Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Resumen

Se utilizaron análisis de ARN de secuenciación y bioinformática para identificar factores de transcripción expresados ​​diferencialmente significativamente y en subpoblaciones Lin-CD34 + y Lin-CD34 de ratón EMLcells. Estos factores de transcripción que podrían desempeñar un papel importante en la determinación del cambio entre las células Lin-CD34- auto-renovación de Lin-CD34 + y parcialmente diferenciado.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSC) se utilizan clínicamente para el tratamiento de trasplante para reconstruir el sistema hematopoyético de un paciente en muchas enfermedades tales como la leucemia y el linfoma. Dilucidar los mecanismos que controlan la auto-renovación y diferenciación de las HSC es importante para la aplicación de las CMH para la investigación y aplicaciones clínicas. Sin embargo, no es posible obtener gran cantidad de HSCs debido a su incapacidad de proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, se utilizó una línea celular derivada de la médula ósea de ratón, la EML (eritroide, mieloide y linfocítica) línea celular, como un sistema modelo para este estudio.

RNA-secuenciación (RNA-Seq) se ha utilizado cada vez más para sustituir microarray para estudios de expresión génica. Presentamos aquí un método detallado de la utilización de la tecnología de ARN-Seq para investigar los posibles factores clave en la regulación de las células EML auto-renovación y diferenciación. El protocolo previsto en el presente documento se divide en tres partes. El primer part explica cómo la cultura células EML y separada Lin-CD34 + y células Lin-CD34. La segunda parte del protocolo ofrece procedimientos detallados para la preparación de ARN total y de la construcción de la biblioteca para la posterior secuenciación de alto rendimiento. La última parte se describe el método para el análisis de datos de RNA-Seq y se explica cómo utilizar los datos para identificar los factores de transcripción expresados ​​diferencialmente entre las células Lin-Lin-CD34- CD34 + y. Se identificaron los factores de transcripción más significativamente expresadas diferencialmente a ser los potenciales reguladores clave que controlan las células EML auto-renovación y diferenciación. En la sección de discusión de este artículo, se destacan los pasos clave para el desempeño exitoso de este experimento.

En resumen, este trabajo ofrece un método de uso de la tecnología de ARN-Seq para identificar posibles reguladores de la auto-renovación y diferenciación en células EML. Los factores clave identificados se someten a análisis funcional de aguas abajo in vitro e in vivo.

Introducción

Las células madre hematopoyéticas son células sanguíneas raras que residen principalmente en el nicho de la médula ósea de adultos. Son responsables de la producción de células requeridas para reponer la sangre y los sistemas inmunitarios ^1. Como una especie de células madre, las CMH son capaces tanto de auto-renovación y diferenciación. Dilucidar los mecanismos que controlan la decisión destino de las HSC, ya sea hacia la auto-renovación o diferenciación, ofrecerá una valiosa orientación sobre la manipulación de las CMH para las investigaciones de enfermedades de la sangre y el uso clínico ^2. Uno de los problemas que enfrentan los investigadore....

Protocolo

Activada por fluorescencia 1. EML cultivo celular y separación de las células Lin-CD34 + y Lin-CD34- Uso de clasificación celular magnética Sistema y método de clasificación de la célula

1. Preparación de riñón de hámster bebé (BHK) medio de cultivo celular para la recogida de factor de células madre:
   1. Cultura células BHK en medio DMEM que contenía FBS al 10% en 25 cm ² frasco (Tabla 1) a 37 ° C, 5% de _CO2 en un incubador de cultivo celular.
   2. Cuando las células crecen a un 80 - 90% de confluencia, lavar las células una vez con 10 ml de PBS. Añadir 5 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a la monocapa ....

Resultados

Con el fin de analizar los genes expresados ​​diferencialmente en las células Lin-Lin-EML CD34- CD34 + y, se utilizó la tecnología de ARN-Seq. La figura 1 muestra el flujo de trabajo de los procedimientos. Después del aislamiento de células negativas de linaje por clasificación celular magnética, nos separamos células Lin-SCA-CD34 utilizando FACS Aria Lin-SCA + CD34 + y. Células enriquecidas EML-Lin se tiñeron con anti-CD34, anti-Sca1 y los anticuerpos de cóctel de linaje. Sólo las células Lin- fueron c.......

Discusión

Transcriptoma de mamíferos es muy compleja ^34-38. Tecnología de ARN-Seq juega un papel cada vez más importante en los estudios de análisis de transcriptoma, novela detección transcripciones y solo nucleótido variación descubrimiento etc. Tiene muchas ventajas sobre otros métodos para el análisis de expresión de genes. Como se mencionó en la introducción, que supera los artefactos de hibridación de microarrays y se puede utilizar para identificar nuevas transcripciones de novo. Una lim.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Antibiótico-Antimicótico	Invitrogen	15240-062	Cultivo celular BHK
Anti-Mouse CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	Clasificación FACS
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	Clasificación FACS
Cóctel de anticuerpos de linaje de ratón APC Clasificación	558074	FACS	BD Biosciences
células BD FACSAria	BD Biosciences	Oferta especial sistema	de clasificación FACS Corning
™ Matraces Tratados para Cultivo Celular 75 cm2	Corning incorporados	430641	Cell culture
Corning™ Matraces tratados con cultivo celular 25 cm2	Corning incorporado	430639	Cultivo celular
Desoxirribonucleasa I, grado de amplificación	Invitrogen	18068-015	Preparación de la biblioteca
DMEM	Invitrogen	11965-092	Cultivo celular BHK
DPBS	Gibco	14190	Cultivo celular
HI FBS	Invitrogen	16140071	Cultivo de células BHK
Suero de caballo	Invitrogen	16050-122	Cultivo celular EML
IMDM	HyClone	SH30228.02	Cultivo celular EML
L-Glutamina	Invitrogen	25030-081	Cultivo celular
Kit de agotamiento de células de linaje, ratón	Miltenyi Biotec	130-090-858	Aislamiento de células de linaje negativo
Espectrofotómetro NanoVue Plus	GE Healthcare	28-9569-62 Control de	calidad
Thermo Scientific™ Napco&comercio; 8000 Incubadoras de CO2	con camisa de agua Thermo Scientific	15-497-002	Cultivo celular
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140-122	EML cultivo celular
TRIzol® Reactivo	Invitrogen	15596-018	ARN exracción
TruSeq™ Kit de preparación de muestras de ARN v2 -Set B (48 rxn)	Illumina	RS-122-2002	Preparación de la biblioteca
2100 Electroforesis Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939AA	Control de calidad
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200	Cultivo celular
0,45 y micro; m Filtros de jeringa	Nalgene	190-2545	Cultivo celular

de Clasificación de