Artículo de método

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

DOI:

10.3791/52095

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18 de noviembre de 2014

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1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

En este artículo

Resumen

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Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mirna clonación y secuenciación de alto rendimiento, denominado miR-Sec, destaca como un enfoque de todo el transcriptoma de cuantificar miRNAs con resolución de un solo nucleótido. Esta técnica captura miRNAs por fijar los adaptadores 3 'y 5' de oligonucleótidos a las moléculas de miARN y permite de novo miARN descubrimiento. El acoplamiento con potentes plataformas de secuenciación de próxima generación, el miR-Sec ha sido fundamental en el estudio de la biología de miRNA. Sin embargo, los sesgos significativos introducidos por pasos de ligación de oligonucleótidos han impedido que el miR-Sec de ser empleado como una herramienta de cuantificación exacta. Estudios previos demuestran que los sesgos en los métodos de miR-Seq actuales a menudo conducen a la cuantificación inexacta miARN con errores hasta 1.000 veces por algunos miRNAs 1,2. Para resolver estos sesgos impartidas por la ligadura de ARN, hemos desarrollado un pequeño método de ligadura de ARN que se traduce en eficiencias de ligación de más del 95% para ambos 3 'y 5' de ligación pasos. Evaluación comparativa de este improbado método de construcción de la biblioteca utilizando miRNAs sintéticos equimolares o diferencialmente mixtos, produce consistentemente lee los números con una desviación de menos de dos veces del valor esperado. Por otra parte, este método de gran eficacia miR-Sec permite precisa de todo el genoma de perfiles de miARN in vivo total de muestras de ARN 2.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologías basadas secuenciación de alto rendimiento han sido ampliamente aplicado a muchas muestras biológicas en los últimos años en expansión en gran medida nuestra comprensión de la complejidad molecular de los sistemas biológicos 3,4. Sin embargo, la preparación de muestras de ARN de secuenciación de alto rendimiento a menudo imparte sesgos específicos inherentes a la metodología empleada, lo que limita la utilidad potencial de estas técnicas de gran alcance. Estos sesgos de métodos específicos han sido bien documentados para las preparaciones de bibliotecas basado en la ligadura, pequeño-ARN 1,2,5,6. Estos sesgos como resultado la variación de 1.000 veces en lee los números de miRNAs sintéticos equimolares, hacer inferencia de miARN abundancia a partir de datos de secuenciación tremendamente variable y propenso a errores.

Estudios centrados en las propiedades de T4 ARN ligasas derivadas de fagos han documentado que las enzimas exhiben preferencias basadas en nucleótidos 7, que se manifiestan como bibliotecas sesgadas en experimentos de secuenciación de alto rendimiento 1,2,8. A fin de minimizar los sesgos impartidas por ARN ligasas, múltiples estrategias se han empleado; macromolecular crowding 9, la aleatorización de la secuencia de nucleótidos en el adaptador que es proximal al sitio de la ligadura de 6, y el empleo de altas concentraciones de adaptador de ligadura 2. A través de una combinación de estos tres enfoques, hemos desarrollado un flujo de trabajo para la preparación imparcial de pequeñas bibliotecas de ARN compatibles para la secuenciación de alto rendimiento (Figura 1). Para las comparaciones directas entre los protocolos actuales y nuestro método optimizado, por favor consulte nuestro informe reciente 2. Este método produce optimizado la eficiencia de ligación de más del 95% tanto en 3 'y 5' pasos y permite la ligadura imparcial de pequeñas moléculas de ARN de las muestras sintéticas y biológicas 2.

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Protocolo

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NOTA: Es fundamental para mantener las condiciones-RNasa libre durante todo el procedimiento.

