Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Resumen

El estudio de los primeros eventos de la progresión de células preneoplásicas y la interacción célula inmune innata es fundamental para entender y tratar el cáncer. Aquí se describe un método para inducir condicionalmente transformaciones de células epiteliales y la formación de imágenes en directo posterior de la interacción de células inmune innato con HRAS ^G12V expresando células de la piel en las larvas de pez cebra.

Resumen

Aquí describimos un método para inducir condicionalmente la transformación de las células epiteliales mediante el uso^{del sistema de} expresión 1 KalTA4-ER^T2/UAS inducible inducible por 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT) en larvas de pez cebra, y la posterior obtención de imágenes en vivo de la interacción de las células inmunitarias innatas con las células de la piel que expresan HRAS^G12V. El sistema KalTA4-ER^T2/UAS es tanto inducible como reversible, lo que nos permite inducir la transformación celular con una resolución temporal/espacial precisa in vivo. Esto nos brinda una oportunidad única de obtener una imagen en vivo de cómo las células preneoplásicas individuales interactúan con los tejidos del huésped tan pronto como emergen, y luego seguir su progresión y regresión. Estudios recientes en larvas de pez cebra han demostrado una función trófica de la inmunidad innata en las etapas más tempranas de la tumorigénesis^2,3. Nuestro sistema inducible nos permitiría obtener una imagen en vivo del inicio de la transformación celular y la posterior respuesta del huésped, lo que puede conducir a importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes para la regulación de las respuestas inflamatorias tróficas oncogénicas. También discutimos cómo se podría adaptar nuestro protocolo para lograr el control temporal y espacial de la expresión génica ectópica en cualquier tejido de interés.

Introducción

El crecimiento excesivo de una progenie de células preneoplásicas dentro de una hoja epitelial de otro modo normal depende en gran medida de una interacción con su microambiente. La interacción con su tejido del huésped es probable que sea el principal determinante de si una célula preneoplásicas es capaz de establecer un nicho clonal para seguir desarrollando en un cáncer completo soplado. A pesar de su importancia en el desarrollo, esta fase inicial de la progresión del cáncer es inaccesible en sistemas modelo más comúnmente utilizados, in vivo.

El pez cebra, Danio rerio, es un organismo modelo bien establecido para los estudios de imagen en vivo debido a su transparencia durante todo el desarrollo, la posibilidad de que la manipulación genética y la accesibilidad de los medicamentos solubles en agua. Estudios recientes utilizando un modelo de larvas de pez cebra, que sobreexpresan el oncogén humano HRAS ^G12V para transformar las células epiteliales, mostraron que la célula huésped señales de deriva, en particular, H ₂ O _{2 originan}el reclutamiento de células inmunes innatas. Curiosamente, los reclutados células inmunes, neutrófilos y macrófagos, se demostrado tener un papel trófico en el apoyo a la proliferación de células preneoplásicas ^2,3.

Con el fin de entender los eventos tempranos de la iniciación y progresión del tumor, así como la contribución de una respuesta inflamatoria, uno tiene que ser capaz de imagen estos eventos desde el punto de tiempo más temprano en adelante. Por lo tanto, es necesario controlar las transformaciones de células de una manera específica temporal y de tejido. Utilizamos el sistema / UAS Gal4 que ha sido adaptado con éxito a partir de Drosophila ⁴ para expresar condicionalmente el oncogén humano HRAS ^G12V bajo el control del promotor específico de la piel queratina 4 (krt4) ^5. La versión modificada del activador transcripcional Gal4, a saber KalTA4 ^6, permite la expresión de HRAS ^G12V bajo el control de la secuencia de activación aguas arriba (UAS). Para inducir la expresión condicional activador transcripcional, KalTA4 se ha fusionado con el dominio de unión a ligando mutante de los α del receptor de estrógenos humanos (ER ^{T2) 7} que se une específicamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) ^1. A falta de 4-OHT la ER ^T2 está ligada en el citoplasma de las proteínas de choque térmico. Tras 4-OHT la unión del choque térmico se disocian proteínas, lo que permite una translocación nuclear de KalTA4-ER ^T2 y la activación subsiguiente de los UAS gen de interés controladas ⁸ (Figura 1C, b). Como este sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT, la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible. En contraste con el / Lox sistema Cre-ER ^T2, lo que conduce a un evento de recombinación irreversible, la inducción de la activación transcripcional por KalTA4-ER ^T2 es reversible mediante la adición o eliminación de 4-OHT.

