Artículo de método

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

DOI:

10.3791/52104

⸱

11 de noviembre de 2014

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Se utilizaron análisis de ARN de secuenciación y bioinformática para identificar factores de transcripción expresados ​​diferencialmente significativamente y en subpoblaciones Lin-CD34 + y Lin-CD34 de ratón EMLcells. Estos factores de transcripción que podrían desempeñar un papel importante en la determinación del cambio entre las células Lin-CD34- auto-renovación de Lin-CD34 + y parcialmente diferenciado.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre hematopoyéticas (HSC) se utilizan clínicamente para el tratamiento de trasplante para reconstruir el sistema hematopoyético de un paciente en muchas enfermedades tales como la leucemia y el linfoma. Dilucidar los mecanismos que controlan la auto-renovación y diferenciación de las HSC es importante para la aplicación de las CMH para la investigación y aplicaciones clínicas. Sin embargo, no es posible obtener gran cantidad de HSCs debido a su incapacidad de proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, se utilizó una línea celular derivada de la médula ósea de ratón, la EML (eritroide, mieloide y linfocítica) línea celular, como un sistema modelo para este estudio.

RNA-secuenciación (RNA-Seq) se ha utilizado cada vez más para sustituir microarray para estudios de expresión génica. Presentamos aquí un método detallado de la utilización de la tecnología de ARN-Seq para investigar los posibles factores clave en la regulación de las células EML auto-renovación y diferenciación. El protocolo previsto en el presente documento se divide en tres partes. El primer part explica cómo la cultura células EML y separada Lin-CD34 + y células Lin-CD34. La segunda parte del protocolo ofrece procedimientos detallados para la preparación de ARN total y de la construcción de la biblioteca para la posterior secuenciación de alto rendimiento. La última parte se describe el método para el análisis de datos de RNA-Seq y se explica cómo utilizar los datos para identificar los factores de transcripción expresados ​​diferencialmente entre las células Lin-Lin-CD34- CD34 + y. Se identificaron los factores de transcripción más significativamente expresadas diferencialmente a ser los potenciales reguladores clave que controlan las células EML auto-renovación y diferenciación. En la sección de discusión de este artículo, se destacan los pasos clave para el desempeño exitoso de este experimento.

En resumen, este trabajo ofrece un método de uso de la tecnología de ARN-Seq para identificar posibles reguladores de la auto-renovación y diferenciación en células EML. Los factores clave identificados se someten a análisis funcional de aguas abajo in vitro e in vivo.

Introducción

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Las células madre hematopoyéticas son células sanguíneas raras que residen principalmente en el nicho de la médula ósea de adultos. Son responsables de la producción de células requeridas para reponer la sangre y los sistemas inmunitarios 1. Como una especie de células madre, las CMH son capaces tanto de auto-renovación y diferenciación. Dilucidar los mecanismos que controlan la decisión destino de las HSC, ya sea hacia la auto-renovación o diferenciación, ofrecerá una valiosa orientación sobre la manipulación de las CMH para las investigaciones de enfermedades de la sangre y el uso clínico 2. Uno de los problemas que enfrentan los investigadores es que las CMH se pueden mantener y ampliar in vitro en una medida muy limitada; la gran mayoría de su progenie son parcialmente diferenciado en cultivo 2.

Con el fin de identificar los principales reguladores que controlan los procesos de auto-renovación y diferenciación en un genoma de gran escala, hemos utilizado un ratón primitiva línea de células progenitoras hematopoyéticas EML como un sistema modelo. Thse línea celular se deriva de médula ósea murina 3,4. Cuando se alimenta con diferentes factores de crecimiento, las células pueden diferenciarse en EML eritroide, mieloide, y las células linfoides in vitro 5. Es importante destacar que esta línea celular puede propagarse en gran cantidad en medio de cultivo que contiene el factor de células madre (SCF) y todavía conservan su pluripotencialidad. EML células se pueden separar en subpoblaciones de auto-renovación de Lin-SCA + CD34 + y células parcialmente diferenciadas Lin-SCA-CD34- basados ​​en marcadores de superficie CD34 y SCA 6. Al igual que a corto plazo las CMH, SCA + células CD34 + son capaces de auto-renovación. Cuando se trata con células CD34 + SCF, Lin-SCA + puede regenerar rápidamente una población mixta de células CD34 + y Lin-SCA-CD34 + Lin-SCA y continuar a proliferar 6. Las dos poblaciones son similares en morfología y tienen niveles similares de ARNm de c-kit y la proteína 6. Células Lin-SCA-CD34 son capaces de propagarse en los medios de comunicación que contiene IL-3 en lugar de SCF 3. Unveiling los reguladores clave en la decisión del destino celular EML ofrecerá una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares en la transición del desarrollo temprano durante la hematopoyesis.

