Introduction
Gjær proteinopathy modeller har blitt utviklet for protein misfolding lidelser inkludert amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) 1-3. Uttrykk av proteiner TDP-43 og FUS, som misfold ALS pasienter, er giftige og mislocalize å danne cytoplasmatiske aggregater i gjær 1,2. Tilsvarende ekspresjon av α-synuclein (α-syn), som er implisert i PD, er giftig og mislocalizes til å danne aggregater i gjær cytoplasmatiske 3. Disse funksjonene rekapitulere fenotyper hos pasienter med disse lidelsene 4,5. Dermed gjær modellene gir en nyttig plattform for screening for proteiner eller små molekyler som hindrer eller reversere disse fenotyper 2,6-13. Vi er interessert i utviklingen av proteiner som er i stand til å reversere aggregering og toksisitet på grunn av TDP-43, FUS, og α-syn. Vi fokuserer på Hsp104, en AAA + protein fra gjær som er unikt i stand til disaggregating proteiner både frOM amorfe aggregater og amyloid i gjær, men det har ingen menneskelig homologue 14,15. Hsp104 er finjustert til disaggregert endogene gjær prioner og har bare begrenset evne til å disaggregert underlag innblandet i menneske nevrodegenerative sykdommer, som det aldri vanligvis møter 16,17. Dermed har vi som mål å konstruere forbedrede versjoner av Hsp104 som er i stand til å efficaciously disaggregert disse menneskelige underlag. For å gjøre dette, vi konstruere store biblioteker av Hsp104 varianter bruker feilutsatt PCR; Disse bibliotekene kan screenes ved hjelp av gjær proteinopathy modellene 17. Vi har vedtatt en domene målrettet tilnærming til å konstruere og screening biblioteker, som Hsp104 er veldig stort 17. Vi innledningsvis fokusert på midten domene (MD) av Hsp104 17, selv om lignende metoder kan anvendes for å screene andre domener. Disse modellene muliggjør screening for aktivitet disaggregase direkte, i motsetning til alternative teknikker så som overflate skjerm, som er restenricted å bruke for å overvåke binding 18.
Vår protokollen er basert på to screeningfremgangsmåten (figur 1). Først blir Hsp104 varianter som undertrykker giftigheten av sykdommen substrat i gjær valgt. For å gjøre dette, varianter av Hsp104 og sykdomsassosierte underlaget er kotransformert inn Δ hsp104 gjær. Vi ansetter Δ hsp104 gjær å utforske Hsp104 sekvens plass i fravær av villtype (WT) Hsp104 17. Viktigere, ikke sletting av Hsp104 ikke påvirke α-syn, FUS, eller TDP-43 toksisitet i gjær, og uttrykk for Hsp104 WT gir minimal redning 1,13,17. Gjæren blir deretter sådd ut på induserende medier for å indusere ekspresjon av begge proteinene. Gjær husing Hsp104 varianter som undertrykker toksisitet av sykdomsassosierte substrat konferere vekst av kolonien. Disse variantene er valgt for videre analyse, mens kolonier opprettholde varianter som ikke undertrykker toksisitet dø. Imidlertidfalske positiver er et betydelig problem i dette skjermbildet. Uttrykk for TDP-43, FUS, og α-syn er svært giftige, noe som skaper et sterkt seleksjonspress for utseendet på spontane genetiske undertrykkere av toksisitet relatert til Hsp104 variant blir uttrykt. Således har vi benyttet en sekundær skjerm som også er relativt høy gjennomstrømning for å eliminere disse ikke-spesifikke toksisitet 17 suppressorer. I denne sekundære skjermen, velges gjær behandlet med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) for å motvirke velger for Hsp104 plasmid 19. Stammene blir så vurdert for substratet (TDP-43, FUS, eller α-syn) toksisitet via spotting assay for å sikre at giftigheten av substratet er gjenopprettet etter tap av den Hsp104 plasmidet. Således gjær hvori toksisitet er gjengitt i denne andre screening formodentlig opprinnelig viste undertrykkelse toksisitet på grunn av tilstedeværelsen av Hsp104 variant. Disse gjær er utpekt som "treff" og Hsp104 plasmid bør da væregjenvunnet og sekvensert for å identifisere de mutasjoner i genet Hsp104 17 (figur 1). Eventuelle treff bør da bli bekreftet ved å konstruere mutasjonen uavhengig ved hjelp seterettet mutagenese og deretter retesting for toksisitet undertrykkelse. De potensielle bruksområder for denne protokollen er brede. Ved hjelp av disse metodene, kan biblioteker av en hvilken som helst type protein bli screenet for varianter som undertrykker toksisitet av en hvilken som helst substrat protein som er toksisk i gjær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bibliotek Generation
- Å konstruere biblioteker av Hsp104 bruker domenespesifikke feilutsatt PCR, først forsterke domenet av interesse med en feil utsatt DNA polymerase 20.