El siguiente protocolo allo ws una transformación condicional de células de la piel en las larvas de pez cebra y un posterior seguimiento de la interacción con las células inmunes innatas de expresión de la proteína fluorescente. Las metodologías básicas empleadas en este protocolo son similares a algunas de las técnicas de uso común dentro de la comunidad de pez cebra ^9-13.

La generación y el uso combinatoria de líneas transgénicas junto con la microinyección de construcciones transgénicas permite un enfoque transitoria sólo para transformar células individuales en forma de mosaico. La permeabilidad al oxígeno de la piel del pez cebra embrionario y larval plantea la posibilidad de time-lapse estudios de imagen en vivo de alta resolución de la microscopía de horas a días. Por otra parte, su accesibilidad a las drogas solubles en agua permitirá que los futuros estudios mecanicistas y el seguimiento de los eventos biológicos de células in vivo que podrían conducir a una mejor comprensión de las etapas más tempranas del desarrollo del cáncer.

_content "> Este protocolo puede ser adaptado para realizar la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos distintos de piel microscopio.

Protocolo

Los siguientes procedimientos experimentales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Ley de 1986 Animales (Procedimientos Científicos).

1. Preparación de ADN de plásmido para la microinyección

1. Se purifica el plásmido pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP con un kit de purificación de ADN plasmídico comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante y diluir el ADN del plásmido a una concentración de la solución madre final de 100 ng / l.
2. Linealizar la transposasa contiene pT3TS plásmido / Tol2 ¹⁴ por digestión de restricción BamHI, siguiendo el protocolo del fabricante. Este paso se puede extender durante la noche. Precipitar el ADN linealizado por una extracción con fenol / cloroformo, siguiendo el protocolo estándar.
3. In vitro transcribir el ARNm transposasa a partir del plásmido linealizado con un kit de transcripción comercial para grandes cantidades de ARN tapado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para diluir y alícuotauna concentración de solución madre final de 100 ng / l en agua libre de nucleasa. Asegurar la calidad de la ARN purificado con un nativo 1-2% TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) electroforesis en gel de agarosa (80-120 V). Guarde el ARN a -80 ° C.

2. La microinyección de ADN plásmido de la expresión génica transitoria

1. Preparar una placa de agarosa inyección para sostener los huevos fertilizados durante la inyección. Verter el líquido 3% de agarosa en una placa de Petri de 90 mm. Deje enfriar la agarosa a 40-50 ° C y añadir el molde microinyección en forma de cuña TU-1 en la parte superior de la agarosa líquida. Después del endurecimiento a temperatura ambiente, dejar que el resto de agarosa a 4 ° C durante 30 min antes de retirar el molde. Moldes de microinyección Almacenar a 4 ° C y la reutilización.
2. Preparar una parte alícuota de la solución inyectable. Realice los siguientes pasos en el hielo. Pipetear 1 l de ADN de plásmido (concentración final de 10 ng / l), 2 l de ARNm transposasa (concentración final de 20 ng / l), 2l de 10 mg / l de rodamina B isotiocianato-dextrano, 2 l de solución de 5x Danieau (NaCl 290 mM, KCl 3,5 mM, 2 mM MgSO _4, 3 mM Ca (NO _{3) 2,} 25 mM de HEPES, pH 7,6) a una volumen final de 10 l de agua libre de nucleasa.
3. Preparar las agujas de los capilares de vidrio de borosilicato de 1 mm de diámetro que contienen un filamento interior tirando del capilar en direcciones opuestas con una micropipeta extractor. Utilice el siguiente programa: calentar 530, tire 200, la velocidad y el tiempo de 80 a 150.
4. Rellena una aguja con 2 l de la solución de inyección (conservado en hielo). Evitar las burbujas retirando cuidadosamente la punta microloader mientras que la liberación de la solución en el capilar. Romper cuidadosamente la punta de la aguja con un fórceps.
5. Regular el tamaño de la gota con una bomba neumática pico. Mida el diámetro de la gota / volumen (V = 4/3 πr ³⁾ y ajustar el tamaño de la gota con un micrómetro ocular en un estereoscopio en dimetilpolisiloxano. Recomendamos100 micras, correspondiente a 0,5 nl. Esto asegura concentraciones uniformes y reproducibles por cada embrión inyectado. Valorar la concentración inyectada y ajustar para cada preparación y construcción del plásmido.
6. Coloque los cigotos (Figura 1A) obtenidos a partir de una cruz de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 ¹⁵ con Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg ¹⁶ en los moldes de la placa de inyección por el uso de un pastette 3 ml. Mientras tanto, mantener la punta de la aguja de inyección pre preparado en dimetilpolisiloxano para evitar la solución de la desecación y coagulación.
7. Inyectar la caída previamente medida (100 micras correspondiente a 0,5 nl) bajo un estereoscopio a través del corion en el blastodisco ^17, antes de la primera escisión (Figura 1A). La inyección en la fase de una célula aumenta el potencial de una distribución uniforme de la plásmido de ADN y ARN en la masa celular en desarrollo y la posibilidad de transmisión de la línea germinal. Esnotable que la expresión de las construcciones más a menudo tiende a ser de mosaico.

