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Artículo de método

Nanoclusters Síntesis de Immunotargeted Magneto-plasmónica

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DOI:

10.3791/52090

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22 de agosto de 2014

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y un fuerte en el infrarrojo cercano (NIR) absorbancia. El protocolo también incluye conjugación de anticuerpos a las nanopartículas a través de la fracción Fc para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular.

Resumen

Propiedades magnéticas y plasmónicas combinados en una sola nanopartícula proporcionan una sinergia que es ventajoso en un número de aplicaciones biomédicas, incluyendo la mejora del contraste en nuevas modalidades de imagen magnetomotrices, captura simultánea y la detección de células tumorales circulantes (CTC), y la imagen molecular multimodal combinada con la terapia fototérmica de las células cancerosas. Estas aplicaciones han fomentado el interés en el desarrollo de protocolos para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con absorción óptica en la región del infrarrojo cercano (NIR) y un fuerte momento magnético. Aquí, se presenta un protocolo novedoso para la síntesis de tales nanopartículas híbridas que se basa en un método de microemulsión de aceite en agua. La característica única del protocolo descrito en este documento es la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica de diversos tamaños de los bloques primarios que también tienen características magneto-plasmónicas. Este enfoque produce nanopartículas con una alta densidad de funcionalidades magnéticos y plasmónicas que se distribuyen de manera uniforme en todo el volumen de nanopartículas. Las nanopartículas híbridas pueden ser fácilmente funcionalizados mediante la unión de anticuerpos a través de la fracción Fc dejando la porción Fab que es responsable de la unión disponibles para la orientación antígeno.

Introducción

Nanopartículas híbridas que comprendan diferentes materiales con propiedades fisicoquímicas distintas pueden abrir nuevas oportunidades en aplicaciones biomédicas, incluyendo imágenes multimodal molecular, el suministro de terapia y el seguimiento, nuevo cribado y ensayos de diagnóstico 1-3. La combinación de propiedades plasmónicas y magnéticos en una sola nanopartícula es de particular interés, ya que proporciona una muy fuerte dispersión de luz y de absorción secciones transversales asociados con resonancias de plasmones y la capacidad de respuesta a un campo magnético. Por ejemplo, se utilizaron nanopartículas magneto-plasmónicas para aumentar el contraste en las imágenes de campo oscuro de células marcadas mediante la aplicación de una modulación de la señal temporal a través de un electroimán externa 3-5. Más recientemente, un principio similar se aplicó en el desarrollo de una nueva modalidad de imagen - imágenes magneto-fotoacústica, donde las nanopartículas magneto-plasmónica permiten grandes mejoras en el contraste y la rata de señal a fondoio 6,7. También se demostró que las nanopartículas híbridas pueden ser utilizados para la captura y la detección de células tumorales circulantes en la sangre entera e in vivo 8,9 simultánea. Además, las nanopartículas magneto-plasmónicas son prometedores agentes teranósticos que se pueden usar para formación de imágenes ópticas y MR específica molecular combinado con la terapia fototérmica de las células cancerosas 10.