- Rens det PCR-produktet ved gel-ekstraksjon.
- Utfør en megaprimer forlengelse trinn ved hjelp av en standard seterettet mutagenese protokoll: kombinere 50 ng mal plasmid, 250 ng megaprimer, 200 mikrometer dNTPs, og high-fidelity DNA polymerase i PCR buffer, og fortynn til 50 pl totalvolum med PCR grade vann 20 . Kjør en standard PCR-programmet.
MERK: Spesifikke primere som brukes vil variere basert på den spesielle region av genet som skal bli amplifisert.- Etter PCR, fordøye foreldre templat-DNA med 1 mikroliter DPN I restriksjonsenzym i 2 timer ved 37 ° C.
- Transform biblioteket ved electroporation eller andre midler i ultracompetent E. coli og rense den ved miniprep.
MERK: Library generasjonvarierer betydelig, basert på målene for et gitt eksperiment. Hsp104 er et veldig stort protein, så det er upraktisk å random hele genet, og det er derfor vi bruker domenespesifikke feil utsatt PCR. I tillegg, forblir strukturen av Hsp104 dårlig forstått, noe som gjør utformingen av rettede biblioteker utfordrende 21. Biblioteker kan bli konstruert ved å bruke rettet eller tilfeldig mutagenese tilnærminger til, med den eneste begrensning er at malen plasmid ryggrad bør inneholde URA3-genet for å tillate 5-FOA telleren utvalg på dekstrose medier.
2. Transformasjon av Hsp104 Library
- Integrere sykdomsassosierte substrat inn W303aΔ hsp104 gjær hjelp av en standard litiumacetat / PEG transformasjon protokoll 22. Velg enkeltkolonier og skjerme dem for toksisitet å isolere en stamme med høy giftighet av sykdommen forbundet underlaget 23.
MERK: Bruk en integrert belastning og isolate en enkelt koloni for å sikre lik ekspresjon i alle celler. Klone sykdommen underlaget inn i et plasmid som tillater integrering av genet under noe annet enn uracil markør (vi bruker histidin) og Hsp104 biblioteket inn i pAG416GAL plasmid (uracil markør) 24. Å tillate for 5-FOA counterselection, sørge for at biblioteket er uttrykt fra et plasmid med uracil markør. Andre gjær-stammer kan også anvendes. Vi har merket en lignende toksisitet undertrykkelse fenotype hjelp W303a og BY4741 gjærstammer i både WT og Δ hsp104 bakgrunner (mej og JS, upubliserte observasjoner). - Transform Hsp104 biblioteket til denne belastningen ved hjelp av samme litiumacetat / PEG transformasjon protokoll 22. Skalere opp transformasjonen hensiktsmessig å opprettholde sekvensen plass av biblioteket og for å bevare den forutsagte bibliotekstørrelse.
- Plate forvandlingen blandingen på noninducing, selektive plater (f.eks SD-His-Ura) bruker nok plater tilsikre vekst av et stort antall kolonier. Bruke store petriskåler (150 mm) for å minimere antall plater som trengs. Gjenopprette trans bruker plater tillater transformasjon effektivitet skal vurderes.
- Transform Hsp104 WT og vektor negative kontroller parallelt.
3. Screening for bekjempelse av Proteotoxicity
- Vask koloniene utenfor platene ved hjelp raffinose supplert dropout medier (f.eks sraff-His-Ura). Bruk en serologisk pipette og sterile tre applikatorer å løsne kolonier fra platene. Overfør de flytende vaskinger i et 50 ml konisk rør og virvle grundig for å separere eventuelle klumper av celler. Spe til en litt overskyet kultur, OD 600 ~ 0,025.