3. condicional transformación celular de la piel por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT)

1. La transferencia de los embriones inyectados en solución 0.3x Danieau y mantenerlos a 28,5 ° C en una incubadora. Retire los huevos no fecundados desde el plato en la esfera etapa ^17. La co-inyección de rodamina B isotiocianato-dextrano se puede utilizar como un control de la inyección en un estereoscopio fluorescente.
2. Embriones de pantalla en 24 HPF (post fertilización hr) para la expresión cardiaca de eGFP. Seguir aumentando CMLC: eGFP embriones de pez cebra positivos hasta 72 HPF. Es importante vigilar cuidadosamente la calidad del agua (0.3x Danieau).
3. Retire el corion de aquellos embriones que no han eclosionado con pinzas a 72 HPF. Empujar con cuidado el corion con 1 pinza y tire de ella aparte utilizando el otro. Seleccionar embriones para lysC: expresión DsRed2 utilizando un estereoscopio fluorescente.
4. Añadir 10 l de una 10 mMStock de (Z) -4-hidroxitamoxifeno a 20 ml de solución de 0.3x Danieau (concentración final de 5 mM). Utilice la inducción solución de 4-OHT para una placa de Petri estándar (90 mm) en un lote de 40-60 embriones.
5. La transferencia de los embriones en una nueva placa de Petri que contiene 20 ml de inducción solución recién hecha. 4-OHT tiene que ser almacenado y manipulado en la oscuridad. Los primeros signos de expresión se pueden detectar 2 hr inicio después de la inducción. La inducción a paso se puede extender durante la noche, teniendo en cuenta que la célula huésped inicial: las interacciones de células preneoplásicas ya puede ocurrir unas pocas horas después del tratamiento.

4. Montaje e imágenes en vivo del pez cebra larvas

1. Preparar una placa de Petri de 60 mm mediante la introducción de un agujero con un diámetro de 18-20 mm. Utilice grasa de silicona de alto vacío para cubrir y sellar el agujero en la parte inferior exterior de la placa de Petri con una tapa de vidrio 25 mm (Figura 1B).
2. Preparar 1% de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa. Mantenga un tubo de 1,5 mlde LMP agarosa a 37 ° C en un calentador.
3. Preselección Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) larvas de verde fluorescente de células de piel y positivo innato de expresión de células inmunes DsRed2, en un estereoscopio fluorescente. Anestesie larvas por la adición de 1 ml de 0,4% tricaína ¹⁸ a la solución de inducción 20 ml.
4. Transferencia de las larvas preseleccionado con un pastette en la agarosa LMP líquido. Deje que las larvas se hunden en la LMP agarosa y transferirlos a la cubierta de vidrio (Figura 1B). Orientar los embriones en un estereoscopio. Las larvas tienen que ser colocados directamente sobre el cristal para reducir la distancia de trabajo (hasta 6 larvas).
5. Cubra la agarosa LMP con el tricaína que contiene la solución de inducción después de que se haya endurecido (Figura 1B flecha).
6. Image las larvas incrustado utilizando un fluorescente invertida, de escaneo láser o disco giratorio microscopio confocal. Use un 40X o 63Xobjetivo como objetivos con distancias largas jornadas de trabajo habilitación centrándose toda la larva.