1. adenilación de 3 'vinculador

  1. Diluir oligonucleótido de ADN diseñada para las reacciones de 3 'de ligación a 100 micras de nucleasa libre de H 2 O.
    NOTA: El oligonucleótido debe tener un 'grupo fosfato, un dinucleótido aleatorizado en el 5' 5 final, y un 'didesoxicitosina 3. El 5 'grupo fosfato es un requisito de la enzima para una eficiente Mes 5' adenylation 10. El fosfato puede ser añadido por el pre-tratamiento del oligonucleótido con un polinucleótido quinasa, o pedir con la modificación directamente. El dinucleótido aleatorizado en el extremo 5 'es importante para minimizar la preferencia que ligasas de ARN de exposiciones con certeza de extremo a extremo de unirse a las reacciones sobre otros 6 secuencia. El 3 'didesoxicitosina coloca un elemento de bloqueo en el extremo 3' del oligonucleótido to inhibir la formación de concatámeros enlazador-enlazador durante los pasos posteriores de ligación y también sirve para bloquear el extremo de la molécula de los genes miARN-Enlazador formado en el extremo de 3 'de la reacción de ligación 3 11. La secuencia de engarce oligonucleótido elegido para el método de miR-Seq imparcial es como sigue: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '.
  2. Montar la siguiente reacción adenylation: 200 pmol oligonucleótido 3 'enlazador, 4 l de 10x 5' tampón adenylation ADN, ATP 4 mM l 1, 4 l Mes ARN ligasa, libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 40 l.
  3. Incubar la reacción a 65 ° C durante 1 hora. Terminar reacción por calentamiento a 85 ° C durante 5 min.
  4. Precipitar enlazador adenylated por la adición de 2,5 volúmenes de etanol al 100% y 1/3 volumen de acetato de amonio 10 M para eliminar ATP residual y para evitar ligaduras no anticipados en futuras reacciones.
    1. En pocas palabras, mezclar la colcohol, la sal, y la solución de oligo hasta la homogeneidad, haciendo girar a toda velocidad en una microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavar el precipitado en etanol al 70%, secado al aire, y se resuspende en el volumen apropiado de libre de nucleasa H 2 O para producir 50-100 M de oligo adenilado.
  5. Confirmar adenylation mediante la ejecución de un gel de poliacrilamida al 18%.
    1. Preparar el gel mezclando juntos la siguiente: 6,3 g de urea, 6,75 ml de 40% de acrilamida, y 1,5 ml de 10x TBE. Añadir H2O y 15 ml.
    2. Mezclar hasta que la urea se disuelve completamente y añadir 150 l 10% (w / v) de persulfato de amonio (APS) y 15 l tetramethlyethylenediamine (TEMED).
    3. Una vez que se ha fijado gel, pre-carrera durante 30 min a 24 V / cm de anchura de gel con TBE 1x tampón a temperatura ambiente. Una vez que 30 minutos es hasta los pozos inmediatamente con tampón.
    4. Mezclar 5 pmol de oligonucleótidos con adenilados y un volumen igual de 2x tampón de desnaturalización del ARN de carga (95% (v / v) formamida,0,02% (w / v) SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v) de xileno cianol, EDTA 1,0 mM), calentar brevemente a 75 ° C, y SNAP enfriado en hielo. Prescindir de toda la muestra en el pocillo del gel. También incluya una cantidad idéntica de control no adenilado, y los bajos estándares de tamaño de peso molecular.
    5. Correr el gel a 24 V / cm hasta que el azul de bromofenol es ¾ de la forma de la parte inferior del gel. Desmontar el aparato, gel post-tinción con solución SYBR-oro en 1x 1x TBE y visualizar el cuadro de UV-transiluminador (Figura 2).
      NOTA: Gel purificar el oligo adenylated de una manera similar a la descrita anteriormente si "no ARN de entrada" controles están resultando en una alta cantidad de producto de PCR en comparación con las muestras con ARN de entrada.