Con el fin de investigar las diferencias moleculares subyacentes entre las células Lin-SCA-CD34- parcialmente diferenciadas auto-renovación de Lin-SCA + CD34 + y, se utilizó ARN-Seq para identificar los genes expresados ​​diferencialmente. En particular, nos centramos en los factores de transcripción, como factores de transcripción son cruciales en la determinación del destino celular. ARN-Sec es un enfoque recientemente desarrollado que utiliza las capacidades de secuenciación de próxima generación de tecnologías (NGS) para perfilar y cuantificar ARN transcrito a partir del genoma 7,8. En resumen, el ARN total es poli-A seleccionado y fragmentado como la plantilla inicial template.The ARN se convierte después en ADNc utilizando transcriptasa inversa. Con el fin de asignar transcripciones de ARN de longitud completa, utilizando ARN intacto, no degradado para la construcción de la biblioteca de ADNc es importante. Para el purpose de la secuenciación, se añaden secuencias adaptadoras específicas a ambos extremos del cDNA. Entonces, en la mayoría de los casos, las moléculas de ADNc se amplifican por PCR y se secuenciaron de una manera de alto rendimiento.

Después de la secuenciación, la resultante lee se puede alinear a un genoma de referencia y una base de datos transcriptoma. El número de lecturas que mapa para el gen de referencia se cuenta y esta información se puede utilizar para estimar el nivel de expresión génica. El lee también puede ser ensamblado de novo sin un genoma de referencia, lo que permite el estudio de la transcriptomes en organismos no modelo 9. Tecnología de RNA-seq también se ha utilizado para detectar isoformas de empalme 10-12, nuevas transcripciones 13 y 14 fusiones de genes. Además de la detección de genes codificadores de proteínas, RNA-Seq también se puede utilizar para detectar y analizar novela nivel de transcripción de los ARN no codificantes, tales como RNA largo 15,16, microRNA 17, 18 etc. siRNA no codificante. Debido a tque la precisión de este método, se ha utilizado para la detección de variaciones de un solo nucleótido 19,20.

Antes de la llegada de la tecnología de ARN-Seq, microarray fue el principal método utilizado para el análisis de perfil de expresión génica. Sondas pre-diseñadas se sintetizan y posteriormente unidos a una superficie sólida para formar un microarray de diapositivas 21. ARNm se extrae y se convirtió en ADNc. Durante el proceso de transcripción inversa, los nucleótidos marcados con fluorescencia se incorporan en el ADNc y el ADNc se pueden hibridó en las diapositivas de microarrays. La intensidad de la señal obtenida de un punto específico depende de la cantidad de ADNc de unión a la sonda específica en ese lugar 21. En comparación con la tecnología de RNA-Seq, microarray tiene varias limitaciones. En primer lugar, los microarrays se basa en el conocimiento preexistente de anotación de genes, mientras que la tecnología de ARN-Seq es capaz de detectar nuevas transcripciones en alto nivel de fondo relativa, lo que limita su uso cuando genivel de expresión ne es baja. Además, la tecnología de ARN-Seq tiene mucho mayor rango dinámico de detección (8000 veces) 7, mientras que, debido a fondo y la saturación de las señales, la exactitud de microarrays es limitada para ambos genes altamente expresados ​​y humilde 7,22. Por último, las sondas de microarrays difieren en su eficiencia de hibridación, que hacen que los resultados menos fiables al comparar los niveles de expresión relativos de diferentes transcripciones dentro de una muestra de 23. Aunque RNA-Seq tiene muchas ventajas sobre microarrays, su análisis de los datos es complejo. Esta es una de las razones por las que muchos investigadores todavía utilizan microarrays en lugar de RNA-Seq. Se requieren varias herramientas bioinformáticas para el procesamiento de datos de ARN-Seq y análisis 24.