Se exploraron varios enfoques para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica. Por ejemplo, Yu et al. Descomposición utilizado y la oxidación de Fe (CO) 5 sobre nanopartículas de oro para formar-mancuernas como bifuncionales Au-Fe 3 O 4 nanopartículas 11. Wang et al. Han sintetizado nanopartículas de óxido de hierro recubierto de oro utilizando el método de descomposición térmica 12. Algunos otros enfoques se basan en polímeros de amina o recubrimiento moléculas funcionales en nanopartículas de núcleo magnético, seguido por la deposición de agcáscara de edad sobre la superficie de polímero para crear el híbrido partículas de 7,13. Además, las nanopartículas de óxido de hierro se adjunta a nanorods de oro a través de interacciones electrostáticas o una reacción química 14,15. Aunque estos enfoques producen nanoestructuras magneto-plasmónicas, comprometen a algunas propiedades extensión de la combinación magneto-plasmónica tales como absorbancia óptica en el (NIR) ventana de infrarrojo cercano o un fuerte momento magnético ambos de los cuales son altamente deseables en aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, pesa de gimnasia Au-Fe 3 O 4 nanopartículas tienen un pico de resonancia de plasmón a 520 nm lo que limita su utilidad in vivo debido a la alta turbidez tejido en este intervalo espectral. Además, las nanopartículas magneto-plasmónica producidos por los protocolos actuales se limitan a un solo 11 o pocos (menos de 10) 14,15 mitades superparamagnéticas (por ejemplo, nanopartículas de óxido de hierro) que es significativamente menor que podría ser ACHieved en una nanoestructura densamente poblado. Por ejemplo, una nanopartícula esférica de 60 nm de diámetro densamente poblado puede contener del orden de un millar de 6 nanopartículas superparamagnéticas nm. Por lo tanto, hay una gran sala para mejorar las propiedades magnéticas de las nanopartículas híbridas. Por otra parte, algunos de los protocolos descritos anteriormente son relativamente complejos y requieren optimización cuidadosa para evitar la agregación de partículas durante la síntesis de 14,15.

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y una fuerte absorbancia NIR que aborda las principales limitaciones de la técnica actual. La síntesis tiene sus orígenes en el método 16 microemulsión de aceite en agua. Se basa en el montaje de las nanopartículas de un tamaño deseado de unas partículas primarias mucho más pequeñas. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para producir nanoestructuras de un solo material, como oro, óxido de hierro, y pri semiconductormary partículas 16. Nos extendió a la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica por, primero, haciendo que las partículas de núcleo de óxido de concha de oro diámetro de 6 nm / hierro y, a continuación, el montaje de las partículas híbridas primarios en la nanoestructura esférica final. Montaje de partículas primarias en nanoclusters no sólo permite la mejora de las propiedades de las nanopartículas constituyentes, tales como el logro de un momento magnético más fuerte, mientras que la preservación de propiedades superparamagnéticas, pero también se aprovecha de las interacciones entre las nanopartículas individuales creando así nuevas características ausentes de las nanopartículas constituyentes, tales como fuerte absorbancia óptica en la ventana de NIR. Este protocolo produce nanopartículas híbridas con una alta densidad de funcionalidades magnéticas y plasmónica. Después de partículas primarias se sintetizan, nuestro método es esencialmente una reacción de una etapa simple. La fuerza total de resonancia de plasmón y momento magnético son determinados por un número de partículas primarias y, therntes, puede ser fácilmente optimizada en función de una aplicación. Además, también hemos desarrollado un procedimiento para la conjugación del anticuerpo a las nanopartículas híbridas para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular. Los anticuerpos están unidos a través de la fracción Fc dejando la porción Fab que es responsable de la unión disponibles para la orientación antígeno.

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Protocolo

1. Aparatos y Preparación Cristalería

  1. Use el equipo adecuado de protección, es decir, una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular.
  2. Conecte un matraz de fondo redondo a un condensador y sumergirlo en un baño de aceite de silicona con un monitoreo de la temperatura con un termómetro. Coloque una fuente de calor (por ejemplo, la placa caliente) en el baño de aceite (Figura 1). Use un termómetro capaz de medir la temperatura superior a 260 ° C.