Resultados

Los cigotos de un cruce entre Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 y Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg se recogieron 10 a 15 min después de la fertilización (Figura 1) para obtener 1 embriones en fase celular. Después de la inyección los embriones fueron criados hasta 3 dpf, antes de la inducción con 4-OHT y el montaje de imágenes en vivo (Figura 1B). 2-6 h después de la inducción de los embriones montados fueron, bien bajo un microscopio de fluorescencia invertida (Figura 2A) o un microscopio invertido confocal (Figura 2B-C) y la imagen durante 2-3 horas con intervalos de 1,5 min. Las células superficiales de la piel preneoplásicas pueden ser identificados por su morfología más redondeada en comparación con los queratinocitos normales, así como la emisión fluorescente verde de la membrana localizada eGFP-HRAS ^G12V. Áreas de formación de imágenes se seleccionaron para la co-localización de células de la piel preneoplásicas y las células inmunitarias innatas (Figura 2A punta de flecha). Debido a la rápida migproceso ración de los neutrófilos se eligieron los intervalos de lapso de tiempo para estar entre 1-1,5 min con tamaños de paso Z pila de 0,7 a 1,7 micras para obtener proyecciones de máxima intensidad (Figura 2, Video 1). Hay una amplia gama de comportamientos que se pueden observar mientras que las imágenes en directo: los neutrófilos migran al lado y debajo de las células preneoplásicas (Figura 2C, Video 1), forman contactos directos a las células (Figura 2 B y C), retire los restos de células preneoplásicas que se someten a apoptosis (Video 1), o activamente engullen partes de las células preneoplásicas (no mostrados). Para capturar el espectro completo de las interacciones, es recomendable seguir sus comportamientos por imágenes en vivo de lapso de tiempo.

Figura 1: Esquema para la transformación de células de piel condicional en larvas de pez cebra. (A) Una imagen de un cigoto de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; LysC: DsRed2) pez cebra a los 10 minutos después de la fertilización (MPF). El óvulo fertilizado se encuentra rodeado por el corion (punta de flecha). El sitio para la inyección es el blastodisco (asterisco), formado por corrientes citoplasmáticas de la yema (flecha) que define el polo animal del embrión. (B) Montaje de las larvas de pez cebra. 60 mm placa de Petri con un orificio de 18-20 mm (punta de flecha) que está sellado por una cubierta de vidrio 25 mm. Las larvas de pez cebra se inmovilizan y se monta en la cubierta de vidrio en un 1% de agarosa LMP. Solución 0.3x Danieau (flecha) que contiene 5 mM 4-OHT se utiliza para cubrir la agarosa LMP. (C) 4-OHT transformaciones de las células superficiales de la piel. (A) del perfil en sección transversal esquemática de la piel de las larvas inducida. La piel embrionario y larval se compone de dos capas de células epiteliales, una capa celular superficial y una capa de células basales de los queratinocitos que están conectados a la membrana basal subyacente (BM). (B) La expresión transitoria del sistema to inducir un clon de células preneoplásicas entre las células superficiales de la piel. KalTA4-ER ^T2 se expresa exclusivamente en la capa más externa de la piel dirigido por el promotor krt4 (amarillo). Mosaico de expresión KalTA4-ER ^T2 activa UAS controlada (azul) eGFP-HRAS expresión ^G12V en las células superficiales, dando lugar a un clon de células preneoplásicas (verde). (D) Esquema del sistema de expresión transitoria. (A) de la casete Tol2 pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: vector de expresión eGFP utilizado transitoriamente (b) la inducción de la expresión condicional activador transcripcional.. KalTA4 se fusiona con el dominio de unión a ligando mutante del receptor α estrógeno humano (ER ^T2) que se une específicamente 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). A falta de 4-OHT la ER ^T2 está ligada en el citoplasma de las proteínas de choque térmico (Hsp90). A 4-OHT vinculante Hsp90 se disocia, lo que permite una translocación nuclear de KalTA4-ER^T2 y la posterior activación de los UAS controlados expresión eGFP-HRAS ^G12V. Barra de escala A = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 2: Imágenes en vivo de la interacción de las células inmunitarias preneoplásica e innata. (AC) Imágenes de un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embrión, que ha sido inyectado con pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP y ARNm transposasa en una etapa celular. Las imágenes fueron tomadas después de 6 horas de 4-OHT inducción (A) Vista lateral de la región tailfin a las 6 horas después del tratamiento, mostrando manchas de eGFP-HRAS ^G12V que expresan las células de la piel (flecha), y lysC:. DsRed2 + neutrófilos (punta de flecha). (AC) Imágenes representativas taken de una película time-lapse confocal, mostrando neutrófilos (rojo) las interacciones con células de la piel eGFP-HRAS ^G12V expresan (verde). (B) Una célula preneoplásica forma una extensión filopodial corto con el recuento de neutrófilos en contacto (punta de flecha). (C) Los neutrófilos (rojo) está en estrecho contacto con un clon de células de la piel preneoplásicas (verde). La barra de escala en A = 100 m; B / C = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Video 1 : Time-lapse de imágenes en vivo de la interacción de las células inmunitarias preneoplásica e innata. Time-lapse de un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V; lysC: DsRed2) embriones, inyectado con pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP y ARNm transposasa en una etapa de células. Confocal fotografía de intervalo 6-9 hours después de 4-OHT inducción mostrando lysC: DsRed2 + neutrófilos (rojo) las interacciones con células de la piel eGFP-HRAS ^G12V expresan (verde). Los neutrófilos migran al lado y debajo de las células preneoplásicas y eliminar los restos de una célula preneoplásicas que sufre apoptosis. Intervalos de Time-lapse de 1,5 min durante 3 horas con tamaños de paso Z pila de 1,3 micras.