Entre varios de secuenciación de próxima generación (NGS) plataformas, 454, Illumina, SOLID y Ion Torrent son los más ampliamente usados. 454 fue la primera plataforma comercial NGS. En contraste con las otras plataformas de secuenciaciónlongitud como Illumina y sólido, la plataforma 454 genera ya leer (promedio base de 700 lecturas) 25. Longer lecturas son mejores para la caracterización inicial de transcriptiome debido a su mayor eficiencia montar 25. La principal desventaja de la plataforma 454 es su alto coste por megabase de secuencia. La iluminación y plataformas SÓLIDOS generar lee con el aumento del número y longitudes cortas. El coste por megabase de la secuencia es mucho menor que la plataforma 454. Debido a la gran cantidad de cortos lee para la iluminación y plataformas sólidas, el análisis de datos es mucho más computacionalmente intensivas. El precio del instrumento y los reactivos para la secuenciación para la plataforma Ion Torrent es más barato y el tiempo de la secuencia es más corta 25. Sin embargo, la tasa de error y el costo por megabase de secuencia son más altos en comparación con la iluminación y plataformas SÓLIDOS. Las diferentes plataformas tienen sus propias ventajas y desventajas, y requieren diferentes métodos para el análisis de datos. El plaTForm debe ser elegido sobre la base de la finalidad de secuenciación y la disponibilidad de fondos.

En este trabajo, tomamos plataforma Illumina ARN-Seq como ejemplo. Utilizamos células EML como un sistema modelo para investigar los reguladores clave en EML células auto-renovación y diferenciación, y proporciona un métodos detallados de construcción de la biblioteca de ARN-Seq y análisis de datos para el cálculo de nivel de expresión y la novela detección transcripción. Hemos demostrado en nuestra publicación anterior que el estudio RNA-seq en el sistema de modelo de EML 2, cuando se combina con la prueba funcional (por ejemplo desmontables shRNA) proporcionar un poderoso enfoque en la comprensión del mecanismo molecular de las primeras etapas de la diferenciación hematopoyética, y puede servir como una modelo para el análisis de células auto-renovación y diferenciación en general.

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Protocolo

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Activada por fluorescencia 1. EML cultivo celular y separación de las células Lin-CD34 + y Lin-CD34- Uso de clasificación celular magnética Sistema y método de clasificación de la célula