Nanopartículas 2 Síntesis de híbrido Primaria Magneto-plasmónicas

  1. Haciendo magnética Core nanopartículas
    1. Añadir 353,2 mg (1 mmol) de hierro acetilacetonato (III), 1 ml (2 mmol) de ácido oleico, 1 ml (2 mmol) oleilamina, 1,292 g (5 mmol) de 1,2-hexadecanodiol, y 10 ml de éter de fenilo para una ronda frasco -fondo.
    2. Se agita la mezcla vigorosamente utilizando un agitador de varilla y el calor magnético de 250-260 ° C durante 1 hora a reflujo. Luego, esperar a que se enfríe la solucióna RT. Asegúrese de que la temperatura es inferior a 260 ° C para evitar la ebullición del éter de fenilo y evitar una explosión de la mezcla de reacción desde el matraz de fondo redondo al condensador.
      PRECAUCIÓN: La mezcla de reacción es extremadamente caliente y los productos químicos puede causar irritación. Debe operar bajo una campana de humos y llevar equipo de protección personal adecuado. Asegurar una ventilación adecuada para el baño de aceite.
      NOTA: El baño de aceite se mantiene a 250-260 º C de temperatura durante 1 hora durante la síntesis de las nanopartículas magnéticas. En principio, un plato de vidrio Pyrex se puede utilizar para este propósito. Sin embargo, la temperatura máxima continua de vidrio Pyrex es de ~ 260 º C de acuerdo con la información del proveedor. Por lo tanto, un recipiente de metal proporciona una opción más segura para la reacción, ya que puede resistir una temperatura más alta y durar más tiempo durante múltiples carreras.
  2. Deposición de una concha de oro en nanopartículas de núcleo magnético
    1. Añadir 411,5 mg (1,1 mmol) as oroTate, 0,25 ml (0,75 mmol) de ácido oleico, 1,5 ml (3,0 mmol) oleilamina, 775,3 mg (3 mmol) de 1,2-hexadecanodiol, y 15 ml de éter de fenilo a un matraz de fondo redondo.
    2. Añadir 5 ml de suspensión de nanopartículas magnéticas desde el paso 2.1. Calentar la mezcla de reacción a 180 ° C y mantener a reflujo durante 1 h. Esperar a que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
    3. Añadir 50 ml de etanol para precipitar las nanopartículas híbridas primarias seguido por centrifugación a 3250 × g durante 15 min.
    4. Resuspender el precipitado en 25 ml de hexano usando un sonicador de baño. Añadir 25 ml de etanol para precipitar las nanopartículas híbridas primarios. Centrifugar a 3250 xg durante 15 min y resuspender el precipitado en hexano. Repita este paso tres veces.
    5. Secar las nanopartículas híbridas primaria precipitados en un desecador de vacío O / N. Confirme que las partículas estén completamente secas.

Nanoclusters 3. híbrido Magneto-plasmónicas Síntesis y Tamaño Separación

  1. Resuspender 5 mg de nanopartículas híbridas primarias secos en 1 ml de hexano usando un sonicador de baño. Sonicar la suspensión de nanopartículas hasta que no precipitado visible está presente.
  2. Añadir la solución del paso 3,1 a 10 ml de solución acuosa de dodecilsulfato de sodio (2,8 mg / ml) en un vial de vidrio de 20 ml con tapas fijadas. Añadir la suspensión de nanopartículas híbridas primaria gota a gota para evitar la mezcla de las dos fases antes del siguiente paso.
  3. Sonicar la solución de dos fases en un baño de ultrasonido durante 2 horas, seguido de calentamiento en un baño de agua a 80 ° C durante 10 min. Esperar a que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
    1. Llenar de agua hasta la línea de nivel operativo del baño de ultrasonidos. Centre el vial de vidrio en el baño de ultrasonidos. Se forma una emulsión inmediatamente entre las dos fases. Agite la solución de dos fases a mano después de inicio del tratamiento con ultrasonidos; esto facilita la mezcla entre la fase que contiene nanopartículas híbridas primarios y la fase acuosa inferior.
      NOTA: Tenga en cuenta That sonicador se calentará después de 2 horas de funcionamiento.
  4. Centrifugar la suspensión híbrida nanocluster a 100 xg durante 30 min. Recoger tanto el precipitado y el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,1 mM citrato de sodio por debajo de 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 180 nm de diámetro.
  5. Transferir el sobrenadante de la etapa 3.3 a un nuevo tubo cónico.
  6. Centrifugar la suspensión de la etapa 3.4 a 400 xg durante 30 min. Recoger tanto el precipitado y el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,1 mM citrato de sodio por debajo de 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 130 nm de diámetro.
  7. Transferir el sobrenadante de la etapa 3.5 a un nuevo tubo cónico.
  8. Centrifugar la suspensión de la etapa 3.6 a 1.500 xg durante 30 min. Recoger el precipitado y resuspender en citrato de sodio 0,1 mM en 10 min sonicación. El tamaño esperado de los nanoclusters es de ~ 90 nm de diámetro.
  9. Añadir 300 _6; l de suspensión nanocluster a un lector de microplacas de 96 pocillos para medir un espectro de absorción UV-Vis-NIR. Caiga 10 suspensión nanocluster l en rejilla de cobre recubierta de carbono para obtener imágenes TEM.