Discusión

Durante la embriogénesis y el desarrollo de las larvas, la piel embriones de pez cebra se compone de dos capas epiteliales, la capa superficial llamada peridermis y una capa de queratinocitos basales que están unidos a la membrana basal subyacente ¹⁹ (Figura 1C, a). El protocolo que se presenta aquí describe un método directo para inducir condicionalmente transformación de células preneoplásicas en la capa superficial de la piel de las larvas de pez cebra, y permite el análisis de la interacción posterior con células inmunes innatas por imágenes en vivo. Las metodologías básicas en nuestro protocolo siguen las técnicas de pez cebra bien establecidos ^9-13, y el protocolo se pueden adaptar y modificar fácilmente.

El promotor krt4 ⁵ utilizado aquí impulsa KalTA4-ER expresión ^T2 específicamente en la capa más externa de la piel (Figura 1C, b). Sin embargo, el modular MultiSite pasarelaestrategia de clonación, utilizado para generar la krt4: KalTA4-ER ^T2 constructo (Figura 1D, a), ofrece la posibilidad de clonar cualquier promotor de interés en frente de KalTA4-ER ^T2 en una sola etapa de clonación. Una adaptación del método presentado en el presente documento tanto, es posible para la mayoría de los tejidos durante la embriogénesis y estadios larvarios. La disponibilidad de secuencias de promotor es por la presente el factor limitante. Además, casi cualquier gen de interés clonado detrás de una UAS puede ser sobreexpresada condicionalmente en diferentes etapas de desarrollo mediante el uso de la expresión KalTA4-ER ^T2 espacial y temporalmente controlada. Por lo tanto, nuestro protocolo se puede adaptar para llevar a cabo la expresión génica condicional en cualquier tejido de interés en larvas de pez cebra, en una forma de mosaico. También se puede optimizar la configuración para vivir imagen tejidos más profundos tales como el hígado o el páncreas microscopio.

Hemos descrito una aplicación que utiliza el protocolo de élRe, de manera similar, se puede sobreexpresan otros moduladores de la inflamación usando este protocolo para el estudio de la regulación de las respuestas inflamatorias, como se puede neutrófilos imagen fácilmente en directo y los cambios de comportamiento de los macrófagos después de la inducción y la detención en la expresión de un modulador inflamatoria candidato. Además, el protocolo adaptado también sería beneficioso para aquellos que quieren rastrear el movimiento celular y el cambio de comportamiento durante las diferentes etapas de la morfogénesis de tejidos y la formación de órganos y, finalmente, la imagen en vivo de la interacción de células inmunes innatas interacciones con otros linajes celulares específicos que se pueden orientar por el sistema de expresión ^T2 / UAS KalTA4-ER inducible.