  1. Preparación de riñón de hámster bebé (BHK) medio de cultivo celular para la recogida de factor de células madre:
    1. Cultura células BHK en medio DMEM que contenía FBS al 10% en 25 cm 2 frasco (Tabla 1) a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular.
    2. Cuando las células crecen a un 80 - 90% de confluencia, lavar las células una vez con 10 ml de PBS. Añadir 5 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a la monocapa y se incuban las células durante 1-5 min a temperatura ambiente (RT) hasta que se separan las células.
    3. Pipetear la solución de arriba a abajo suavemente para romper los grumos de células. Añadir 5 ml de DMEM completo al matraz para detener la actividad de la tripsina. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a RT.
    4. Retirar el medio y volver a suspender el sedimento celular en 10 ml de BHK fresco medio de cultivo celular. Transferencia de 2 ml de la suspensión celular de la etapa 1.1.4 a un nuevo matraz de 75 cm 2 y añadir 48 ml de medio de cultivo de células BHK fresco al matraz.
    5. Cultura de las células BHK durante dos días y recogen el medio de cultivo. Passage el medio a través de un filtro de 0,45 micras. Almacenar el medio en -20 ° C hasta su uso posterior.
  2. Cultivo de células EML:
    1. Cultura células EML (en suspensión) en medio básico EML que contienen medio de cultivo de células BHK (Tabla 1) a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular.
    2. Mantener las células EML a baja densidad celular (0,5-5 x 10 5 células / ml) con la densidad de pico de menos de 6 x 10 5 células / ml. Dividir las células cada 2-3 días en la proporción de 1: 5. Células Pasaje EML suavemente y deseche la cultura después de pases para 10 generaciones.
  3. El agotamiento de las células positivas de linaje:
    1. Recoger las células por centrifugación a EML 200 xg for 5 min y lavar las células una vez con PBS. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min.
    2. Resuspender las células con PBS y contar las células con un hemocitómetro. Determinar la concentración de anticuerpos en la etapa de separación celular posterior de acuerdo con el número de las células (por favor, consulte las instrucciones ofrecidas por el proveedor del sistema de aislamiento de células).
    3. Aislar la negativa linaje (Lin-) células utilizando cóctel de anticuerpos linaje (cóctel de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G / C), 7-4 y Ter-119 ) y un sistema magnético de separación de células activadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. La separación de las células Lin-CD34 + y Lin-CD34:
    1. Centrifugar las células Lin- de la etapa 1.3.3 a 200 xg durante 5 min. Resuspender el sedimento celular con PBS y contar las células con un hemocitómetro.
    2. Lavar las células dos veces con tampón FACS y sedimentar las células a 200 xgdurante 5 min.
    3. Etiqueta de cinco 1,5 ml tubos de microcentrífuga con el número 1, 2, 3, 4, 5, respectivamente. Resuspender las células con 100 l de tampón FACS por 10 6 células (10 6 células por tubo).
    4. Añadir 1 g de anticuerpo anti-ratón CD34 FITC al tubo 1 y el tubo 2 y mezclar suavemente los tubos.
    5. Incubar todos los tubos a 4 ° C durante 1 hora en la oscuridad.
    6. Añadir 0,25 g de anticuerpo anti-Sca1 conjugado con PE y 20 l de anticuerpos de cóctel Lineage APC conjugado al tubo 1, 0,25 g de PE-conjugado anticuerpo anti-Sca1 al tubo 3, y 20 l de anticuerpos de cóctel Lineage APC-conjugado con tubo 4.
    7. Mezclar todos los tubos suavemente e incubar las células a 4 ° C durante 30 min adicionales en la oscuridad.
    8. Añadir 300 l de tampón de FACS a las células y centrifugar las células a 200 xg durante 5 min.
    9. Lavar las células con 500 l de tampón de FACS para tres veces.
    10. Resuspender el sedimento celular en 500 l de FACS buffer.
    11. Usar las células en tubos de 2, 3, 4, y 5 para el establecimiento de la compensación. Aislar las células Lin-SCA + CD34 + y Lin-SCA-CD34 en tubo 1 utilizando FACS Aria.

2. Preparación de ARN y la Biblioteca de Construcción en secuenciación de alto rendimiento

  1. Aislamiento, análisis de la calidad y cuantificación de ARN:
    1. Extraer el ARN total de las células Lin-CD34 respectivamente utilizando TRIzol Lin-CD34 + y siguiendo el protocolo de fabrica ".
    2. Retire el ADN usando desoxirribonucleasa contaminada I (DNasa I) siguiendo el protocolo del fabricante. Opcionalmente, el ARN almacenar a -80 ° C en este paso para su uso posterior.
    3. Evaluar la calidad de RNA total usando Bioanalyzer acuerdo con las instrucciones ofrecidas por el proveedor. Utilice la muestra de ARN con Número Integridad ARN (RIN) del 9 lager.
  2. Biblioteca de construcción y secuenciación de alto rendimiento:
    NOTA: Este protocolo describe ARN-Seq utilizando la plataforma Illumina. Paraotras plataformas de secuenciación, se requieren diferentes métodos de preparación de la biblioteca.
    1. Utilice 0,1-4 g de ARN total por muestra de alta calidad para la preparación de la biblioteca. Normalmente 2 g de RNA total se pueden extraer de 10 5 células EML.
    2. Utilice un sistema de preparación de muestras de ARN-secuenciación para la purificación de ARN y la fragmentación, primera y segunda síntesis de ADNc, la reparación final, 3 'adenylation, la ligadura de adaptador y la amplificación por PCR, siguiendo los procedimientos estándares detallados de las instrucciones del proveedor.
      1. Positivamente seleccionar poliA mRNA utilizando oligo-dT perlas magnéticas y fragmentar el ARNm.
      2. Realizar la transcripción inversa usando cebadores aleatorios para obtener el ADNc y, posteriormente, sintetizar la segunda cadena de cDNA para generar ADNc bicatenario.
      3. Retire los 'domina y llenar el 5' 3 voladizos por la ADN polimerasa. Ciclasa 3 'extremos para evitar fragmentos de ADNc de ligando entre sí.
      4. Añadir adaptadores de indexación múltiplex a ambos extremos de la dscDNA. Lleve a cabo la PCR para el enriquecimiento de fragmentos de ADN.
    3. Mida el A260 / A280 para obtener información acerca de la concentración de la biblioteca usando un espectrofotómetro.
    4. Evaluar la calidad de la biblioteca y medir el rango de tamaño de los fragmentos de ADN utilizando un Bioanalyzer.