4. Conjugación de anticuerpos monoclonales a Nanoclusters

  1. Preparar 100 l solución de anticuerpo monoclonal (1 mg / ml) en PBS, pH 7,2, por ejemplo, anti-Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico 2 (HER2) anticuerpos o receptor 1 del factor de crecimiento (EGFR) anticuerpos contra-epidérmica.
  2. Añadir la solución de anticuerpo de la etapa 4.1 a 3.9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifugar la solución a través de un filtro centrífugo 10 k MWCO a 3.250 xg durante 20 min a 8 ° C. Resuspender el anticuerpo en 4 mM HEPES, pH 7,2, hasta un volumen final de 100 l.
    NOTA: Este paso se lleva a cabo para reemplazar el medio original en la solución de anticuerpo con HEPES.
  3. Añadir 10 l de 100 mM NAIO 4 a 100 l de solución de anticuerpos. Cubrir el vial de reacción con un allámina uminum a TA y se mezcla durante 30 min utilizando un agitador orbital.
  4. Interrumpir la reacción mediante la adición de 500 l de 1x PBS.
  5. Añadir 2 l de solución de enlazador 46,5 mM (dithiolaromatic peg6-CONHNH 2) a la solución de anticuerpo de la etapa 4.4 y agitar durante 1 hora a TA.
  6. Filtrar la solución usando un filtro de centrífuga de 10 k MWCO a 3.250 xg durante 20 min a 8 ° C. Resuspender el anticuerpo en 1X PBS hasta un volumen final de 100 l que conduce a una concentración de anticuerpo de ~ 1 mg / ml.
  7. Mezclar 100 l de suspensión nanocluster a una DO de 1,0 ~ 1 l con anticuerpos modificados de la etapa 4.6 (1 mg / ml) durante 120 min a RT.
  8. Añadir 10 l de 10 -3 M 5 kDa tiol PEG y agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  9. Centrifugar la solución a 830 x g durante 3 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 100 l 2% w / v de PEG 5 kDa en PBS, pH 7,2.
  10. Medir el espectro de absorción de los nanoclusters-anticuerpo conjugado y comparar a tél absorbancia espectro de los nanoclusters desnudas. Espere un par de nanómetros corrimiento al rojo después de la conjugación.
  11. Si las nanopartículas agregadas como se muestra por un cambio significativo con un aumento de OD en la región del rojo-NIR, aumentar la concentración de PEG tiol a 5 x 10 -3 M. También, aumentar el tiempo de incubación con PEG tiol a 30 min y disminuir la velocidad centrífuga en incrementos de 200 xg.
  12. Para el cáncer de ensayo de marcaje celular, añadir el anticuerpo nanopartículas conjugadas desde el paso 4.9 de la suspensión de células cancerosas, ya sea en medio o 1x PBS (1 ml ~ 10 6 células) y se mezcla durante 60 min.

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Resultados

Un esquema para la síntesis de nanoclusters magneto-plasmónica immunotargeted se muestra en la Figura 2. Primer lugar, magnéticos Fe 3 O 4 nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de método de descomposición térmica. Entonces, una cáscara delgada de oro alrededor de 1 nm se deposita sobre las partículas de núcleo de óxido de hierro a través de la descomposición térmica. Las nanopartículas híbridas primaria ca. 6 nm sirven como semillas par...