Se utilizó el vector pDestTol2CG del Tol2kit pez cebra ^20-23 que contiene una cmlc2: eGFP-pA casete (Figura 1D, a) que permite la posterior selección de embriones por verdes fluorescentes corazones positivos como semarcador lección ²⁰ que simplifica el proceso de selección F0. Una inserción estable del gen de transposón flanqueado de interés en el genoma se ve facilitada por co-inyección del ADN plásmido junto con ARNm transposasa. La preparación de plásmido de ADN y el ARNm transposasa para la microinyección sigue protocolos estándar. Sin embargo, una integración exitosa de la construcción en el genoma depende de la transposición a base de Tol2 ^14. Esto pone de relieve la especial atención que se pagará a trabajar en el hielo en condiciones estériles para evitar contaminaciones y degradaciones por RNasas y DNasas. La microinyección en embriones de fase de una célula es una técnica sólida y bien establecida para la ganancia y la pérdida de los estudios de función en ^9,10 pez cebra. Aunque una persona bien entrenada puede inyectar fácilmente en la yema de más de 1.000 embriones en 1 h, la inyección en el blastodisco (Figura 1A, asterisco) requiere más experiencia y formación. Crítico durante este procedimiento is el manejo de las agujas. La aguja tiene que ser muy delgada para penetrar en la célula sin daño y por lo tanto tiene que ser roto sólo de su punta. Es importante para controlar y medir regularmente el tamaño de la gota durante la inyección para garantizar una inyección uniforme en cada embrión. Cuidadosamente manipula, la aguja se puede utilizar para girar el embrión. Esto es a menudo necesaria para encontrar el blastodisco y el ángulo óptimo de penetración.

La concentración de ADN y ARNm transposasa usada para la inyección es casi seguro que influye en la eficacia de la expresión. Dosis más altas pueden conducir a un aumento de la proporción de células que expresan el transgén pero con mayores concentraciones de ADN (> 50 ng / l) y transposasa mRNA (> 100 ng / l) también se plantea la posibilidad de efectos tóxicos entre los embriones inyectados. Estamos a favor de la utilización de 10 ng / l de ADN y 20 ng / l transposasa mRNA para inyección, que corresponde a 50 pg de ADN de plásmido y 100 pg de ARN por emb inyectadoryo. 100% de los embriones inyectados con estas concentraciones se desarrollan normalmente, y entre 40-70% muestran eGFP-HRAS expresión ^G12V, después de 4-OHT inducción, dependiendo de la eficacia de la inyección en la celda individual. Entre embriones positivos que normalmente encontramos aproximadamente el 30% que tiene 1-10 clones, el 40% que tiene 10 a 50 clones y el 30% tiene más de 50 clones. Debido a nuestros objetivos de investigación, estamos a favor de la utilización de embriones con menos clones que expresan eGFP-HRAS ^G12V. Seleccionamos los embriones con 10-50 clones para nuestros experimentos transitorios. Para la generación de los peces fundador transgénico, se recomienda sólo para seleccionar embriones con tanto el marcador cardíaco positivo eGFP y un gran número de clones eGFP-HRAS ^G12V positivos en sus epidermis.

(Z) -4-hidroxitamoxifeno sufre un cis-trans (EZ) interconversión cuando se expone a la luz ^24. Se encontró que el isómero cis (E) es 100 veces menos anti-estrogénica que su contraparte trans ^25,26. Exposure a la luz, por lo tanto tiene que ser evitado. La solución madre de 4-OHT disuelto en etanol se puede almacenar a -20 ° C en la oscuridad durante un largo período de tiempo. Se recomienda el uso de una caja para proteger las placas de Petri de la luz durante la inducción de genes diana dentro de la incubadora y el transporte. Aunque el área de la imagen es muy pequeña y la exposición de 4-OHT a la luz UV se reduce a un mínimo, un intercambio constante de solución de inducción cada 2 horas mientras se recomienda de formación de imágenes durante períodos de tiempo más largos para mantener los niveles máximos de expresión. 4-OHT permeabiliza eficazmente a través del corion y las capas más externas de la piel durante la embriogénesis pez cebra, por lo tanto puede inducir la expresión de genes muy rápidamente. Podemos observar fácilmente emisión eGFP después de 2 horas de la inducción y se ha informado de que los primeros signos de la expresión de genes diana pueden ser observados después de 1 hora y la meseta después de 3 horas de tratamiento ^8. Las diferencias pueden deberse a la diferente promotor usado en nuestro estudio. Como ha sido previously informó que el 4-OHT tratamiento depende de la dosis ^8,27, se optó por utilizar la concentración más alto reportado de 5 M a alcanzar los niveles de expresión robustas y reproducibles en nuestro enfoque transitorio. Esto debería garantizar que todas las células que llevan el transgén se inducir la expresión del gen diana.