Análisis 3. Datos

Para tener una referencia de software utilizado en esta parte, por favor ver (Tabla 2).

  1. El procesamiento de archivos de datos para el análisis de aguas abajo:
    1. Convertir .bcl (archivo llamado base) presentar a .fastq archivo usando el software de yuca (Illumina, versión 1.8.2).
      1. Arranca la 'Terminal' en el sistema Linux. Ir a la carpeta de datos que contiene el archivo de datos de una máquina de secuenciación de Illumina HiSeq2000. Supongamos que la carpeta resultado es 'NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX /', tipoen el comando en la figura S1A, y entrar en la carpeta de datos.
      2. Instale Casava 1.8.2 en el sistema Linux. Supongamos que el outputFolder es 'Unaligned', utilice el comando en la Figura S1B para preparar el archivo de configuración para la conversión. Utilice la opción --fastq-cluster-0 Cuenta para asegurar que se crea sólo un archivo .fastq para cada muestra. El archivo .fastq generado es en formato .gz. Descomprimir que para el análisis de aguas abajo (Figura S1B).
      3. Después de que se ha generado en la carpeta 'Unaligned', vaya a la carpeta 'Unaligned' (Figura S1C).
      4. Utilice el comando en la figura S1D para iniciar el proceso de conversión. El parámetro '-j' suministra el número de CPU que se utilizará.
      5. Después de que el sistema termine el proceso de conversión, vaya a la carpeta de resultado en la carpeta 'Unaligned' (Figura S1E).
      6. Utilice el comando en la figura S1F </ Strong> para descomprimir el archivo .fastq.gz en .fastq archivo en cada carpeta muestra.
  2. Detectar nuevas transcripciones y evaluar el nivel de expresión utilizando Tuxedo Suite de 26:
    1. Asignar el extremo emparejado ARN-Seq lee a la referencia del genoma del ratón (UCSC versión mm9, obtenido a partir de http://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html ) utilizando software de Tophat (versión 1.3.3) 27, que utiliza el Bowtie leer mapeador (versión 0.12.7) 28. Tophat se suministra con la opción "-no-nuevos-juncs" para mejorar la precisión de la estimación del nivel de expresión.
      1. Ponga los archivos en una carpeta .fastq donde se llevará a cabo el proceso de mapeo. Supongamos que hay dos archivos .fastq (cambiar el nombre a Example1.read1, Example1.read2) para una muestra de la secuencia de extremo emparejado, utilice el comando en la figura S2 para hacer el mapeo (ajustar los parámetros de acuerdo a la configuración del sistema).El parámetro "-p" suministra el número de la CPU que se utilizará. Los parámetros "r" y "-mate-STD-dev" se pueden obtener a partir de la biblioteca de control de calidad o inferirse de un subconjunto de alineado lee (Figura S2).
    2. Montar el mapeado lee en las transcripciones de ARN utilizando el software de Gemelos (versión 1.3.0) 29. Gemelos de ejecución utilizando el archivo de anotación de genes conocidos (mismo archivo .gtf utilizado por Tophat) y el archivo de .bam producido por Tophat.
      1. Después de Tophat termina de ejecutarse, en la misma carpeta, utilice el comando en la Figura S3A para ejecutar las mancuernas para construir el nivel de expresión del transcriptoma y estimación transcripción. El 'mm9_repeatMasker.gtf' y los archivos de la secuencia del genoma de la carpeta 'GenomeSeqMM9' se pueden obtener a partir de la UCSC Genome Browser.
      2. Los archivos genes.expr y transcripts.expr resultantes contienen el valor de la expresión de los genes y las transcripciones (isoformas). Copiar y pegarel contenido del archivo a un archivo Excel y manipular con la aplicación de hoja de cálculo (Figura S3B).
      3. Utilice el comando en la figura S3C para comparar el archivo resultante 'transcripts.gtf' en el fichero de referencia 'mm9_genes.gtf' con el fin de identificar nuevas transcripciones.
      4. El archivo .tmap resultante contiene el resultado de la comparación. Copie y pegue el contenido del archivo a un archivo de Excel y manipular con la aplicación de hoja de cálculo. Las transcripciones con código de clase 'u' pueden ser considerados como 'novela' en comparación con la referencia .gtf archivo proporcionado (Figura S3D).
