evaluar la severidad de la pantalla. Se seleccionaron colonias individuales y las cepas se seleccionaron usando contador de 5-FOA para eliminar el plásmido Hsp104. Estas cepas se evaluaron entonces para confirmar que la toxicidad era debido a la TDP-43 solo, sin las varia...

Discusión

Aquí presentamos nuestro enfoque para aislar variantes Hsp104 potenciadas que suprimen la toxicidad de los sustratos de las enfermedades asociadas que utilizan modelos proteinopatía levadura. Usando este enfoque, las grandes bibliotecas de variantes se pueden cribar en alto rendimiento, con la única limitación es el número de variantes que pasan la pantalla secundaria 5-FOA. Mediante la realización de estos pasos en formato de 96 pocillos, se examinan habitualmente hasta 200 hits en un momento en el paso 5-FOA en el tra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Placas de Petri	Falcon	351058
5-Ácido fluorótico	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Placas	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicador tool	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200