2. vinculador Ligadura a 3 'Fin de miARN

  1. 3 'La ligadura
    1. Ensamble los componentes siguientes en el hielo en el orden indicado: 1.0 l 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 y# 956; l de 10x tampón de ligasa de ARN (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de MgCl 2, DTT 10 mM), 1,0 l adenylated 3 'Enlazador (100 mM), inhibidor de ARNasa 0,5 l, 0,5-8,0 g RNA total, 0,5 l de ARN ligasa de T4 2, libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 5 l.
    2. Mezclar la reacción mediante pipeteo como la solución es demasiado viscoso para vórtice debido a la alta concentración de PEG 8000. Una vez bien mezclados, coloque la reacción en un termociclador con una tapa calentada. Ajuste el bloque a 16 ° C, y se incuba durante 4 horas.
      NOTA: La reacción puede hacerse a escala hasta un volumen final de 20 l, sin ninguna pérdida en la eficiencia de la ligadura. Reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para producir la eficiencia de ligación esencialmente idénticas.
  2. Purificación en gel
    1. Después de 3 'de la ligación, la mezcla de la reacción con un volumen igual de tampón de carga 2x ARN. Calentar a 70 ° C durante 5 min, y broche de presión enfriar en hielo.
    2. Ejecutar la muestra en un gel de poliacrilamida al 15% para la purificación PAGE.
      1. Preparar un gel de poliacrilamida al 15% que contiene urea 7 M, en una manera similar a la descrita previamente en el paso 1.5.
      2. Pre-correr el gel a 24 V / cm de anchura de gel por lo menos durante 30 minutos. Apague la fuente de alimentación, los pozos de descarga, carga y muestra de gel de carrera en mismo voltaje que antes de la carrera.
      3. Cargue la muestra y ejecutar la página hasta que el azul de bromofenol sólo ha salido del gel. El producto deseado migrará cerca de la cianol xileno.
  3. La tinción, visualización, y Escisión
    1. Desmontar aparato de gel y el lugar de gel en la bandeja limpia con 1x tampón (TBE), 1x SYBR-oro, y roca durante 15 min.
    2. Retire gel de placa de tinción y visualizar el cuadro de transiluminador UV cubierta con una envoltura de plástico limpio. El producto de ligación debe ser alrededor de 45 nucleótidos de longitud.
    3. Impuestos especiales de la región que contiene el producto de ligación con un razo limpiohoja r y colocar en 0,5 ml tubo de micro-centrífuga.
  4. El aislamiento del producto y Precipitación
    1. Pierce inferior de 0,5 ml tubo de microcentrífuga con una aguja de 30 G y colocar el tubo perforado en un segundo, baja retención de limpia, de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a ~ 15.000 x g.
    2. Visualmente confirmar que toda la porción de gel se ha movido a través del agujero en el tubo interior. Si es necesario, utilice una punta de pipeta limpia para empujar algunos fragmentos de gel más cerca del agujero.
    3. Desechar el tubo 0,5 ml vacío y añadir 400 l de tampón de la columna de alta sal (HSCB NaCl 400 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, 0,1% SDS) a la suspensión de acrilamida. Tubo (s) de la roca a 4 ° C durante la noche.
    4. Transferencia de lechada a una columna de centrifugación de acetato de celulosa de 0,22 micras utilizando una punta de pipeta de gran calibre. Centrifugar durante 3 min a temperatura ambiente a ~ 15.000 xg para recoger todo el líquido lejos de matriz de gel de acrilamida.
    5. Trasvasar el líquido a una, bajo la retención limpia, tubo de 1,5 ml contieneing 1 l de 20 mg / ml de glucógeno. Añadir un volumen igual de isopropanol y 1/10 de acetato de sodio volumen XX. Mezclar solución invirtiendo tubo varias veces y precipitar en -80 ° C congelador durante 20 min.
    6. Centrifugar a toda velocidad a 4 ° C durante 20 min para sedimentar el ácido nucleico. Eliminar el sobrenadante y lavar en etanol al 70%. Aire pellet seco durante 10 min a temperatura ambiente y proceder directamente a 5 'etapa de ligación.