        NOTA: Para el análisis de aguas abajo de conveniencia, establezca los valores FPKM a 0,1 si los valores están bajo 0,1.
        NOTA: El paso 3.2.3 - 3.2.6 es opcional para aquellos que desean mejorar la precisión de la estimación de expresión nuevas transcripciones. Esto tomará un tiempo mucho más largo, ya que la cartografía y la construcción transcriptoma deben ser rONU más de una vez.
    3. Ejecute Tophat utilizando los parámetros por defecto y luego ejecutar las mancuernas a .gtf archivo generado con el comando en la figura S3E.
    4. Compare el archivo resultante .gtf al archivo .gtf genoma de referencia con el comando en la figura S3F.
    5. Analizar el archivo .tmap resultado como se describe en el paso 3.2.2.4. Copie y pegue el contenido del archivo a un archivo de Excel y manipular con la aplicación de hoja de cálculo. Las transcripciones con código de clase 'u' pueden ser considerados como 'novela' en comparación con la referencia .gtf archivo proporcionado.
    6. Después de la etapa 3.2.5, hay un archivo .combined.gtf en la carpeta que se puede utilizar como el archivo de .gtf referencia. Una segunda aplicación de Tophat y gemelos se puede realizar como se describe en el paso 3.2.1 y 3.2.2 para obtener una estimación más precisa de FPKM nuevas transcripciones.
  3. Detectar differentially expresó genes usando DESeq paquete de 30.
    1. La entrada de DESeq es una tabla de conteos de lectura cruda. Para obtener una tabla de este tipo, utilice el script htseq recuento distribuido con el paquete HTSeq Python que se puede descargar desde el sitio web HTSeq ( http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html ) .
      1. Asegúrese de que samtools, Python y programsare htseq recuento instalados en el sistema. Obtener los números de conteo de lectura primas de salida sombrero de copa con el comando en la figura S4A.
      2. Prepara 'Raw_Count_Table.txt', los archivos de los ExperimentDesign.txt 'utilizando Excel. Copiar y guardar el contenido en el formato .txt para el paquete DESeq R (Figura S4B).
      3. Instalar programa de I en el sistema. En la terminal, la voluntad appearas mensaje pantalla de tipo 'R' y pulse ENTER.A mostraron en la figura S4C.
      4. Leer 'Raw_Count_Table.txt ',' ExperimentDesign.txt 'en R utilizando el comando en la figura S4D.
      5. Cargar paquete DESeq usando el comando en la figura S4E.
      6. Condiciones factorizar en R (Figura S4F).
      7. Utilice el comando en la figura S4G para ejecutar la prueba binominal negativa sobre la mesa recuento normalizado.
      8. Utilice el comando en la figura S4H a genes expresados ​​salida diferencial significativo en un archivo .csv.
  4. Factores de transcripción de búsqueda '(TFS) a través de los valores FPKM muestras usando Excel. Intersección de table gen y mesa de TFS. Los genes pertenecen a ambas tabla se expresan diferencialmente factores de transcripción.
    1. Ir a la página web http://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.php y descargar los factores de transcripción. A continuación, las operaciones de búsqueda de los factores de transcripción DE en el Excel (< strong> Figura S5).
  5. Generación de archivo .bigwig para visualización UCSC genoma navegador.
    1. Descargar paquete de software 'bedtools' de la página web https://github.com/arq5x/bedtools2 e instalar el software en el sistema 31. Descargue las herramientas UCSC 'bedGraphToBigWig' de la página web http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ e instalar el software en el sistema.
    2. En la carpeta que contiene el archivo .bam, utilice el comando en la figura S6A para convertir archivos .bam generada por el sombrero de copa en el archivo .bed.
    3. Después se produce el archivo .bed, utilice el comando en la figura S6B para generar archivo .bigwig. El archivo 'ChromInfo.txt' se puede obtener del siguiente url:arget = "_blank"> http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz.
    4. Observar una pista personalizada en la UCSC Genoma del navegador. Consulte el sitio web http://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html sobre cómo mostrar una pista personalizada utilizando la UCSC genoma navegador.