Tiene que tenerse en cuenta que el enfoque que aquí se presenta transitoria podría dar lugar a diferentes niveles de expresión debido a la posibilidad de múltiples y aleatorias eventos de inserción del genoma. Además, el uso del ARNm transposasa en el fondo transgénico Tol2 de Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 puede conducir a posibles transposiciones del transgén UAS que podría resultar en el silenciamiento de genes o interrupción. Sin embargo, como el método presentado aquí representa un enfoque transitoria, la pre-selección de embriones posteriores a la inyección es obligatorio. Muchos laboratorios han encontrado que las secuencias UAS tienden a ser silenciado en la descendencia transgénica, por lo tanto, enproyecta la pTol2-krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: eGFP construir en Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 embriones podría no ser tan eficaz como la inyección de un UAS construir en Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2; cmlc2: GFP ), los embriones. El uso de la línea transgénica estable Tg (krt4: KalTA4-ER ^T2) cruzó con Tg (UAS: eGFP-HRAS ^G12V) io006 permitirá un seguimiento preciso de los / apagado en la cinética de la época-dosis activación de genes 4-OHT dependiente .

Un paso crítico durante el montaje de las larvas es la transferencia en la agarosa LMP y sobre la cubierta de vidrio (Figura 1B). Hay solamente un marco de tiempo corto para la temperatura de agarosa LMP líquido que permite una transferencia segura y la orientación de las larvas preseleccionado sin dañar a los peces por cualquiera de choque térmico o endurecimiento del gel. Las larvas debe orientarse directamente sobre la cubierta de vidrio para reducir la distancia de trabajo para el Analy microscópica posteriorsis. Como esto puede ser un factor limitante durante la microscopía de la elección de los objetivos adecuados es obligatorio. Una vez montada, la larva se puede mantener desde horas hasta días.

La condicionalidad del sistema modelo que se presenta en este documento permite la transformación repetida por la activación de 4-OHT del transgén. El sistema de expresión depende de la presencia de 4-OHT y por lo tanto la expresión KalTA4 controlada de un gen de interés es reversible (Figura 1D, b). En contraste con el / Lox sistema Cre-ER ^T2, lo que facilita un evento de recombinación genómica irreversible ^28, KalTA4-ER ^T2 / UAS puede ser activado y desactivado después de la adición o eliminación de 4-OHT y este potencial para la inducción repetida es una ventaja de la técnica sobre el sistema de ^T2 / Lox Cre-ER. Sin embargo, el requisito de niveles constantes de 4-OHT es una limitación si el experimento tiene que ser prolongado de días a semanas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(Z)-4-Hidroxitamoxifeno	Sigma Aldrich	H7904	diluido en etanol y almacenado en la oscuridad a -20  ° C
20X Objetivo	Zeiss		20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X Objetivo	Zeiss		40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X Objetivo	Zeiss		63X/1.4 Aceite Ph3 ∞/0.17
BamHI	New England Biolabs	R0136S
Microscopio Confocal	Zeiss		LSM 510 META
Cubierta vidrio	VWR	631-0171	Diámetro 25 mm
Dimetilpolisiloxano	Sigma Aldrich	DMPSV
Dow Corning grasa de silicona de alto vacío	Sigma Aldrich	MKBL4135V
Tirador de micropipetas P-97 Flaming/Brown	Sutter Instruments Co.	Programa P-97	: calor 530, tirón 200, velocidad 80 y tiempo 150
Estereoscopio fluorescente	Leica		M205 FA
Kwik-Fill Capilares de vidrio de brosilicato World	Precision Instruments	1B100F-4
Molde de microinyección TU-1	Herramientas de ciencia adaptativa	TU-1
Punta de microcargador	Eppendorf
	Zeiss		Axiovert 200
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1348
Agua sin nucleasa	Invitrogen	AM9937
Pico bomba neumática	World Precision Instruments	PV820
Pico bomba neumática	Warner Instruments	PLI-90A
pTol2-krt4: KalTA4-ERT2; cmlc2:eGFP			Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/Universidad de Edimburgo
QIAprep Spin Miniprep Kit	Quiagen	27106
Rhodamina B isotiocianato-Dextrano	Sigma Aldrich	R8881	10 mg/μ l en el agua
Estereoscopio	Leica		M80
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg			BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006			PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaína/MS-222	Sigma Aldrich	A5040
Agarosa UltraPura	Invitrogen	16500-100
Agarosa UltraPura de Bajo Punto de Fusión	Invitrogen	16520-050
UltraPure Phenol : Cloroformo : Alcohol isoamílico	Invitrogen	15593-031	25:24:1, v/v