MERK: Her raffinose tjener til å avlaste de celler av glukose-mediert represjon av induksjon, og dermed priming cellene for galaktose-mediert induksjon. - Grow fortynnet kultur over natten i raffinose dropout media med risting på tre0 ºC. Grow Hsp104 WT og vektor kontroller parallelt.
- Følgende morgen, plate en rekke konsentrasjoner over på individuell galaktose (f.eks SGal-His-Ura) plater (1 mikroliter til 2 ml konsentrert kultur i 400 mL totalt volum). Plettering av et bredt spekter av konsentrasjoner vil sikre at en plate skal ha enkeltkolonier. Den faktiske konsentrasjon som er nødvendig avhenger av giftigheten av sykdommen substratet av interesse.
- Normalisere vektoren og Hsp104 WT kulturer til OD 600 av biblioteket og plate like volumer for å sammenligne veksten av biblioteket i forhold til kontrollene.
- For å vurdere valg stringens, plate biblioteket på glukose (undertrykke) media. Inkuber platene i 2-3 dager ved 30 ° C, inntil kolonier til syne (figur 2). Vurdere de resulterende kolonier og sammenlign med kontrollene.
MERK: Ofte både store og små kolonier oppnås, men ingen sammenheng mellom kolonistørrelse og handleivity er observert. Screen disse potensielle hits ved hjelp av en 5-FOA teller utvalg teknikk (Trinn 4) for å minimalisere falske positiver overført til sekvensering.
4. 5-FOA Counterselection og Spotting å eliminere falske positiver
- Streak ut enkeltkolonier i to eksemplarer over på doble og enkle dropout media (f.eks SD-His-Ura og SD-Hans plater) og vokse over natten ved 30 ºC. Gjenta med vektor- og Hsp104 WT kontroller. Utsåing på SD-His før 5-FOA øker effektiviteten av 5-FOA trinn ved å øke sannsynligheten for at cellene vil ha mistet plasmidet Hsp104 når de er belagt på 5-FOA.
- For å hindre at platene tørker ut, vikle SD-Hans-Ura plater i parafilm og oppbevar ved 4 ºC mens du utfører 5-FOA skjermen. Disse plater vil etter hvert bli benyttet for sekvensering.
- Streak koloniene fra SD-Hans platene til enkeltkolonier på 5-FOA plater (YPD media + 1 g / L 5-FOA) og inkuber i 1-2 dager ved 30 &# 186; C til enkeltkolonier vises. Her blir 5-FOA omdannet til et toksisk produkt (5-fluordeoksyuridin) i celler som inneholder URA3-genet. Dermed vil alle cellene fortsatt skjuler den Hsp104 plasmid dø.
- Streak enkelt kolonier fra 5-FOA plater i to eksemplarer over på SD-Ura og SD-Hans plater. Test 3 kolonier for hver skjøt for å øke sannsynligheten for at minst én koloni for hvert treff vil ha mistet Hsp104 plasmidet. Inkuber i 1-2 dager ved 30 ° C. Kolonier som har mistet Hsp104 plasmid vil vokse på SD-Hans plater, men ikke SD-Ura plater.
- Grow stammene som har mistet de Hsp104 plasmider for spotting analyser. Grow stammene til metning i raffinose dropout medier (f.eks sraff-Hans) i 96 Deepwell 2 ml plater over natten ved 30 ºC med risting. Sørg for å inkludere de fem-FOA behandlet kontrollstammer.
- Forbered plater for spotting analysen. Ved hjelp av en flerkanals pipette, delmengde 200 mL raffinose dropout medier (f.eks sraff-Hans) perbrønn av en 96-brønners plate, reservere kolonnene 1 og 7 for de pene kulturer. Alikvoter 250 ul av hver av de 16 mettede kulturer i kolonner 1 og 7 av platen.
- Serielt fortynnet kulturene 5 fold i hver kolonne av platen, blandes grundig med en multikanal pipette. Fjern 50 ul av den fortynnede kultur fra kolonnene 6 og 12 for å sikre at det endelige volum på hver brønn er 200 ul. Dette er viktig for å sikre enda spotting.