3. vinculador ligadura de extremo 5 'de los genes miARN-3' Enlazador híbrido

  1. Para ácido nucleico granulado, añadir los siguientes componentes: 2 l de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 l de 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 l ATP (10 mM), 0,5 l NN-ARN oligo (100 mM), y H 2 O hasta un volumen final de 4 l.
    NOTA: La composición de la 'NN-ARN oligo' es el siguiente 5 'invertida-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3' y se purificó por medio de HPLC por el fabricante.
  2. Mezclaresta muestra pipeteando arriba y abajo varias veces. Haga esto durante algún tiempo (hasta 5 min) para asegurarse de que el sedimento ha sido re-solubilizado por completo. Si re-solubilización es problemático, calentar la muestra brevemente (3-5 min) a 37 ° C y reanudar pipeteado para mezclar.
  3. Una vez que la pastilla está de vuelta en solución, transferir el contenido de un tubo de PCR limpio que contiene 1 l de una mezcla 1: 1 de inhibidor de RNasa y T4 ARN ligasa 1 (5 unidades). Una vez más la mezcla pipeteando arriba y abajo.
  4. Incubar la reacción en un ciclador térmico a 37 ° C durante 4 h. Proceda inmediatamente a la síntesis de ADNc.

4. Transcripción inversa / cDNA Synthesis

  1. Añadir los siguientes componentes a los 5 'reacción de ligación: 2 l de tampón 5x RT, 0,75 l de DTT 100 mM, 1 l Illumina RT Primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 M), y 0,5 mu l dNTPs (10 mM).
  2. Mezclar mediante pipeteo y se calienta a 65 ° C durante 5 min. Luego enfriar lentamente en el banco top.
  3. Una vez que la reacción se ha enfriado a temperatura ambiente, colocar el tubo en hielo y añadir 0,5 l de cada uno de enzima transcriptasa inversa y un inhibidor de RNasa. Mezclar mediante pipeteo y el lugar en el termociclador para la etapa de extensión se indica en las instrucciones del fabricante.
  4. Una vez completa add 5 l de nucleasa libre de H 2 O para llevar el volumen final de la biblioteca de ADNc de hasta 15 l.

5. Biblioteca Preparación

  1. Para la indexación PCR, montar la siguiente reacción en hielo: 6 l 5x Phusion Buffer, 1 mu l dNTPs (10 mM), 0,9 l de DMSO, 0,75 l Cebador 5 '(25 mM), 0,75 l cebador 3' (25 mM), biblioteca de ADNc de 3 l (concentración variable en función de la cantidad de la entrada), 0,5 l de la polimerasa Phusion (1 unidad), libre de nucleasa H 2 O hasta un volumen final de 30 l. Elegir las secuencias de cebadores para asegurar la compatibilidad con la plantilla y la plataforma de secuenciación deelección.
    1. Ejecutar la reacción de PCR con los siguientes ajustes: desnaturalización inicial a 98 ° C durante 3 min, durante los primeros 4 ciclos, desnaturalizar 98 ° C durante 15 s, recocido a 50 ° C durante 15 s, se extienden a 72 ° C durante 15 s .
      NOTA: En función de la cantidad del material de entrada, varía el número total de ciclos de PCR. Típicamente, para una entrada de 1-2 g de RNA total, 13 ciclos totales de PCR son suficientes para generar la biblioteca de miR-Seq.
    2. Llevar a cabo los ciclos posteriores, por ejemplo, los ciclos 5-12, de una manera en dos etapas, donde se combinan y se llevaron a cabo a 70 ° C durante 30 segundos y la desnaturalización de los ciclos de recocido y extensión es de nuevo 98 ° C durante 15 s.
      NOTA: El volumen de reacción es de 30 l para permitir una pausa en el programa de PCR y retirar una alícuota de 10 l en los números de ciclo pre-determinados para monitorizar la apariencia del producto deseado. Típicamente, los ciclos 10, 13, y 16 son elegidos para las pruebas de una muestra de ARN total.
  2. Prepararun no desnaturalización gel de acrilamida al 8% mediante la mezcla de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de TBE 10x, y H 2 O a 10 ml. A continuación, añadir 100 l de 10% de APS y 10 l de TEMED. Vierta en gel y dejar establecido.
    1. Pre-correr el gel a 12 V / cm de anchura de gel durante 30 min. Lavar los pozos. Añadir 1 l de 10x tampón de carga (15% de Ficoll-400, EDTA 66 mM, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), añadir 10 l de muestra a cada pocillo de dimensiones 5 mm x 1 mm x 15 mm. Por lo general, cada pozo puede cargar hasta 30 l de muestras. Ejecutar la muestra de gel a 10 V / cm de anchura de gel en tampón 1x TBE hasta que el colorante azul de bromofenol sólo se ejecuta fuera de la parte inferior del gel.
    2. Mancha y visualizar en gel como se describe en el paso 2.3.
    3. Escindir la banda de par 146 base y eluir durante la noche en 0,25 ml de HSCB de una manera similar a lo que se describe en la sección 2.4. Precipitado de ADN en un volumen igual de isopropanol y acetato de décimo volumen de sodio XX. Lavar la pella en el 70% eTHANOL y resuspender en tampón TE.
    4. Cuantificar la biblioteca utilizando PicoGreen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