figure-protocol-1
Figura S1: Convertir archivo .bcl a .fastq archivo usando el software de yuca.

figure-protocol-2
Figura S2: Mapeo lee para hacer referencia genoma usando Tophat.

figure-protocol-3 Figura S3: La detección de nuevas transcripciones y estimación del nivel de expresión.

figure-protocol-4
Figura S4: Llamando gen expresado diferencial usando DESeq paquete.

figure-protocol-5
Figura S5: Identificación de factores de transcripción expresados ​​diferencialmente.

figure-protocol-6
Figura S6: Conversión resultado de la asignación para la visualización de datos.

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Resultados

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Con el fin de analizar los genes expresados ​​diferencialmente en las células Lin-Lin-EML CD34- CD34 + y, se utilizó la tecnología de ARN-Seq. La figura 1 muestra el flujo de trabajo de los procedimientos. Después del aislamiento de células negativas de linaje por clasificación celular magnética, nos separamos células Lin-SCA-CD34 utilizando FACS Aria Lin-SCA + CD34 + y. Células enriquecidas EML-Lin se tiñeron con anti-CD34, anti-Sca1 y los anticuerpos de cóctel de linaje. Sólo las células Lin- fueron c...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptoma de mamíferos es muy compleja 34-38. Tecnología de ARN-Seq juega un papel cada vez más importante en los estudios de análisis de transcriptoma, novela detección transcripciones y solo nucleótido variación descubrimiento etc. Tiene muchas ventajas sobre otros métodos para el análisis de expresión de genes. Como se mencionó en la introducción, que supera los artefactos de hibridación de microarrays y se puede utilizar para identificar nuevas transcripciones de novo. Una lim...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JQW, SZ, SD y KC cuentan con el apoyo de una subvención de los Institutos Nacionales de Salud y el Fondo Staman Ogilvie—Fundación Memorial Hermann.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antibiótico-AntimicóticoInvitrogen15240-062Cultivo celular BHK
Anti-Mouse CD34 FITCeBioscience11-0341-81Clasificación FACS
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81Clasificación FACS
Cóctel de anticuerpos de linaje de ratón APC Clasificación558074FACSBD Biosciences
células BD FACSAriaBD BiosciencesOferta especial sistemade clasificación FACS Corning
™ Matraces Tratados para Cultivo Celular 75 cm2Corning incorporados430641Cell culture
Corning™ Matraces tratados con cultivo celular 25 cm2Corning incorporado430639Cultivo celular
Desoxirribonucleasa I, grado de amplificaciónInvitrogen18068-015Preparación de la biblioteca
DMEMInvitrogen11965-092Cultivo celular BHK
DPBSGibco14190Cultivo celular
HI FBSInvitrogen16140071Cultivo de células BHK
Suero de caballoInvitrogen16050-122Cultivo celular EML
IMDMHyCloneSH30228.02Cultivo celular EML
L-GlutaminaInvitrogen25030-081Cultivo celular
Kit de agotamiento de células de linaje, ratónMiltenyi Biotec130-090-858Aislamiento de células de linaje negativo
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de Clasificación de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
  2. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
  3. Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
  4. Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
  5. Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
  6. Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
  7. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
  8. Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
  9. Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361(2012).
  10. Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689(2013).
  11. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  12. Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
  13. Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
  14. Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6(2011).
  15. Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
  16. Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331(2012).
  17. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
  18. Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16(2010).
  19. Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106(2009).
  20. Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307(2013).
  21. Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
  22. Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567(2013).
  23. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
  24. Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
  25. Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
  26. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
  27. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  28. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
  29. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
  30. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106(2010).
  31. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  32. Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
  33. Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
  34. Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3(2008).
  35. Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
  36. Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
  37. Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
  38. Wu, J. Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).

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