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Discusión

Los pasos críticos en la síntesis exitosa de nanoclusters magneto plasmónica incluyen la fabricación altamente monodispersas de oro primario shell / hierro nanopartículas núcleo de óxido y la dirección de auto-ensamblaje de las partículas primarias en nanoclusters. Una relación molar entre las partículas primarias y tensioactivos juegan un papel importante en la determinación de la distribución del tamaño de los nanoclusters. Distribución de tamaño no uniforme de nanopartículas primarias puede causar la formación de gra...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones del NIH R01 y R01 CA103830 EB008101.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PYREX Matraz de cocción de fondo redondo de 50 ml con cuello corto y junta 24/40 [ST]Corning4320A-50 Reacción dedescomposición térmica
PYREX 41 x 300 mm Condensador Allihn de 5 bombillas con juntas exteriores/interiores 24/40 [ST]Corning2480-300Reacción de descomposición térmica
Aceite de silicona FisherS159-500Baño de aceite
Agitador de placa calefactoraCorningPC-351Calentar el reacton con función de agitación
TermómetroThermoWorks221-092Medir la temperatura
Acetilacetonato de hierro (III)FisherAC11913-0250Material para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
Ácido oleico 99%FisherA195-500Material para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
Acetato de oro (III)FisherAA3974206Material para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
HexaneFisherH292-1Material para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
Éter fenílico 99%FisherAC13060-0025Material para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
1,2-Hexadecanediol 90%Sigma213748-50GMaterial para la síntesis
de nanopartículas híbridas primariasOleylamina 70%SigmaO7805-100GMaterial para la síntesis de nanopartículas híbridas primarias
Dodecil sulfato de sodioFisherBP166-100 Síntesis declústeres
Citrato de sodio dihidratadoSigmaW302600Síntesis de clústeres
Anticuerpo monoclonal anti-receptor de EGFSigmaE2156Prueba de especificidad de marcaje celular
Monoclonal anti-HER2 anticuerpoSigmaAMAB90627Prueba de especificidad de marcaje celular
Periodato de sodioSigma311448Región Fc oxidada de los anticuerpos
Ditiolaromático PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014BEnlazador heterofuncional para la conjugación de anticuerpos a nanoclusters
Metoxi-PEG-tiol, 5 kCreative PEGworksPLS-604Pasivar la superficie de oro restante después de la conjugación de anticuerpos
Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10MilliporeUFC801008Purificación de proteínas
HEPESSigmaH3375Tampón
PBS, 1x soluciónFisherBP2438-20Tampón
Espectroscopía UV-VisBioTek Synergy HTObtener espectro
CentrífugaEppendorf5810RSeparación
Microscopio electrónico de transmisiónFEITECNAI G2 F20 X-TWINObtener la morfología de las nanoestructuras
Microscopio verticalLeicaDM6000Obtener imágenes de campo oscuro
SonicatorBranson1510Sonication
Película de carbono 300 mesh rejillaEMSCF300-CuTEM
de imagen placa de 96 pocillosCorning09-761-145placa de lectura UV-Vis

Referencias

  1. Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
  2. Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002(2013).
  3. Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
  4. Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
  5. Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
  6. Qu, M., et al. Magneto-photo-acoustic imaging. Biomedical optics express. 2, 385-396 (2011).
  7. Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41(2010).
  8. Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
  9. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
  10. Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101(2007).
  11. Yu, H., et al. Dumbbell-like bifunctional Au-Fe3O4 nanoparticles. Nano letters. 5, 379-382 (2005).
  12. Wang, L., et al. Monodispersed core-shell Fe3O4@Au nanoparticles. The journal of physical chemistry. B. 109, 21593-21601 (2005).
  13. Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
  14. Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
  15. Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
  16. Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).

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