- Ved hjelp av en 96-bolt portreplikator verktøy (Frogger), spot kulturer i duplikat på SD-Hans og SGal-Hans plater. Inkuber platene ved 30 ° C i 2-3 dager.
- Velge ut for sekvensering av stammer som utviser toksisitet på SGal-His platene som ligner den av kontrollene. Forkaste som falske positiver stammer som ikke er like giftige som kontrollene. 5-FOA er også ofte toksiske i seg selv, så forkaste stammer som oppviser en vekst defekt på SD-His eller plater som oppviser vesentlig større toksisitet enn sykdommen substrat (alene
5. sekvensering av Hsp104 Varianter av Colony PCR
- Skrap ~ 10 mL gjær fra SD-His-Ura plater i 3 mL 20 mM NaOH i PCR strip rør og lysere cellene ved fryse-tine. Plasser strippe rør i en -80 ° C fryser i 10 minutter eller i flytende nitrogen, og deretter inkuberes ved 99 ° C i en termosykler i 10 min. Fortynne stammer til 100 mL med PCR grade vann.
- Forbered PCR reaksjoner: 5 mL PCR mal, 0,5 mL 100 mikrometer hver primer, 0,5 mL 10 mM dNTPs, 0,25 pl DNA polymerase i PCR buffer, og fyll opp til 25 pl totalvolum med PCR grade vann. Design primere for å amplifisere den randomiserte regionen pluss omtrent 100 bp på hver ende. Minimalisere størrelsen av det amplifiserte regionen for å øke sannsynligheten for vellykket amplifikasjon. Kjør en standard PCR-programmet.
- Analysere prøver ved agarosegel-elektroforese for å bekrefte PCR-amplifisering fra et produkt av det passende size. Gjenta PCR hvis ingen produktet er til stede.
MERK: PCR svikt er vanligvis på grunn av for mye gjær som brukes i trinn 5.1. - Forbered prøver for DNA-sekvensering. Fjern PCR-primere enten ved hjelp av PCR-rensing eller ved anvendelse av en PCR-produkt opprydding reagens slik som Exonuklease I og alkalisk rekefosfatase enzym (ExoSAP-IT) for å nedbryte enkelt-trådet DNA. Denne reagensen enzymatisk degraderer uinkorporerte primere og dNTPs, noe som åpner for høyere gjennomstrømning.
- Sekvensere PCR produktene. Pass på å grundig analysere sekvense kromatogrammene for mutasjoner. Mutasjoner kan bli observert som en blanding av to nukleotider på et gitt område (figur 4), som gjær ofte multiple plasmider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har konstruert et bibliotek av Hsp104 varianter randomiserte midt-domenet og screenet for undertrykkelse av det TDP-43 toksisitet. Biblioteket ble transformert, og sådd ut på plater glukose og galaktose (figur 2) for å vurdere stringensen av skjermen. Enkle kolonier ble utvalgt og stammene ble valgt ved hjelp av telleren 5-FOA å eliminere Hsp104 plasmidet. Disse stammene ble så vurdert for å bekrefte at toksisitet skyldtes TDP-43 alene, uten Hsp104 varianter. Spotting analyser av en delmengde av de varianter som er valgt i den første skjermen viste at av de fire utvalgte kolonier, 2 vises Hsp104-mediert TDP-43 toksisitet suppresjon, 1 var en falsk positiv, og en forbedret vist toksisitet etter 5 FOA-behandlingen (figur 3). De to sanne treff ble deretter sekvensert ved koloni-PCR for å identifisere de mutasjoner midtre domene (figur 4). Når disse mutasjoner ble identifisert, ble den Hsp104 mutasjon konstruert nytt i foreldre Hsp104 plasmid ved seterettet mutagenese for å bekrefte toksisitet undertrykkelse. Varianter valgt ved hjelp av disse metodene ble senere bekreftet å undertrykke aggregering i gjær, klare prefabrikerte aggregater i biokjemiske analyser, og undertrykke dopaminerge neurodegeneration i en C. elegans modell av PD 17.