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Resultados

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Los resultados esperados por el método anterior deben ser inicialmente la observación de un solo turno de nucleótidos (aumento) en el tamaño del oligonucleótido de ADN que fue objeto de adenylation por Mes ARN ligasa (Figura 2). Después de 3 'de la ligación, la visualización del gel de acrilamida indica (véase la Figura 3) bandas de peso molecular alto afilados evidente en la región de nucleótidos 100-300 de la gel. Esto indica que la muestra de ARN total que se utiliza es de a...

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Discusión

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La metodología descrita en este documento hace uso de varias variables clave para maximizar la eficiencia de ligación, a saber, las altas concentraciones de PEG, el uso de enlazadores aleatorios, y alta concentración de enlazadores 2,6,9. Este enfoque permite a las bibliotecas de secuenciación de forma fiable cuantitativos de muestras de ARN total de 2. Hemos llevado a cabo múltiples titulaciones de ARN de entrada y han concluido que la metodología anterior es el más adecuado para las cantidades de...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Yi, especialmente a Zhaojie Zhang, por sus fructíferas discusiones sobre el diseño de enlazadores y la eficiencia de la ligadura, así como a la Sociedad Americana del Cáncer por apoyar este trabajo a través de una beca postdoctoral (#125209) a J.E.L. La investigación reportada en esta publicación también fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R01AR059697 (a R.Y.) y una beca de investigación del Instituto Linda Crnic para el Síndrome de Down. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Enlazador de 3' (5' fosforilado, 3' bloqueado)Integrated DNA Technologiespersonalizado
Enlazador de 5' IntegratedDNA Technologiespersonalizado' bloqueado, purificado por HPLC
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SEspecializado para la ligadura de adaptadores de ADN preadenilados
10x Tampón de ligadura (sin ATP)Nueva Inglaterra BiolabsIncluido con tampón de ligadura M0351S
10x (con ATP)New England BiolabsIncluido con M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
Polietilenglicol (mol. Wt. 8,000)New England BiolabsIncluido con M0204L
Agua sin nucleasasAmbionAM9937Hemos encontrado que el agua recogida de un aparato de destilación es de calidad equivalente.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051 
Kit de PCR PhusionNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 cebadorIntegrated DNA TechnologiespersonalizadoInformación de secuencia disponible en Illumina
Illumina RT cebadorIntegrated DNA TechnologiespersonalizadoInformación de secuencia disponible en Illumina
Illumina cebador(es) de índiceIntegratedDNA TechnologiespersonalizadoInformación de secuencia disponible en Illumina
40% AcrilamidaFisher ScientificBP14081
UreaSigma AldrichU6504
Persulfato de amonioSigma AldrichA3678
Tetrametetilididiamina (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Tampón de carga de ARN desnaturalizanteNew England Biolabsincluido con M0351S
Hojas de afeitarVWR55411-050
SpinX Tubos Centricon CostarCLS8161
Tubos de microfuga de baja retenciónFisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
Kit de adenilaciónNew England BiolabsE2610L
5

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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