Figur 1:. Flow-chart for å isolere potensierte Hsp104 varianter Hsp104 bibliotek (URA3 markør, GAL1 promoter) blir forvandlet i gjær som inneholder sykdoms substrater (HIS3 markør, GAL1 promoter) og screenet for toksisitetsdempere ved plating på induserende medier. Potensielle hits blir deretter screenet igjen ved hjelp av en 5-FOA counterselection skritt for å eliminere uspesifikke toksisitetsdempere. Varianter som er valgt i dette andre trinn blir deretter sekvensert ved koloni-PCR. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Screening for toksisitet dempere Gjær kotransformert med pAG303GAL-TDP-43 og pAG416GAL-Hsp104 biblioteket ble platet på glukose (repressing) eller galaktose (indusere) media. TDP-43 er svært giftig, så svært få Hsp104 varianter er i stand til å undertrykke dette toksisitet, og denne skjermen er svært strenge. Enkeltkolonier er valgt som treffer fra galaktose plate for fem-FOA sekundær skjerm. Både store og små kolonier er vanligvis oppnås, men vi har ikke observert noen trender som dikterer hvordan kolonistørrelse korrelerer med aktivitet.
s.jpg "/>
Figur 3: 5.-FOA sekundær skjerm Gjær behandlet med 5-FOA å motvirke velger for Hsp104 plasmid ble vurdert ved å fange opp analysen. Stammene ble dyrket i sraff-Hans media, seriefortynnes fem ganger, og oppdaget i duplikat på SD-Hans og SGal-Hans plater. Hsp104 A503V er en ekte hit som vi tidligere har verifisert og viser her som en kontroll sammen med vektor alene 17. Rader 3 og 4 er bibliotek hits som beholder TDP-43 forgiftning etter tapet av Hsp104 lyddemper. Rad 5 viser en falsk positiv, der TDP-43 ikke lenger er giftige, slik at en ikke-spesifikk toksisitet suppressor er til stede. Rad 6 viser en stamme som er mer toksisk enn TDP-43 typisk er, muligens på grunn av 5-FOA toksisitet. Denne belastningen kan fortsatt bli sekvensert, men kan ikke være en gyldig hit.
Figur 4. Analyzing sekvense resultater. Valgt gjær inneholder ofte flere plasmider. Derfor, etter sekvensering av koloni PCR-produkter, omsorg må tas for å sikre eventuelle mutasjoner er ikke oversett i kromatogrammene. I dette kromatogram, kunne to potensielle mutasjoner (angitt med *) bli oversett. I det første eksempel er en blanding av A og T, og i det andre, en blanding av T og C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi vår tilnærming til å isolere potensierte Hsp104 varianter som undertrykker giftigheten av sykdomsassosierte substrater som bruker gjær proteinopathy modeller. Ved å bruke denne tilnærmingen, kan store biblioteker av alternative tilbud bli vist i høy gjennomstrømning, med den eneste begrensningen er antall varianter som passerer 5-FOA sekundær skjerm. Ved å utføre disse trinnene i 96 brønns, vi rutinemessig skjermen opptil 200 treff om gangen i den fem-FOA steg i løpet av 1-2 uker. Antall treff som oppnås under den innledende screening-trinnet vil variere i stor grad avhengig av substratet toksisitet og sammensetningen av hver enkelt bibliotek. Ved sekvensering av treff, er det viktig å nøye analysere alle kromatogrammer sekvensering, siden blandinger av plasmider er typisk tilstede i hver celle.
Vi har noen ganger merket en stor andel av Hsp104 WT bli isolert som "treff". Dette er sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av spontan genetiskdempere eller veldig svak aktivitet. For å omgå dette problemet, har vi funnet at screening ved forhøyede temperaturer (for eksempel 34 ° C) kan redusere prosentandelen av "treff" som er Hsp104 WT. Det er også viktig å re-klon noen treff sekvensert for å vurdere aktiviteten uavhengig av eventuelle nye varianter, og for å sikre plasmid renhet. Når nye treff er identifisert, kan de bli vurdert for undertrykkelse av aggregering i gjær og karakterisert biokjemisk.
Vi har brukt disse metodene for å isolere poten Hsp104 varianter mot TDP-43, FUS, og α-synuclein og bekreftet sin aktivitet ved hjelp av ren protein biokjemi analyser 17. Til syvende og sist, kan disse metodene brukes til å screene protein bibliotekene mot alle underlag av interesse som er giftig i gjær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
